Summary
우리는 관절 연골 결손에 이전의 이식 연골의 BioComposite을 일축 또는 이축 기계적 변형을 적용 할 수 있습니다 소설 기계적 하중 생물 반응기를 설계했습니다.
Abstract
우리는 이식을 위해 제작 된 조직 공학적 바이오 복합 재료를 일축 또는 이축 기계적 변형을 적용 할 수있는 로딩 장치를 설계했다. 장치가 주로 네이티브 기계 계통을 모방 생물 반응기로서 기능하지만, 그것은 또한 포스 피드백 또는 구조의 기계적 테스트를 제공하는로드 셀이 장착되어 있습니다. 장치 과목 로딩 용량의 큰 정밀도 (진폭과 주파수)과 축이 둘있는 기계적 부하에 연골 구조를 설계하고 표준 조직 문화 인큐베이터 안에 들어갈 정도로 컴팩트합니다. 그것은 바로 조직 배양 플레이트에 샘플을로드하고 여러 플레이트 크기는 시스템과 호환됩니다. 이 장치는 정밀 유도 레이저 응용 프로그램에 대한 제작 구성 요소를 사용하여 설계되었습니다. 이중 축 방향 하중은 두 개의 직교 단계로 이루어집니다. 단계 50 밀리미터 이동 범위를 가지고 스테퍼 모터 액츄에이터에 의해 독립적으로 구동에 의해 제어50nm 이하의 스텝 크기를 가능 마이크로 스테핑 기능을 특징으로하는 폐 루프 스텝 모터 드라이버. 폴리 설폰 로딩 플래 튼은 이중 축 이동 플랫폼에 결합된다. 단계의 움직임은 철저히 실험실 고급 위치 정보 기술 (APT) 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 스테퍼 모터 드라이버는 주파수 및 전단 독립적으로 동시에 압축을 모두 진폭의 하중 매개 변수를 조정하는 소프트웨어와 함께 사용됩니다. 위치 피드백은 여행의 전체 50mm 이상 이하 3 ㎛의 위치 정확도로 번역, 0.1 ㎛의 양방향 반복성과 20 나노 미터의 해상도가 선형 광 인코더에 의해 제공됩니다. 이 인코더는 진정한 나노 포지셔닝 기능을 보장하기 위해 드라이브 전자 장치에 필요한 위치 피드백을 제공합니다. 감지하는 힘 피드백이로드 반응을 연락하고 평가할 제공하기 위해, 정밀 소형 로드셀 하중 플래 튼 나아 갔다 사이에 위치G 플랫폼입니다. 로드 셀은 0.15 %로 0.25 % 풀 스케일의 높은 정확도를 가지고 있습니다.
Introduction
우리는 이식을 위해 제작 된 조직 공학적 바이오 복합 재료를 일축 또는 이축 기계적 변형을 적용 할 수있는로드 생물 반응기를 설계했습니다. 이 장치는 주로 관절 연골을위한 설계 교체를위한 생물 반응기로 설계, 그것은 또한 인간의 신체의 다른 하중 조직에 사용될 수 있습니다. 이 생물 반응기 디자인에있는 우리의 동기는 운동의 부재로 인해 마비 병아리 배아 관절 연골의 비정상적인 형성의 정액 관찰 한 Drachman 및 Sokoloff 1에서 유래한다. 마찬가지로 운동은 정상 근육과 뼈의 개발에 필수적이다. 이 개념을 유지, 많은 연구 그룹은 체외 재배시 물리적 자극의 방법을 다른 모드를 조사 한 것은 세포 생체 재료 바이오 복합 재료 및 조직 절편 2-7의 생화학 적 및 기계적 성질을 조절한다. 기능 조직 공학의 개념조직의 기능적 특성을 향상시키기 위해 기계적 자극의 체외 사용을 포함, 조직 생체 스트레스에서 예상을 견딜 8,9를 변형 할 수있는 기계적 특성을 즉. 많은 연구 관절 조인트 설계 연골 구조를 자극하는 전단 및 압축의 측면에서 사용 기계적 부하를보고합니다. Mauck 등. 10 만 기계적 하중도 중요한 고려 성장 인자의 부재에서 중간 엽 줄기 세포의 연골을 유도 할 수 있습니다하는 것이 좋습니다. 이러한 조직 배양시 압축이나 전단 등의 간헐적 인 기계적 하중의 응용 프로그램이 연골과 뼈 형성을 조절하기 위해 표시되었습니다, 그러나 부하의 최적 선량은 세포와 조직 속성을 11으로 다릅니다.
