Summary
Мы разработали новую механической загрузки биореактора, которые могут применяться одноосные или двухосные механические напряжения хряща биокомпозитные до трансплантации в дефекта суставного хряща.
Abstract
Мы разработали загрузочное устройство, которое способно применением одноосного или двухосного механическое напряжение в ткани инженерии биокомпозитов изготовлены для трансплантации. Пока устройство в основном функционирует в качестве биореактора, который имитирует родной механических напряжений, он также оснащен датчиком нагрузки для обеспечения обратной силы или механических испытаний конструкций. Устройство субъектов инженерии хряща конструкции для двухосных механических нагрузках с большой точностью нагрузочной дозы (амплитуда и частота) и достаточно компактен, чтобы поместиться внутри стандартной культуре ткани инкубатора. Он загружает образцов непосредственно в планшет для тканевых культур и разных размеров пластины совместимы с системой. Прибор был разработан с использованием компонентов, выпускаемых для высокоточного применения лазеров. Би-осевой нагрузки осуществляется двумя ортогональными этапов. Ступени имеют 50 мм Диапазон перемещения и приводятся в действие независимо от шаговых приводов двигателя, контролируемогозамкнутой шаговым двигателем водитель, который имеет микро-шаговый возможности, что позволяет шаг размерами менее 50 нм. Полисульфона загрузки валик соединен с двухосной подвижной платформе. Перевозкой этапы контролируются Тор-Labs Расширенные технологии позиционирования (APT) программного обеспечения. Драйвер шагового двигателя используется вместе с программным обеспечением для настройки параметров нагрузки от частоты и амплитуды и сдвиг и сжатие независимо и одновременно. Позиционная обратная связь обеспечивается линейными оптическими датчиками, которые имеют двунаправленный повторяемости 0,1 мкм и разрешением 20 нм, переводя к позиционной точностью менее 3 мкм по всей 50 мм хода. Эти датчики обеспечивают необходимую обратную связь по положению на электронику винчестера обеспечения подлинной нанопозиционирования возможностями. Для обеспечения обратной связи по усилию для обнаружения контакта и оценивать загрузку реакций, точность миниатюрного датчика нагрузки расположена между валиком загрузки и двигаешьсяг платформы. Датчик обладает высокой точностью 0,15% до 0,25% от полной шкалы.
Introduction
Мы разработали загрузки биореактора, что позволяет наносить одноосной или двухосной механическое напряжение в ткани инженерии биокомпозитов изготовлены для трансплантации. Это устройство предназначено главным образом в качестве биореакторов для инженерии замены суставного хряща, она также может быть использована для других несущих тканей в организме человека. Наша мотивация в этом биореакторе дизайна связано с Drachman и Соколов 1, который сделал семенные наблюдения аномальных формирование суставного хряща в парализованном куриных эмбрионов из-за отсутствия движения. Кроме того, физические упражнения необходимы для нормального развития мышц и костей. В соответствии с этой концепцией, многие исследовательские группы исследовали, как различные виды физических раздражителей во время выращивания в пробирке модулирует биохимические и механические свойства клеточного биоматериала биокомпозитами и ткани эксплантов 2-7. Понятие функциональной тканевой инженериивключает в пробирке использованием механических стимулов для повышения функциональных свойств тканей, т.е. механические свойства, которые позволяют ткани выдерживать ожидаемые в естественных условиях стресса и напряжение 8,9. Многочисленные исследования сообщают об использовании механической нагрузки в терминах сдвига и сжатия, чтобы стимулировать инженерных конструкций хряща суставных соединений. Mauck соавт. 10 показывают, что механическая нагрузка может вызвать только хондрогенезе мезенхимальных стволовых клеток даже в отсутствие факторов роста, которые считаются жизненно важными. Применение прерывистой механической нагрузки, такие как сжатие или сдвиг во время культивирования тканей было показано, модулирует хрящевой и костной формации, однако оптимальный дозиметрии нагрузки отличается от клеток и тканей свойствами 11.
