Summary
Vi har designet en roman mekanisk belastning bioreaktor, der kan anvende enaksede eller biaksial mekanisk belastning til en brusk biokomposit før transplantation ind i en ledbrusken defekt.
Abstract
Vi har designet en belastning enhed, der er i stand til at anvende énakset eller biaksial mekanisk belastning til en manipuleret væv biokompositter fabrikeret til transplantation. Mens enheden primært fungerer som en bioreaktor, der efterligner de native mekaniske belastninger, er det også udstyret med en vejecelle til tilvejebringelse force feedback eller mekanisk prøvning af konstruktionerne. Enheden emner manipuleret brusk konstruktioner til biaxial mekanisk belastning med stor præcision støddosis (amplitude og frekvens), og er kompakt nok til at passe inde i en standard vævsdyrkningsinkubator. Den indlæser prøver direkte i en vævskultur plade, og flere pladestørrelser er forenelige med systemet. Enheden er designet ved brug komponenter, som fremstilles for præcisionsstyrede laser applikationer. Bi-aksial belastning opnås ved to ortogonale etaper. Etaperne har en 50 mm vandring rækkevidde og drives selvstændigt af stepmotor aktuatorer, der styres afet lukket kredsløb stepmotor driver, der er udstyret med mikro-Stepping kapaciteter, så trin kornstørrelser på mindre end 50 nm. En polysulfon loading plade er koblet til bi-aksial bevægelse platform. Flytninger af etaperne er kontrolleret af Thor-labs Avanceret Positioning Technology (APT) software. Stepper motor driver bruges sammen med software til at justere belastningen parametre frekvens og amplitude af både forskydning og kompression uafhængigt og samtidigt. Positionsfeedback er leveret af lineære optiske målesystemer, der har en tovejs gentagelsesnøjagtighed på 0,1 um og en opløsning på 20 nm, oversætte til et positionel nøjagtighed på mindre end 3 m over det fulde 50 mm vandring. Disse givere yde den nødvendige position feedback til køreelektronikken at sikre ægte nanopositioning kapaciteter. For at tilvejebringe den force feedback at detektere kontakt og evaluere loading svar er en præcision miniature vejecelle anbragt mellem lastningen valsen og Moving platform. Vejecellen har høje nøjagtighed af 0,15% til 0,25% af fuld skala.
Introduction
Vi har designet en belastning bioreaktor, der er i stand til at anvende énakset eller biaksial mekanisk belastning til en manipuleret væv biokompositter fabrikeret til transplantation. Denne enhed er primært beregnet som en bioreaktor for manipuleret erstatninger for ledbrusk, kunne den også anvendes til andre bærende væv i den menneskelige krop. Vores motivation i denne bioreaktor design stammer fra Drachman og Sokoloff 1, der gjorde den skelsættende observation af unormal dannelse af ledbrusk i lammede kyllingeembryoer grundet fravær af bevægelse. Tilsvarende motion er afgørende for udviklingen af normale muskler og knogler. I overensstemmelse med dette koncept, har mange forskergrupper undersøgt, hvordan forskellige former for fysiske stimuli under in vitro dyrkning modulerer de biokemiske og mekaniske egenskaber af celle-biomateriale biokompositter og væv eksplanteret 2-7. Begrebet funktionelle vævsmanipuleringinvolverer in vitro-anvendelse af mekaniske stimuli for at forbedre de funktionelle egenskaber af væv, dvs de mekaniske egenskaber, der gør det muligt for vævet at modstå den forventede in vivo-stress og pres 8,9. Talrige undersøgelser indberette anvendelsen mekanisk belastning i form af forskydning og kompression til at stimulere manipuleret brusk konstruktioner for artikulær leddene. Mauck et al. 10. tyder på, at mekanisk belastning alene kan inducere chondrogenese af mesenkymale stamceller, selv i fravær af vækstfaktorer, der anses afgørende. Anvendelse af intermitterende mekanisk belastning, såsom kompression eller forskydning under væv dyrkning har vist sig at modulere brusk og knogledannelse, men den optimale dosimetrien lastningen afviger med celler og væv egenskaber 11.