관절 연골의 가장 중요한 기능은 내 압축 및 전단 힘을 견딜 수있는 능력입니다관절, 따라서 높은 압축 및 전단 탄성 계수를 가지고있다. 설계 연골의 기능을 기계적 강도와 생리 학적 미세 구조의 부족은 생체 내에서 신 연골의 파괴 및 관절 연골의 교체 전략의 실패로 귀착되었다. 압축 및 전단은 일반적으로 조절하고 관절 연골 바이오 복합 재료의 기계적 강도를 개선하기 위해 입증되어 있지만, 조합 방식은 드문 6,12-15입니다. Wartella 웨인 16 반월 상 연골 교체를 생산하는 긴장과 압축을 적용 생물 반응기를 설계했습니다. 왈드 등. 15 다공성 칼슘 인산염 기판에서 배양 연골 세포로 압축 및 전단을 적용하는 장치를 설계했다. 총통 등. 17 체외 젤의 성인 개 연골 세포의 배양 및 이축 기계화의 응용 프로그램과 기본 연골 일치하는 기계적 특성을 보여anical로드 (압축 변형 된로드 및 미끄럼 접촉 로딩).
축이 둘있는 기계적 하중 생물 반응기는 원래 조직 설계 연골의 형태 학적 적응을 유도하는 전반적인 목표와 우리의 실험실에있는 다니엘 추에 의해 설계되었습니다 현재 18보다 높은 압축 및 전단 계수의 결과로 생성합니다. 우리는이 연구는 크게 mechanotransduction의 임상 관련 조직을 설계하기 위해 변조 될 수있는 방법을 우리의 폭 넓은 이해를 증가 할 전망이다.
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Protocol
1. 이축 로딩 생물 반응기 설계
- 생물 반응기는 큰 적재 용량의 정밀도 (진폭과 주파수) 및 다양한 종류의에 응용 프로그램과 함께, 설계 조직에 일축 또는 이축 기계적 변형을 적용 정밀 유도 레이저 응용 프로그램에 대해 철저히 연구소 (뉴턴, MA)에 의해 제조 두 단계를 사용합니다 Single에서 24 잘 플레이트 (그림 1)의 조직 배양 조건.
- 이중 축 방향 하중은 두 TravelMax 단계 (LNR50SE)에 의해 수행됩니다. 이 단계는 XZ 구성에 직교 장착되어 있습니다. 수평 단계는 X 축을 따라 진동에 의해 동적 전단 동작을 제공합니다. 수직 단계는 Z 축을 따라 진동에 의해 동적으로 압축 하중을 제공합니다. 이 단계 미만의 스텝 크기를 사용, 50mm 이동 범위를 가지고 마이크로 스테핑 기능을 특징으로하는 폐 루프 스텝 모터 드라이버 (BSC102)에 의해 제어 스테퍼 모터 액츄에이터 (DRV014)에 의해 독립적으로 구동됩니다50 nm의.
- 이 장치는 단단한 25cm에 장착되어 X 30cm X 12.5 기계 부품의 조립을위한 플랫폼 및 조직 배양 플레이트의 설치에 사용됩니다 mm 알루미늄베이스 플레이트. 조정 운동 정지는 알루미늄베이스 플레이트 자리에 조직 배양 플레이트를 잠그는 데 사용됩니다. 이 운동 중지 그렇지 않으면 손으로 달성 할 수없는 정확한 정렬을 허용하도록 미세 조정 나사가 있습니다. 베이스 플레이트의 모듈 형 설계는 서로 다른 크기와 모양 (배양 접시 대 멀티 - 웰 플레이트)의 판을 수용하기 위해 이러한 운동 정지를 유연하게 배치 할 수 있습니다.