Наиболее важная функция суставного хряща является способность выдерживать сжатие и поперечных сил всустава, поэтому он должен иметь высокой прочностью на сжатие и модуля сдвига. Отсутствие функциональной механической прочности и физиологический ультраструктуры инженерии хрящей привело к распаду на нео-хрящ в естественных условиях и неспособность хряща замены стратегии в суставах. Хотя сжатия и сдвига были широко продемонстрированы для модуляции и улучшить механическую прочность биокомпозитов суставного хряща, комбинированный подход редко 6,12-15. Wartella и Уэйн 16 разработан биореактора, которые применяются растяжение и сжатие производить замены мениска хрящ. Вальдман соавт. 15 разработаны устройства применить сжатия и сдвига в хондроциты культивировали в пористой подложке, полифосфат кальция. Бянь соавт. 17 продемонстрировано соответствие механических свойств хряща с родным в пробирке выращивания взрослых собачьих хондроцитов в гелях и применение двухосных мехветствующий квантовомеханический нагрузки (сжатие деформационных нагрузка на контакт и раздвижные нагрузки).
Двухосных механических биореактор загрузки был первоначально разработан Даниэль Чу в нашей лаборатории с общей целью, чтобы вызвать морфологических адаптаций в тканевой инженерии хряща строит приводит к повышению на сжатие и модуля сдвига, чем в настоящее время 18. Мы считаем, что это исследование позволит значительно увеличить наши широком понимании того, как механотрансдукция можно модулировать спроектировать клинически значимых тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Двухосные Дизайн биореактор загрузка
- Биореактор использует два этапа производства Thor-лабораторий (Newton, MA) для высокоточного применения лазеров для применения одноосного или двухосного механических напряжений в инженерии тканей, с большой точностью из нагрузочной дозы (амплитуды и частоты), а также применение широкого разнообразия культуры тканей условиях от одного до 24-луночные планшеты (рис. 1).
- Би-осевой нагрузки осуществляется в два этапа TravelMax (LNR50SE). Эти этапы установлены ортогонально в конфигурации XZ. Горизонтальная этап обеспечивает динамическое движение сдвига посредством качани вдоль оси Х. Ступени вертикального обеспечивает динамическое сжатие загрузкой колеблющегося вдоль Z-оси. Эти этапы имеют 50 мм диапазон перемещения и приводятся в движение независимо друг от шагового привода двигателя (DRV014), контролируемой замкнутой шаговым двигателем водитель (BSC102), который показывает микро-шаговый возможности, что позволяет шаг размерами менее50 нм.
- Данное устройство крепится на жесткую 25 см х 30 см х 12,5 мм алюминиевой опорной плите, которая используется в качестве платформы для сборки деталей машин и для монтажа плит культуре ткани. Регулируемая кинематической остановки используется для блокировки тканевую культуру, на месте на опорной плите алюминия. Эти кинематической остановках есть прекрасные регулировочных винтов для обеспечения точного выравнивания, что, впрочем, не достижимые вручную. Модульная конструкция опорной плиты обеспечивают гибкое размещение этих кинематических остановки для размещения пластинами различных размеров и форм (чашки Петри по сравнению с мульти-луночных планшетах).
- Специально обработанной полисульфоном загрузки валика соединен с двухосной платформе через движущийся с высокой чистотой обработки правую угловую скобку. Полисульфон материал был выбран из-за его биосовместимость, легкость обработки и простота стерилизации.
- Перевозкой этапы контролируются Тор-Labs 'Advanced Technology позиционирования (APT) программного обеспечения. Драйвер шагового двигателя намиред в сочетании с программным обеспечением, что позволяет регулировать нагрузку параметры частоты и амплитуды и сдвиг и сжатие независимо и одновременно.