Den vigtigste funktion af ledbrusk er evnen til at modstå tryk-og forskydningskræfter undersamlingen, derfor har det at have høj trykstyrke og shear moduli. Manglen på funktionelle mekanisk styrke og fysiologiske ultrastruktur i manipuleret brusk har resulteret i opdeling neo-brusk in vivo og svigt af brusk udskiftning strategier i leddene. Selvom kompression og forskydning er blevet almindeligt påvist at modulere og forbedre mekaniske styrke af ledbrusken biokompositter, en kombination tilgang er sjælden 6,12-15. Wartella og Wayne 16 designet en bioreaktor, der blev anvendt spænding og kompression til at producere menisk brusk udskiftninger. Waldman et al. 15. konstrueret en anordning til at anvende kompression og forskydning til chondrocytter dyrket i et porøst calcium polyphosphat substrat. Bian et al. 17 viste mekaniske egenskaber matcher nativ brusk med in vitro dyrkning af voksne hunde chondrocyter i geler og anvendelse af biaksial mechnisk belastning (trykstyrke deformational lastning og glidende kontakt belastning).
Den biaxial mekanisk belastning bioreaktor blev oprindeligt designet af Danielle Chu i vores laboratorium med det overordnede mål at fremkalde morfologiske tilpasninger manipuleret væv brusk konstruerer resulterer i højere tryk-og shear moduli end i øjeblikket tilgængelige 18 år. Vi tror denne forskning vil øge vores bredere forståelse af, hvordan mechanotransduction kan moduleres til ingeniør klinisk relevante væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Biaksial Loading bioreaktor Design
- Bioreaktoren beskæftiger to etaper fremstillet af Thor-labs (Newton, MA) for præcisionsstyrede laser applikationer til påføring enaksede eller biaksial mekanisk belastning til manipuleret væv, med stor præcision støddosis (amplitude og frekvens) og anvendelse på en bred vifte af vævskulturbetingelser fra enkelt til 24 brønde (figur 1).
- Bi-aksial belastning opnås ved to travelmax faser (LNR50SE). Disse stadier er monteret vinkelret på en XZ-konfiguration. Den vandrette trin giver dynamiske klipning bevægelser ved oscillerende langs X-aksen. Den lodrette trin giver dynamisk trykbelastning ved oscillerende langs Z-aksen. Disse stadier har en 50 mm vandring rækkevidde og drives selvstændigt af stepmotor aktuatorer (DRV014), der kontrolleres af et lukket kredsløb stepmotor driver (BSC102), at funktioner mikro-Stepping kapaciteter, så trin kornstørrelser på mindre end50 nm.
- Enheden er monteret på en stiv 25 cm x 30 cm x 12,5 mm aluminium bundplade, der bruges som en platform til samling af maskinkomponenter og til montering af vævskulturplader. Justerbare kinematiske stop bruges til at låse vævskulturplader på plads på aluminium bundplade. Disse kinematiske stopper har fine justeringsskruer at give mulighed for præcis justering, der ellers ikke kan opnås i hånden. Det modulære design af bundpladen muliggør fleksibel placering af disse kinematiske stop til at rumme plader af forskellige størrelser og former (petriskåle vs multi-brøndsplader).
- En custom-fræsede polysulfon loading glaspladen er koblet til bi-axial bevægelse platform via en præcision-bearbejdede ret vinkel beslag. Polysulfon materiale blev valgt på grund af dets biokompatibilitet, let bearbejdning og let sterilisation.
- Flytninger af etaperne er kontrolleret af Thor-Labs 'Advanced Positioning Technology (APT) software. Den stepmotor driver er osed i kombination med software, der tillader justering af belastning parametre frekvens og amplitude af både forskydning og kompression uafhængigt og samtidigt.
- Positionsfeedback er leveret af lineære optiske målesystemer, der er knyttet til hver bevægende platform og er integreret med softwaren. Det encoder system har en tovejs gentagelsesnøjagtighed på 0,1 um og en opløsning på 20 nm, oversætte til et positionel nøjagtighed på mindre end 3 m over fulde 50 mm vandring. Disse givere yde den nødvendige position feedback til køreelektronikken at sikre ægte nanopositioning evner og en direkte udlæsning af den absolutte position.
- For at tilvejebringe den force feedback nødvendig til påvisning kontakt mellem valsen og prøver og evaluere lastning reaktioner, en præcision miniature vejecelle (Honeywell model 31) er placeret mellem lastningen valsen og den bevægelige platform (figur 2). Vejecellen har høje nøjagtighed af0,15% til 0,25% af fuld skala. Displayenheden (SC500) for vejecellen kan også yde load målinger af op til 5 decimaler. Derudover har en RS-232 port til indsamling af data om en computer.