- 맞춤 가공 폴리 설폰 로딩 플래 튼은 정밀 가공 오른쪽 꺾쇠 괄호를 통해 양방향 축 이동 플랫폼에 결합된다. 폴리 술폰 재료는 가공의 용이성 및 살균의 용이성 인해 생체 적합성에 선택되었다.
- 단계의 움직임은 철저히 연구소 '고급 포지셔닝 기술 (APT) 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 스테퍼 모터 드라이버는 우리입니다주파수 및 전단 독립적으로 동시에 압축을 모두 진폭의 부하 매개 변수의 조정을 허용하는 소프트웨어와 함께 ED.
- 위치 피드백은 각 이동 플랫폼에 연결되고 소프트웨어와 통합 된 선형 광 인코더에 의해 제공됩니다. 엔코더 시스템은 여행의 전체 50mm 이상 이하 3 ㎛의 위치 정확도로 번역, 0.1 ㎛의 양방향 반복성과 20 나노 미터의 해상도를 가지고 있습니다. 이 인코더는 진정한 나노 포지셔닝 기능을 보장하기 위해 드라이브 제품 및 절대 위치의 직접 판독하는 데 필요한 위치 피드백을 제공합니다.
- 플래 튼과 샘플 사이의 접촉을 감지하는 데 필요한 힘 피드백을 제공하고로드 응답 로딩 플래 튼 및 이동 플랫폼 (그림 2) 사이에 위치 정밀도 소형 로드셀 (하니웰 모델 31) 평가하기 위하여. 로드 셀은 높은 정확도의가0.15 % 0.25 % 풀 스케일. 로드 셀의 표시 장치 (SC500)는 5 소수 자릿수까지의 하중 측정을 제공 할 수 있습니다. 또한, 그것은 컴퓨터에 데이터 수집이 가능하도록 RS-232 포트가 있습니다.
2. 셀 시드 아가로 오스 구문
- 4 % 아가로 오스 준비 20 ML 50 ML 플라스크에 DMEM (무첨가), 종기, 그리고 70에서 계속 사용할 때까지 ° C 오븐에 0.8 g 아가로 오스를 추가합니다.
- 원하는 세포 시딩 밀도의 두 배 금액에 대한 세포 현탁액의 볼륨을 조정합니다. 이 서스펜션은 원하는 시딩 밀도에서 2 % 아가로 오스 겔을 만드는 4 % W / V 아가의 동량으로 혼합된다.
- 인큐베이터에있는 세포 현탁액 한 10 ㎖ 피펫을 모두 놓습니다.
- 겔 캐스팅 시스템을 설정합니다. 하나의 1.5 mm 한 0.75 mm 스페이서 플레이트 2.25 mm 두께의 젤을 만들어 함께 넣어해야합니다. 다른 크기 스페이서 플레이트는 다른 겔 두께 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 겔 캐스팅 시스템이 접시 toget을 보관 유지하는데 충분한 크기가 아닌 경우그녀는, 그래서 그들은 안전하게 누출을 방지하기 위해 녹화해야합니다.
- 다음 단계는 아가로 오스는 응고되기 전에 빨리 겔 금형에 앞서 준비 아가 피펫으로 세포 현탁액을 혼합하는 것입니다. 오븐에서 액체 아가로 오스를 제거하고있는 멸균 온도계를 배치합니다. 아가로 오스는 ° C 세포와 혼합하기 전에 42-43로 냉각해야합니다. 37 ° C.에 세포 현탁액을 따뜻하게 아가로 오스는 43 명중하면 ° C, 신속하게 원하는 금액을 피펫 다음 즉시 혼합하는 몇 번을 세포 현탁액을 피펫. 다음 즉시 젤 금형에 전체 혼합물을 피펫.