- Позиционная обратная связь обеспечивается линейных оптических датчиков, которые прикреплены к каждой подвижной платформе и интегрированы с программным обеспечением. Кодер система имеет двунаправленный повторяемости 0,1 мкм и разрешением 20 нм, переводя к позиционной точностью менее 3 мкм по всей 50 мм хода. Эти датчики обеспечивают необходимую обратную связь по положению на электронику винчестера обеспечения подлинной нанопозиционирования возможности и непосредственно считывать значения абсолютной позиции.
- Для обеспечения обратной связи по усилию необходимый для обнаружения контакта между валиком и образцы и оценивать загрузку реакций, точность миниатюрного датчика нагрузки (Honeywell Model 31) расположена между загрузкой валиком и подвижной платформе (рис. 2). Датчик обладает высокой точностью0,15% до 0,25% от полной шкалы. Дисплей (SC500) для тензодатчика может также обеспечить измерения нагрузки до 5 знаков после запятой. Кроме того, он имеет порт RS-232 для обеспечения сбора данных на компьютере.
2. Сотовые семенами Агароза Конструкции
- Подготовка 4% агарозном: добавить 0,8 г агарозы до 20 мл DMEM (без добавок) в колбе на 50 мл, кипятить, а затем сохранить в 70 ° C духовку до использования.
- Настройка громкости клеточной суспензии на двойное количество требуемой плотности посева клетки. Эту суспензию смешивали с равным объемом 4% вес / объем агарозном создать 2% агарозном геле в нужной плотности посева.
- Поместите обе суспензии клеток и один 10 мл пипетки в инкубаторе.
- Настройка системы заливки геля. Один 1,5 мм и один 0,75 мм промежуточной пластины должны быть объединены, чтобы создать 2,25 мм густой гель. Плиты прокладка размера могут быть использованы для создания различных гель толщины. Система заливки геля не является достаточно большой, чтобы держать эти пластины ToGetей, поэтому они должны быть надежно приклеенный к предотвращению утечки.
- Следующим шагом будет быстро смешивать клеточной суспензии с предварительно приготовленной агарозы и пипетки в гель формы перед агароза затвердеет. Удалить жидкость агарозы из духовки и поместите стерильный термометр в нем. Агарозы должна остыть до 42-43 ° С перед смешиванием с клетками. Разминка клеточной суспензии до 37 ° C. После агарозном хиты 43 ° С, быстро пипетку вверх необходимую сумму и затем сразу же пипетки клеточной суспензии вверх и вниз несколько раз перемешать. Затем сразу же пипетку всей смеси в гель формы.
- Разрешить гель затвердевает в течение 10-15 мин, а затем осторожно наклоните его в горизонтальное положение.
- Снимите верхнюю стеклянную пластину и удар дисков с биопсией удара. Диски можно забрать с небольшим стерильным шпателем. По нашему опыту, 9 мл геля была достаточно большой, чтобы сделать более ста 5 мм в диаметре дисков.
3. Культура Диски
4. Иммобилизация образцов для проведения мех загрузка
- Подготовка 4% агарозы (не суспензии клеток не добавлено) и гель должен быть тоньше, чем образцы собой (для предотвращения помех во время загрузки). Рекомендуемая толщина 1,5-1,9 мм (для 2,25 мм образца).
- Как только гель, удар диаметром 16 мм дисков для 24-луночных планшетах. В каждом диске, один удар отверстие диаметром 5 мм для образца для размещения дюйма При желании, удар еще на 5 мм отверстия на краю диска для пипетки для размещения во время изменения информации.
- После агарозном скважин были сделаны, помещают в 24-луночный планшет, как показано на рисунке 3.
- После агарозном Wлокти находятся в 24-луночный планшет, прессовой посадкой образцов в каждую лунку. Образец должен выступать из верхней части скважины агарозы.
5. Механическая нагрузка
- Стерилизовать валиком (рис. 2).
- Закрепите алюминиевой пластиной для загрузки ячейки. Безопасная загрузка валиком / Тензодатчики / алюминиевую пластину сборки на сцену.
- Включите контроллер шагового двигателя (переключатель в спине).