2.. Cell-seedede Agarose Constructs
- Forbered 4% agarose: Tilsæt 0,8 g agarose til 20 ml DMEM (ingen tilsætningsstoffer) i en 50 ml kolbe, kog, og derefter holde i 70 ° C varm ovn indtil brug.
- Justere lydstyrken af cellesuspension for dobbelt mængde af den ønskede celle podningstæthed. Denne suspension blandes med samme volumen 4% w / v agarose at skabe en 2% agarosegel ved den ønskede podningstæthed.
- Placer både cellesuspensionen og en 10 ml pipette i inkubatoren.
- Opsæt gelstøbning systemet. Et 1,5 mm og en 0,75 mm spacer pladen skal sættes sammen for at skabe en 2,25 mm tyk gel. Andre størrelse spacer pladerne kan bruges til at skabe forskellige gel tykkelser. Gel støbning system er ikke stor nok til at holde disse plader togethende, så de skal være forsvarligt tapes for at forhindre lækage.
- Det næste skridt er at mikse cellesuspensionen med den tidligere fremstillede agarose og pipetten ind i gelen formen, før agarosen størkner. Fjern væsken agarose fra ovnen og placere en steril termometer i det. Agarosen skal afkøles til 42-43 ° C, før blanding med cellerne. Varm op cellesuspensionen til 37 ° C. Når agarosen hits 43 ° C, hurtigt pipetteres op den ønskede mængde og derefter straks pipettere cellesuspensionen op og ned et par gange for at blande. Derefter straks pipettere hele blandingen i gelen formen.
- Lad gelen størkne i 10-15 min og derefter forsigtigt vippe den til en vandret position.
- Fjern det øverste glasplade og punch diske med biopsi punch. Diskene kan afhentes med en lille steril spatel. Det er vores erfaring, var en 9 ml gel stor nok til at gøre mere end hundrede 5 mm diameter skiver.
3.. Kultur af harddiske
4.. Immobilisering af prøver for Mekanisk Loading
- Forbered 4% agarose (ingen celle suspension tilføjes), og gelen skal være tyndere end de prøver, selv (for at undgå interferens under belastning). Den anbefalede tykkelse er 1,5-1,9 mm (til 2,25 mm tykke prøver).
- Når geleret hulning 16 mm diameter diske til plader med 24 brønde. I hver disk, for punch én 5 mm hul til prøven placeres i. Hvis det ønskes, punch anden 5 mm hul på kanten af disken for pipetten skal placeres under medieændringer.
- Når agarose brønde er blevet gjort, sted i 24-brønds plade, som vist i figur 3..
- Når agarosen walen er i 24-brønds plade, prespasning prøver i hver brønd. Prøven skal rage op fra toppen af agarose godt.
5.. Mekanisk Loading
- Sterilisere valsen (figur 2).
- Fastgør aluminiumsplade at indlæse celle. Sikker lastning glaspladen / vejecelle / aluminiumsplade forsamling til scenen.
- Tænd stepper motor controller (switch i ryggen).
- Tænd PC og åbne "APT User"-programmet (Figur 4).
- Venstre skærm styrer vandret stepmotor. Højre skærm styrer lodret stepmotor. I hvert skærmbillede, "Grafisk Control" fanebladet giver mulighed for manuel positionering og "Flyt Sequencer" fanen giver mulighed for automatisering. Alle enheder er mm.
- Gå til "Grafisk Control" fane på begge skærme, og tryk på "Home / Zero"-knappen. Begge stepmotorer har en række på 50 mm. Ved at trykke "Home / Zero" vil sende både stepmotorer til nul-position (top og højre fleste positioner).
- Prepare prøverne i 24 brønde til ilægning ved at fjerne nogle medier fra hver brønd. Ikke mere end 1 ml af medier bør overlades i hver brønd for at forhindre overløb under lastning. Vær sikker på, at nok medier er tilbage i brønden for at holde prøven dækket.
- Bemærk, at kuvøsen er holdt i lav luftfugtighed for at undgå instrument fiasko.
- Place plade med 24 brønde i bioreaktor og omhyggeligt linje med valsen.
- Pladen er fastgjort til bioreaktoren ved hjælp af fire indstillelige kinematiske lokatorer. For at gøre det nemmere at line op glaspladen, har to venstre locators blevet præ-placeret. Stram de to højre locators således at pladen er sikker. Sørg for at beklæde pladen op flugter med forsiden af bioreaktorens basen.