- 젤 15 분 동안 응고 후 조심스럽게 수평 위치로 기울 수 있습니다.
- 상단 유리 접시 생검 펀치 펀치 디스크를 제거합니다. 디스크는 작은 멸균 주걱 포착 할 수 있습니다. 우리의 경험에서, 9 ML 젤보다 백 5 mm 직경의 디스크를 만들 정도로 컸다.
3. 문화 디스크
4. 기계적 하중에 대한 샘플의 고정
- 4 % 아가로 오스 (어떤 세포 현탁액을 추가 없음)와 젤 샘플 자체 (로드하는 동안 간섭을 방지하기 위해)보다 얇은해야한다를 준비합니다. 권장 두께는 1.5-1.9 mm (2.25 mm 두께 샘플)입니다.
- 일단 24 잘 플레이트 펀치 16mm 직경의 디스크, 겔화. 원하는 경우 각 디스크에서 샘플 펀치 한 5 개 mm 구멍 펀치에게 미디어 변경하는 동안 배치 할 피펫의 디스크의 가장자리에 다른 5mm 구멍 안으로 배치 수 있습니다.
- 일단 아가 웰은 24 잘 플레이트의 장소는 그림 3과 같이,되었습니다.
- 아가로 오스 W 번ELL 학생이 24 웰 플레이트에 각 잘 샘플을 맞는 누릅니다. 샘플은 아가로 오스 우물의 정상에서 돌출한다.
5. 기계적 하중
- 플래 튼 (그림 2) 소독.
- 셀을로드하는 알루미늄 플레이트를 고정합니다. 보안 플래 튼 / 스테이지로로드 셀 / 알루미늄 플레이트 어셈블리를로드.
- 스테퍼 모터 컨트롤러 (뒷면 스위치)를 켭니다.
- PC 및 열기 "APT 사용자"프로그램 (그림 4)를 켭니다.
- 화면 왼쪽 수평 스테퍼 모터를 제어합니다. 화면 오른쪽 수직 스테퍼 모터를 제어합니다. 각 화면에서, "그래픽 제어"탭은 수동 위치 결정이 가능하며 이동 "시퀀서"탭을 자동화 할 수 있습니다. 모든 객실에는 mm입니다.
- 두 화면의 "그래픽 컨트롤"탭으로 이동하여 "홈 / 제로"버튼을 누릅니다. 두 스테퍼 모터 50 mm의 범위가 있습니다. "홈 / 제로"를 누르면 제로 위치 (상단과 가장 오른쪽 위치)에 두 스테퍼 모터를 보내드립니다.
- 준비 할 것이다E 각 우물에서 일부 미디어를 제거하여로드 24 잘 플레이트의 샘플입니다. 미디어 더 1보다 ㎖를로드하는 동안 오버플로를 방지하기 위해 각 잘 남아 있어야합니다. 충분한 미디어 샘플을 커버 유지하기 위해 잘 남아 있는지 확인합니다.
- 인큐베이터가 기기 고장을 방지하기 위해 습도가 낮은 조건에서 보관합니다.
- 장소에 24도 생물 반응기에서 플레이트와 플래 튼과주의를 줄.
- 플레이트는 네 개의 조정 운동 로케이터를 사용하여 생물 반응기에 고정되어 있습니다. 쉽게 플래 튼을 줄 수 있도록, 두 왼쪽 로케이터는 미리 배치되어있다. 플레이트가 안전하도록 오른쪽 두 로케이터를 조입니다. 생물 반응기베이스의 전면까지 세척 접시를 줄 수 있는지 확인하십시오.
- "그래픽 컨트롤"탭에서 특정 스테퍼 모터의 위치를 수동으로 위치 상자를 클릭하여 입력 할 수 있습니다. 천천히 플래 튼을 낮추고 접시 줄을 수평으로 이동하려면이 기능을 사용합니다. </ OL>
- 플래 튼은 샘플의 만남에 가까운되면 매우 느린 단위로 플래 튼을 가지고 시작 (0.1 mm)는 소정의 시작 위치에 도달 할 때까지 (파트 6 참조).