- Включите ПК и открытым "APT пользователя" программы (рис. 4).
- Левый экран Контроль горизонтального шагового двигателя. Правой части экрана Контроль вертикального шагового двигателя. В каждом экране, "Графический контроль" вкладка позволяет для ручного позиционирования и "Move Sequencer" вкладка позволяет автоматизировать. Все подразделения мм.
- Перейдите в раздел "Графический управления" вкладку на обоих экранах и нажмите кнопку "Home / Zero". Оба шаговые двигатели имеют диапазон 50 мм. При нажатии кнопки "Главная / Zero" пошлет как шаговые двигатели в нулевое положение (верхний и правый большинство позиций).
- Подгоэлектронной образцов в 24-луночный планшет для загрузки путем удаления некоторых сред из каждой лунки. Не более 1 мл среды, должны быть оставлены в каждой лунке, чтобы предотвратить переполнение во время загрузки. Будьте уверены, что достаточно средств массовой информации остается в хорошо держать Выборка охватывала.
- Обратите внимание, что инкубатор хранится в низкой влажности условия для предотвращения прибора из строя.
- Место 24-луночный планшет в биореактор и тщательно выстраивать с валиком.
- Пластина прикреплена к биореакторе с помощью четырех регулируемых кинематической локаторы. Чтобы было легче выстроить валик, двух левых локаторы были заблаговременно размещены. Затяните два правом локаторы так, что пластина является безопасным. Убедитесь в том, чтобы выровнять пластину заподлицо с передней части биореактора базы.
- В "Графический управления" на вкладке, конкретные позиции шагового двигателя можно ввести вручную, нажав на положение коробки. Используйте эту возможность для медленно опустите валик и переместить его горизонтально, чтобы выстроиться в линию с пластиной. </ OL>
- После экспонирования близка к вступления в контакт с образцами, начинают приносить валика вниз к очень медленным шагом (0,1 мм), пока не достигнете заданной стартовой позиции (см. часть 6).
- Как только исходное положение достигнуто, перейдите в раздел "Переместить Sequencer" на вкладке и загрузки нужного последовательность ходов, нажав кнопку "Load". Затем нажмите кнопку "Выполнить", чтобы начать. (Рис. 5) См. часть 7. Написание Дозирование протокола.
- При завершении загрузки вручную поднять валик. Если любые образцы приклеили к плите, осторожно положил их обратно в соответствующую лунку помощью стерильного шпателя.
- Удалите 24-луночный планшет из биореактора и заменить средства массовой информации.
- Осторожно снимите валик от нагрузки клетки, а затем выключите инструментов.
6. Калибровка загрузка плиты
Чтобы обеспечить надлежащую штаммов применяются для образцов, каждый валик должен быть тщательно откалиброваны перед началом эксперимента.
- Вручную выставлять горизонтальные шагового двигателя на 25 мм положение.
- Тщательно нижней плите, пока она едва не вступает в контакт с основанием в биореактор. Тензодатчика покажет повышенные нагрузки в этой точке. Обратите внимание на точное положение вертикального шагового двигателя (быть как можно более точно, так как все измерения деформации сжатия будет рассчитываться от этого значения).
- Отметьте положения. Это значение будет использоваться для дозирования написать протокол, основанный на размеры образца и желаемой штаммов.
7. Написание протокола дозирования
- Биореактор позволяет наносить как на сжатие и деформацию сдвига, либо одновременно, либо по отдельности. Три основные параметры должны быть решено: Тара деформации сжатия, динамическая амплитуда напряжения, частоты и загрузки.
- Штамм тары применяется для того, чтобы предотвратить старта валика из образца.
- Пример динамической амплитуды напряжения и частоты загрузкичастоты выбираются.