- I "Grafisk Control" fane kan en specifik stepmotor position indtastes manuelt ved at klikke på position kassen. Brug denne evne til langsomt sænke glaspladen, og flyt den vandret for at line op med plade. </ Ol>
- Når pladen er tæt på at komme i kontakt med prøver, begynde at bringe pladen ned i meget langsom trin (0,1 mm), indtil du når den forudbestemte udgangsposition (se del 6).
- Når startpositionen er nået, gå til "Move Sequencer" fanen og indlæse den ønskede flytte sekvens ved at trykke på "Load". Tryk derefter på "Kør" for at starte. (Figur 5) Se del 7. Skrivning af en dosering protokol.
- Når du er færdig læsning, manuelt hæve valsen. Hvis der prøver fast på glaspladen, forsigtigt sætte dem tilbage i den relevante brønd med en steril spatel.
- Fjern plade med 24 brønde fra bioreaktoren og erstatte medierne.
- Fjern forsigtigt glaspladen fra vejecelle og derefter slukker instrumenter.
6.. Kalibrering Loading Platen
For at sikre at de korrekte stammer anvendes til prøver, skal hver pladen omhyggeligt kalibreret før start et eksperiment.
- Manuelt sætte vandret stepmotor på 25 mm position.
- Omhyggeligt nedre plade indtil det lige netop kommer i kontakt med bunden af bioreaktoren. Vejecelle vil vise øgede belastninger på dette punkt. Vær opmærksom på den nøjagtige position af den lodrette stepmotor (være så præcis som muligt, da alle komprimering stamme målinger vil blive beregnet ud fra denne værdi).
- Optag position. Denne værdi vil blive brugt til at skrive en dosering protokol baseret på prøve dimensioner og ønskede stammer.
7.. Skrivning af en dosering protokol
- Bioreaktoren er i stand til at anvende både sammenpressende og forskydningstøjning, enten samtidigt eller individuelt. De tre vigtigste parametre skal afgøres: Tara trykstyrke belastning, dynamisk belastning amplitude og lastning frekvens.
- En tara stamme anvendes for at forhindre liftoff af trykpladen fra prøven.
- Sample dynamisk belastning amplitude og lastning frefrekvens er valgt.
I denne undersøgelse definerer vi trykstyrke og forskydningstøjning som følger: 
Eksempel Biaksial dosering protokol
Prøve tykkelse: 2.25 mm
Tara Strain (kompression): 10% af prøven tykkelse (0,225 mm)
Dynamisk Strain Amplitude (kompression): 10% (+ / - 5% af prøvens tykkelse)
Frekvens (kompression): 1 Hz
Dynamisk Strain Amplitude (Shear): 25% af prøven tykkelse (0,5625 mm): forskydningsspænding
påføres prøven ved valsen bevæger sig vandret.
Frekvens (Shear): 0.5 Hz
Typisk dosering protokol er 3 timer for lastningen pr.
I dette eksempel er dynamisk og forskydningskraft påføres samtidigt og ikke sekventielt. Vi mener, at dette mønster bedre mimics det komplekse belastningsmiljø i den menneskelige knæ.
- Når først en dosering protokol er blevet valgt, skal en kompressions flytte sekvens program blive skrevet.
- Flytningen sekvens er præcis, hvad det lyder som, en liste over positioner, at stepmotor vil flytte til ved et nærmere angivet acceleration og maksimal hastighed.
- Beregne ønskede lodrette positioner baseret på dosering protokol og valsen kalibrering værdi (fra del 6).
- Eksempel beregninger til Platen 1 er angivet nedenfor:
| Forskel fra kalibreringsværdi | Lodret position | |
| Platen Calibration Value (rører bunden af bioreaktor) | 0 mm | 29,7700 mm |
| Platen får kontakt med Sample (2,25 mm prøve) | 4,4140 mm | 25,3560 mm |
| Stregn (5% Tykkelse) | 4,3015 mm | 25,4705 mm |
| Stamme (10% Tykkelse) | 4,1890 mm | 25,5810 mm |
| Stamme (15% Tykkelse) | 4,0765 mm | 25,6955 mm |
- Når positioner er beregnet, eksperimentere med acceleration og maksimal hastighed værdier for at få den rigtige frekvens. Antallet af cyklusser bør vælges derfor (f.eks 10.800 cykler i 3 timer ved 1 Hz).