- 시작 위치에 도달하면, 탭 "시퀀서를 이동"을 눌러 원하는 이동 순서를로드로 이동 "로드." 그런 다음 시작 "실행"을 누릅니다. (그림 5) 제 7 부 참조하십시오. 주입 프로토콜을 작성합니다.
- 로드가 완료되면 수동으로 플래 튼을 올립니다. 모든 샘플은 플래 튼에 붙어있는 경우, 신중하게 잘 멸균 주걱을 사용하여 적절한에 다시 넣습니다.
- 생물 반응기에서 24 잘 플레이트를 제거하고 용지를 교체하십시오.
- 조심스럽게로드 셀에서 플래 튼을 제거하고 악기의 전원을 끕니다.
6. 교정 로딩 플래 튼
적절한 긴장이 샘플에 적용되어 있는지 확인하려면 각 플래 튼은 신중하게 실험을 시작하기 전에 보정해야합니다.
- 수동으로 25mm 위치에서 수평 스테퍼 모터를 넣어.
- 그냥 간신히 생물 반응기의 바닥에 접촉 조심스럽게 낮은 플래 튼을 때까지. 로드셀이 시점에서 증가 된 부하를 표시합니다. 수직 스테퍼 모터 (모든 압축 변형률 측정은이 값으로 계산되므로, 가능한 한 정확하게)의 정확한 위치를 적어 둡니다.
- 위치를 기록합니다. 이 값은 샘플 크기와 원하는 변종에 따라 투약 프로토콜을 작성하는 데 사용됩니다.
7. 주입 프로토콜을 작성
- 생물 반응기는 동시에 또는 개별적으로 압축 및 전단을 모두 변형을 적용 할 수 있습니다. 용기를 압축 변형, 동적 변형률 진폭, 주파수를로드 : 세 가지 주요 매개 변수를 결정해야합니다.
- 용기의 변형이 샘플에서 플래 튼의 이륙을 방지하기 위해 적용됩니다.
- 샘플 동적 변형률 진폭과 주파수 하중주파수가 선택됩니다.
이 연구에서 우리는 다음과 같이 압축 및 전단 변형을 정의 
예를 이축 분배 프로토콜
샘플 두께 : 2.25 mm
자체 스트레인 (압축) : 샘플 간격의 10 % (0.225 mm)
동적 변형률 진폭 (압축) : 10 % (+ / - 시료 두께의 5 %)
주파수 (압축) : 1 Hz에서
동적 변형률 진폭 (전단) : 샘플 간격 (0.5625 ㎜)의 25 % : 전단 응력은
수평으로 이동하는 플래 튼하여 샘플에 적용.
주파수 (전단) : 0.5 Hz에서
일반적인 투약 프로토콜은 하루에로드 3 시간이다.
이 예제에서는 동적 및 전단 하중이 동시에보다는 순차적으로 적용됩니다. 우리는이 패턴을 잘 MIM 믿는다인간의 무릎에 ICS는 복잡한 로딩 환경을 제공합니다.
- 투약 프로토콜이 선택되면, 압축 이동 시퀀스 프로그램을 작성해야합니다.
- 이동 순서는 스테퍼 모터가 지정된 가속과 최대 속도로 이동됩니다 위치의 목록처럼 소리를 정확히 것입니다.
- 프로토콜 및 플래 튼 보정 값 (파트 6에서) 배치에 따라 원하는 수직 위치를 계산합니다.