В этом исследовании мы определяем сжатии и деформации сдвига следующим образом: 
Пример двухосные протокола дозирования
Толщина образца: 2,25 мм
Тара деформации (сжатия): 10% от толщины образца (0,225 мм)
Динамический амплитуда деформации (сжатия): 10% (+ / - 5% от толщины образца)
Частота (сжатие): 1 Гц
Динамический Амплитуда деформации (сдвиг): 25% от толщины образца (0,5625 мм): напряжение сдвига
приложенное к образцу валиком, движущихся горизонтально.
Частота (сдвиг): 0,5 Гц
Типичные протокол дозирования составляет 3 часа загрузки в день.
В этом примере динамический и поперечной нагрузки применяется одновременно, а не последовательно. Мы считаем, что эта модель лучше MIMICS сложных условиях нагрузка в человеческом колене.
- После дозировки был выбран протокол, последовательность сжатия ходу программа должна быть записана.
- Последовательность перемещения точно, что это звучит как, перечень должностей, что шаговый двигатель перейдет в заданное ускорение и максимальную скорость.
- Вычислить желаемый вертикальной позиции, основанные на протоколе дозирования и валика калибровки значение (из части 6).
- Пример вычисления для экспонирования 1 приведены ниже:
| Отличие от калибровочного коэффициента | Вертикальное положение | |
| Плита калибровочного коэффициента (штрихи нижней части биореактора) | 0 мм | 29,7700 мм |
| Плита вступает в контакт с образцом (2,25 мм образец) | 4,4140 мм | 25,3560 мм |
| Улицадождь (5% толщина) | 4,3015 мм | 25,4705 мм |
| Штамм (10% толщина) | 4,1890 мм | 25,5810 мм |
| Штамм (15% толщина) | 4,0765 мм | 25,6955 мм |
- Как только позиции вычисляются, эксперимент с ускорением и максимальные значения скорости, чтобы получить правильную частоту. Число циклов должны быть выбраны, соответственно (например, 10800 циклов в течение 3 ч при 1 Гц).
- Пример сжатия динамического последовательность ходов программы (10% тары сжатия, 10% динамичный амплитуды напряжения, 1 Гц) (рис. 5)
- Динамический сдвиг последовательности программ ход: Число циклов должно быть выбрано в соответствии с желаемой частотой и продолжительностью (например, 5400 циклов в течение 3 ч при 0,5 Гц).
- Пример динамического сдвига перемещения последовательности программ (10% тары сжатие, 0,5625 мм (25% толщины) динамический сдвиг амплитуды напряжения, 0,5Гц) (рис. 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Устройство было испытано с использованием агарозного геля затравку 20 миллионов клеток / мл хондроцитов и культивировали в присутствии одноосной (сжатия) или двухосного (сжатия и сдвига) механической нагрузки. Первичный хондроцитам свиного были выделены из хрящевой ткани 2-4 месячного свиней. Диаметром 5 мм и толщиной 1,5 мм образцы культивируют в 2 мл определены хондрогенного культуральной среды (Высокий уровень глюкозы DMEM, 1% ITS + премикс, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 2,5 мкг / мл амфотерицин В, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты, 0,1 мМ заменимых аминокислот (NEAA), 0,4 мМ пролина) в 24-луночных планшетах при 37 ° С, 5% СО 2. 10 -7 М дексаметазон и 10 нг / мл TGF-β1 были поставлены в течение первых 10 дней культуры. Образцы загружают в течение 3 час / сут между 10-30 дней. Одноосный загрузки состояла из 10% сжатия от пика до пика амплитуды, 1 Гц и двухосной нагрузки состоял из 0,15 мм (10% толщины) сжатия и 0,075мм сдвиг пика до пика, 1 Гц. Динамический амплитуды напряжения и частота нагружения должны выбираться с учетом опубликованных исследований 17,19. В конце 30 дней биохимические и механические свойства хряща инженерии были оценены.
Это исследование используется три группы: 1 - Нет управления загрузкой, 2 - одноосные (сжатие) загрузка, 3 - двухосные (на сжатие и сдвиг) загрузка. ДНК содержание и сырой вес конструкций оставалась такой же, в трех группах после 30 дней культивирования (р> 0,05). GAG содержание была самой высокой в группе, которой подвергается двухосной нагрузки (группа 3, р <0,001 по сравнению с контрольной группой), с последующим одноосным группа нагрузки (группа 2, р <0,05) (рис. 6). GAG содержание групп 2 и 3 соответствуют 48% и 50% исходной хрящей, соответственно. Группа 3 дало значительно более высокие количества коллагена, чем групп 1 и 2 (р <0,01). Группа 2 также была толще конструкции тхан группы 1 (р <0,01). Удивительно, модуль сжатия равновесия Юнга был самым высоким в группе 2 (одноосные загрузки, р <0,01) и не было никаких существенных различий между группами 3 и 1. Модуль Юнга 2-й группы соответствовало 60,1% родным хрящи свиные.
Гистологические анализы показали положительные и однородное окрашивание на гликозаминогликанов (альциановым синий, сафранином O) и типа II коллагена (рис. 7). Все группы окрашивали отрицательным для коллагена типа I. (не показан).
Таким образом, эти предварительные результаты показывают, что это биореактор успешно применяется сжатие и двухосных (сжатия и сдвига) механические нагрузки при длительном культивировании инженерии тканей. В этом исследовании двухосной нагрузки было показано, протеогликанов и коллагена и толщины ткани инженерные образцы хрящевой ткани. Одноосного сжатия увеличился как отложение протеогликанов и Модуль Юнга.
Рисунок 1. Двухосной нагрузки осуществляется X-этап (сдвиг) и Z-этап (сжатия). На рисунке показана на заказ загрузкой плиты прикреплены к стадии для загрузки образцов в 24-луночный планшет. Загрузке параметры контролируются с компьютера, подключенного к шаговых двигателей 18.
Рисунок 2. Слева: полисульфона загрузки валик предназначен для 24-луночных планшетах. Справа: загрузка вложений валиком в двухосную биореактор загрузка.
Рисунок 3. Подготовка агарозном скважин для иммобилизации образцов при поперечной нагрузки. Иммобилизованное конструкция помещается в агарозном также для механической нагрузки. На этом рисунке показана толщиной 1,5 мм агарозном хорошо и 2,25 мм образца.
Рисунок 4. Графический пользовательский интерфейс для управления устройством двухосной нагрузки. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
hres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50387/50387fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Пример двухосном нагружении последовательность ходов программирования графического пользовательского интерфейса: Сжатие динамического последовательность ходов программы (10% тары сжатия, 10% динамичный амплитуды напряжения, 1 Гц) и динамический сдвиг программы последовательность перемещения (10% тары сжатия, 25% динамичный амплитуде деформации сдвига, 0,5 Гц). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 6. Биохимические и механических результаты тестирования (п = 6), *** р <0,001, ** р <0,01, * р <0,05 по сравнению с группой 1 (без нагрузки управления Группа 2:.. Одноосное сжимающей нагрузки, группа 3: двухосном сжатии и сдвиге Загрузка.
Рисунок 7. Гистология: Alcian синий / ядерные быстро красное окрашивание, сафранин О / быстрая зеленая, иммунохимия для коллагена типа II.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали загрузочное устройство, которое способно применением одноосного или двухосного механическое напряжение в ткани инженерных конструкций изготовлены для трансплантации. Устройство может быть использовано в качестве биореакторов для выращивания в пробирке инженерных биокомпозитов или в качестве испытательного устройства для описания механических характеристик нативной ткани или после других видов лечения до. Устройство субъектов инженерии ткани конструкции для двухосной механической нагрузки с большой точностью из нагрузочной дозы (амплитуда и частота) и применение в самых разнообразных условиях культуры тканей от одного до 24-луночных планшетах.