- 플래 튼 1 예 계산은 아래에 제공됩니다 :
| 보정 값의 차이 | 수직 위치 | |
| 원고 교정 값 (생물 반응기의 접촉 하) | 0mm | 29.7700 mm |
| 플래 튼은 샘플과 접촉 (2.25 mm 샘플)를 만드는 | 4.4140 mm | 25.3560 mm |
| 생비 (5 % 간격) | 4.3015 mm | 25.4705 mm |
| 스트레인 (10 % 두께) | 4.1890 mm | 25.5810 mm |
| 스트레인 (15 % 두께) | 4.0765 mm | 25.6955 mm |
- 일단 위치는, 가속과 정확한 주파수를 얻을 수있는 최대 속도 값으로 실험을 계산됩니다. 사이클의 수 (1 Hz에서 3 시간 예 : 10,800 사이클) 따라서 선택해야합니다.
- 예를 들어 동적 압축 이동 시퀀스 프로그램 (10 % 자체 압축, 10 %의 동적 변형률 진폭, 1 Hz에서) (그림 5)
- 동적 전단 이동 시퀀스 프로그램 : 사이클의 수는 원하는 주파수 및 기간 (0.5 Hz에서 3 시간 동안 예를 들어, 5,400 사이클)에 따라 선택되어야한다.
- 예를 들어 동적 전단 이동 시퀀스 프로그램 (10 % 자체 압축, 0.5625 mm (두께의 25 %) 동적 전단 변형률 진폭 0.5Hz에서) (그림 5).
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Representative Results
이 장치는 2,000 만 셀 / ML 연골 세포와 아가로 오스 젤 시드를 사용하여 테스트 단축 (압축) 또는 이축 (압축 및 전단) 기계적 하중의 존재에서 재배되었다. 기본 돼지 연골 세포는 2-4 개월 된 돼지의 관절 연골에서 분리되었다. 5 개 mm 직경 1.5 mm 두께의 샘플은 정의 연골 배양 배지 (높은 혈당 DMEM, 1 % ITS + 미리 섞은 것, 100 U / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신, 2 mM의 L-글루타민, 2.5 ㎍ / ㎖ 2 ㎖에서 배양 하였다 암포 테리 신 B, 37 24 - 웰 플레이트에 50 ㎍ / ㎖ 아스 코르 빈산, 0.1 mM의 불필요한 아미노산 (NEAA), 프롤린 0.4 밀리미터) ° C, 5 % CO 2. 10 -7 M의 덱사메타손 10 NG / ML TGF-β1은 문화의 처음 10 일 동안 제공 하였다. 샘플은 일 10-30 사이 3 시간 / 하루에로드 된. 단축로드가 10 % 압축 피크 - 투 - 피크 진폭으로 구성, 1 Hz에서 이축 하중은 0.15 mm (10 % 두께) 압축 및 0.075으로 구성mm 전단 피크 - 피크 진폭, 1 Hz에서. 동적 변형률 진폭 하중 주파수는 출판 연구 17,19에 따라 선택됩니다. 30 일의 끝에 설계 연골의 생화학 적 및 기계적 특성을 평가 하였다.
- 아니 부하 제어, 2 - 단축 (압축) 로딩, 3 - 축이 둘있는 (압축 및 전단) 하중 1 :이 연구는 세 그룹을 채택했다. DNA의 내용과 구조의 젖은 무게는 재배 30 일 (p> 0.05), 후 세 그룹에서 유사한 남아 있었다. GAG 콘텐츠 일축로드 그룹 (그룹 2, p <0.05) (그림 6)에 따라, (3 군, p 대조군에 비해 <0.001) 이축 하중을받는 한 그룹에서 가장 높았다. 그룹 2와 3의 GAG 내용은 각각 48 %와 네이티브 연골의 50 %에 해당합니다. 그룹 3 그룹 1과 2 (p <0.01)보다 콜라겐 상당히 높은 양의 결과. 그룹 2는 두꺼운 구조 그쪽을했다N 1 군 (p <0.01). 놀랍게도, 평형 압축 탄성 계수는 2 군에서 가장 높았다 (단축 하중, p <0.01), 3 군과 1 사이의 유의 한 차이가 없었다. 그룹 2의 탄성 계수는 기본 돼지 연골의 60.1 %에 맞습니다.