Применение поперечной нагрузки представил ряд уникальных задач для проектирования этой системы. Чтобы максимально питательным передачи, конструкции изначально были в неограниченном отдельные лунки 24-луночный планшет. Это не представляет проблемы для динамического сжатия, так как деформация тары сжатие заверил, чтообразца плитами контакта не было потеряно. При деформации сдвига был добавлен к протоколу, однако, неограниченном образцов скользил вдоль нижней части пластины, а некоторые потеряли контакт с валиком. Кроме того, во время двухосной нагрузки протоколов образцы имели тенденцию к перевернуться, что приведет к несогласованности нагрузки. Мы решили эту проблему, создав агарозном скважин для иммобилизации образцов, как описано в процедуре. Эти агарозном скважин обеспечивает постоянное двухосном нагружении образцов, не ограничивая доступность питательных веществ в образцах.
В отличие от сжатия биореакторы, которые очень широко исследованы 20,21, наше устройство позволяет наносить точные штаммов на нескольких осях. Эти оси могут независимо контролироваться. Мультиаксиальные нагрузки может быть применен последовательно или одновременно. Это можно реализовать третий Y-оси, чтобы обеспечить механическую нагрузку в трех измерениях, чтобы лучше имитируют в естественных условиях.
В то время какдругие многоосных биореакторы были разработаны, чтобы имитировать механическое среды сустава, они имеют большие недостатки по сравнению с нашей системы. Сдвиге и сжатии аппарата по проекту Франка и др.. позволяет использовать до 12 образцов должны быть загружены одновременно с нагрузкой обратной связи, однако конструкции не ограничиваются или обеспечены 6. В ходе экспериментов с участием деформации сдвига, важно, чтобы конструкциями быть закреплены так, чтобы они не скользят под нагрузкой валиком. Раздвижные приводит к неравномерному и непоследовательной поперечной нагрузки образца. Новее биореакторы, таких как уникальный "катящийся шар" Система 22,23 и двухосных устройства стимуляции 16, создать гораздо более реалистичной и последовательной загрузки среды, однако они позволяют только один образец, который будет загружен в тот момент. Большие размеры образца имеют важное значение для выполнения необходимых биохимических, механических и гистологические анализы на конструкции с высокой степенью достоверности. Аддиtionally, "катящийся шар" системе не хватает обратной связи по усилию, важным мерилом развития конструкции в течение длительного срока культивирования в лабораторных условиях. Она также позволяет предотвращению валик-образца бесконтактного и образцы перегрузки, который может необратимо повредить ткани разработаны конструкции. Скользящий контакт биореактор разработанный Бянь, и др.. Позволяет до четырех конструкций должны быть загружены одновременно, но до сих пор нет этого ценного механизма обратной силы 17.
Текущей установки в 24-луночных планшетах позволяет одновременную загрузку 24 образцов; более образцов возможны модификации геометрии загрузки валиком. Загрузка валиком предлагает огромные гибкость новой конструкции. Выбранный материал является пористым полисульфона, могут быть стерилизованы и выращивали во влажной и теплой окружающей среде инкубатора. Это легко обрабатываемых, позволяя различные геометрии и количество образцов должны быть загружены одновременногоLY.
В заключение новых двухосных загрузки биореактора для тканевой инженерии позволяет долгосрочной перспективе в пробирке культивирование тканей инженерных конструкций. Двухосный загрузки увеличена протеогликанов и отложение коллагена и толщины ткани инженерные образцы хрящей, но не казались существенно влиять на механические свойства инженерии хрящей, как мы предположили. Одноосного сжатия увеличился как протеогликан осаждения и модуль Юнга. Мы считаем, что оптимальная доза механической нагрузки отличается клеток и тканей свойствами. Будущие исследования архитектуры коллагена и дозиметрии загрузки позволит нам в полной мере оценить влияние двухосной нагрузки на развитие инженерии тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа выполнена при поддержке Управления научных исследований и развития, RR & D службы департамента США по делам ветеранов, NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 и Министерство обороны W81XWH-10-1-0643.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. Bilgen, B., et al. 57th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (ORS), , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