조직 학적 분석은 글리코 사 미노 글리 칸 (alcian 파란, safranin O)와 타입 II 콜라겐 (그림 7)에 대한 긍정적이고 균일 한 염색을 지적했다. 모든 그룹 유형 I 콜라겐 (표시되지 않음)에 대해 부정적인 염색.
요약하면, 이러한 예비 결과는이 생물 반응기가 성공적으로 압축 및 이축을 (압축 및 전단) 엔지니어링 조직의 장기 재배시 기계적 하중 적용하는 것이 좋습니다. 본 연구에서는 이축 하중은 프로테오글리칸 및 콜라겐 증착 및 조직 공학적 연골 샘플의 두께로 나타났다. 단축 압축 테오 증착하고 모두 증가 영의 계수.
그림 1. 이축 하중은 X 단계 (전단) 및 Z-단계 (압축)하여 수행됩니다. 그림 24 - 웰 플레이트에 샘플을로드하는 단계에 연결된 사용자 정의 - 만든로드 플래 튼을 보여줍니다. 로드 매개 변수는 스테퍼 모터 (18)에 연결된 컴퓨터로 제어됩니다.
그림 2. 왼쪽 : 24 - 웰 플레이트 용으로 설계된 폴리 설폰 로딩 플래 튼. 오른쪽 : 이축 하중 반응기에 로딩 플래 튼 첨부.
그림 3. 전단로드하는 동안 샘플을 고정을위한 아가로 오스 우물의 준비. 기계적 하중에 대해 잘 아가로 오스에 배치 고정 구조. 이 그림은 잘 2,475 mm 두께의 시료 1.5 mm 두께의 아가를 보여줍니다.
그림 4. 이축 하중 장치를 제어 할 수있는 그래픽 사용자 인터페이스. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 5. 예를 이축로드 이동 시퀀스 프로그램 그래픽 사용자 인터페이스 : 동적 압축 이동 시퀀스 프로그램 (10 % 자체 압축, 10 %의 동적 변형률 진폭, 1 Hz에서) 및 동적 전단 이동 시퀀스 프로그램 (10 % 자체 압축, 25 %의 동적 전단 변형률 진폭 0.5 Hz에서). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 6. 생화학 적 및 기계적 시험 결과 (N = 6) *** p <0.001, ** p <0.01, * P 그룹 1 (언로드 제어 그룹 2에 비해 <0.05 :.. 일축 압축 하중, 그룹 3 : 이축 압축 및 전단 로드.
그림 7. 조직학 : Alcian 블루 / 원자력 빠른 빨간색 염색, Safranin O / 빠른 그린, II 형 콜라겐에 대한 면역 화학.
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Discussion
우리는 이식을 위해 제작 된 조직 공학적 구조로 일축 또는 이축 기계적 변형을 적용 할 수있는 로딩 장치를 설계했습니다. 장치가 기본 조직이나 이전에 다른 치료 후 기계적 특성을 설명하기 위해 설계된 바이오 복합 재료의 체외 배양에 대한 생물 반응기 나 테스트 장치로 사용할 수 있습니다. 장치 과목 24 잘 접시에 하나의 큰 부하 용량의 정밀도 (진폭과 주파수) 및 조직 배양 조건의 넓은 다양한 응용 프로그램과 축이 둘있는 기계적 하중에 조직 구조를 설계.
전단 하중의 응용 프로그램은이 시스템의 설계에 대한 독특한 도전의 세트를 발표했다. 영양 전송을 극대화하기 위해, 구조는 원래 24 잘 플레이트의 각 웰에 일축했다. 용기의 압축 변형이 보험으로 이것은 동적 압축에 대한 문제를 제시하지 않았다샘플 플래 튼 접촉이 손실되지 않았습니다. 전단 변형이 프로토콜에 추가 될 때, 그러나, 일축 샘플 플레이트의 하단 하락 및 플래 튼 일부 손실 문의하십시오. 또한, 이축 하중 프로토콜 샘플 중에 일치하지 않는 부하를 일으키는 원인이 뒤집어 경향이 있었다. 우리는 절차에 설명 된대로 샘플을 고정화하는 아가로 오스 우물을 만들어이 문제를 해결했다. 이 아가로 오스 우물 샘플 영양분을 제한하지 않고 샘플의 일관된 이축 하중을 허용합니다.
널리 20,21을 연구하는 압축 바이오 리액터는 달리, 우리의 장치는 여러 축에 대한 정확한 변형을 적용 할 수 있습니다. 이 축이 독립적으로 제어 할 수 있습니다. 다축로드는 순차적으로 또는 동시에 적용 할 수 있습니다. 더 나은 생체 내 조건에서 모방 세 가지 차원에서 기계적 부하를 제공하기 위해 Y 축 제를 구현하는 것이 가능하다.
동안다른 다축 생물 반응기는 관절의 기계적 환경을 모방하기 위해 개발되었습니다, 그들은 우리의 시스템에 비해 많은 제한이 있습니다. 프랭크 등에 의해 설계 전단 및 압축 장치. 부하의 의견과 동시에로드 할 12 샘플까지 허용하지만 구조는 밀폐 또는 6을 확보하지 않습니다. 전단 변형을 포함하는 실험을하는 동안, 그것은 구조는 그들이로드 플래 튼에서 미끄러지지 않도록 확보하는 것이 필수적이다. 슬라이딩은 시편의 고르지 일관성 전단 하중에 발생합니다. 이러한 독특한 "롤링 볼"시스템 22,23 및 이축 자극 장치 (16)와 같은 새로운 바이오 리액터, 훨씬 더 현실적이고 일관된 로딩 환경을 만들 수 있지만, 그들은 단지 하나의 샘플을 한 번에로드 할 수 있습니다. 큰 샘플 크기는 신뢰의 높은 수준의 구조에 필요한 생화학, 기계, 조직 학적 분석을 수행하기위한 필수적입니다. ADDItionally, "롤링 볼"시스템은 포스 피드백, 체외 배양에서 긴 기간 동안 구조 개발의 필수적인 측정 없다. 또한 플래 튼 - 시편 비 접촉 비가 역적 조직 설계 구조를 손상시킬 표본 과부하를 방지 할 수 있습니다. 총통, 외.가 개발 한 미끄럼 접촉 반응기를 동시에로드 할 네 가지 구조를 허용하지만 여전히 가치있는 포스 피드백 메커니즘 17 없다.
24 - 웰 플레이트를 사용하여 현재 설정 24 샘플의 동시로드 할 수 있습니다, 더 많은 샘플이 로딩 플래 튼의 형상 변경 가능합니다. 로딩 플래 튼 참신한 디자인에 넓은 유연성을 제공합니다. 폴리 설폰 다공성 선택한 소재는, 살균 및 인큐베이터의 습기와 따뜻한 환경에서 재배 할 수 있습니다. 이 샘플의 기하와 숫자의 다양한이 동시에로드 할 수 있도록 쉽게 기계 가공합니다LY.
결론적으로, 조직 공학을위한 새로운 이축 하중 생물 반응기는 조직 공학적 구조의 체외 배양에서 장기 수 있습니다. 이축 하중은 프로테오글리칸 및 콜라겐 증착 및 조직 공학적 연골 샘플의 두께를 증가하지만 우리는 가설로 크게 설계 연골의 기계적 특성에 영향을 보이지 않았다. 단축 압축 테오 증착 및 탄성 계수가 모두 증가했다. 우리는 기계적 하중의 최적 복용량은 세포와 조직 특성에 차이가 있다고 생각합니다. 콜라겐 구조 및로드의 선량의 미래 연구는 우리가 완전히 엔지니어링 조직의 발달에 이축 하중의 영향을 평가할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 연구 및 개발, RR & D 서비스, 재향 군인의 미국학과, NIH 코 브레 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 및 방위 W81XWH-10-1-0643학과 사무실에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
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