- Eksempel Dynamisk komprimering Flyt Sequence Program (10% tara kompression, 10% dynamisk belastning amplitude, 1 Hz) (figur 5)
- Dynamisk shear flytte sekvens program: Antallet af cyklusser skal vælges i overensstemmelse med den ønskede frekvens og varighed (f.eks 5.400 cykler i 3 timer ved 0,5 Hz).
- Eksempel Dynamisk Shear Flyt Sequence Program (10% tara kompression, 0,5625 mm (25% af tykkelsen) dynamisk forskydningstøjning amplitude, 0,5Hz) (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anordningen blev testet ved hjælp af agarosegeler podet med 20 millioner celler / ml chondrocytter og dyrket i nærvær af enaksede (kompression) eller biaksial (kompression og forskydning) mekanisk belastning. Primære porcine chondrocyter blev isoleret fra ledbrusken i 2-4 måneder gamle grise. 5 mm i diameter og 1,5 mm tykke prøver blev dyrket i 2 ml definerede chondrogent dyrkningsmedium (High glucose DMEM, 1% ITS + Premix 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 2,5 ug / ml amphotericin B, 50 ug / ml ascorbinsyre, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 0,4 mM prolin,) i plader med 24 brønde ved 37 ° C, 5% CO2. 10 -7 M dexamethason og 10 ng / ml TGF-β1 blev leveret i de første 10 dage af kultur. Prøverne blev lagt i til 3 timer / dag mellem dag 10-30. Enakset lastning bestod af 10% kompression spids-til-spids-amplitude, bestod 1 Hz og biaksial belastning på 0,15 mm (10% tykkelse) komprimering og 0,075mm shear peak-to-peak amplitude, 1 Hz. Den dynamiske belastning amplitude og lastning frekvens er valgt på grundlag af offentliggjorte undersøgelser 17,19. Ved udgangen på 30 dage biokemiske og mekaniske egenskaber manipuleret brusk blev vurderet.
Denne undersøgelse beskæftigede tre grupper: 1 - Ingen lastning kontrol, 2 - Uniaxial (trykstyrke) loading, 3 - Biaksial (trykstyrke og shear) loading. DNA indhold og de våde vægt af konstruktioner forblev ens i de tre grupper efter 30 dages dyrkning (p> 0,05). GAG indholdet var højest i den gruppe, der blev udsat for biaksial belastning (gruppe 3, p <0,001 sammenlignet med kontrolgruppen), efterfulgt af den enaksede belastning (gruppe 2, p <0,05) (figur 6). Gag indhold af gruppe 2 og 3 svarer til 48% og 50% af nativ brusk, hhv. Gruppe 3 resulterede i signifikant højere mængde kollagen end gruppe 1 og 2 (p <0,01). Gruppe 2 havde også tykkere konstruktioner than gruppe 1 (p <0,01). Overraskende ligevægten trykstyrke Youngs modul var den højeste i gruppe 2 (enaksede lastning, p <0,01), og der var ingen signifikante forskelle mellem gruppe 3 og 1. Den Youngs modul i gruppe 2 svarede til 60,1% af indfødte svin brusk.
De histologiske analyser viste positiv og homogen farvning for glycosaminoglycaner (Alcian blå, safranin O) og type II-collagen (fig. 7). Alle grupper farves negativ for kollagen type I (ikke vist).
Sammenfattende tyder disse foreløbige resultater, at denne bioreaktor anvendt med succes kompression og toakset (kompression og shear) mekanisk belastning ved langtids dyrkning af gensplejsede væv. I denne undersøgelse biaksial belastning blev vist til proteoglycan og collagenaflejring og tykkelsen af vævet manipuleret brusk prøver. Enakset kompression steg både proteoglycan aflejring og Youngs modul.
Figur 1. Biaksial belastning opnås ved X-trin (klipning) og Z-trin (komprimering). Figuren viser en skræddersyet loading trykpladen knyttet til de faser at indlæse prøver i en 24-brønds plade. De lastning parametre styres med en computer tilsluttet til stepmotorer 18.
Figur 2. Venstre: Polysulfonen loading plade designet til 24-brønds plader. Til højre: lastning glaspladen tilknytning til biaxial lastning bioreaktor.
Figur 3. Udarbejdelse af agarose brønde til immobilisere prøver under forskydningslast. Det immobiliserede konstruktion placeret i agarose godt for mekanisk belastning. Denne figur viser en 1,5 mm tyk agarose godt og en 2,25 mm tyk prøve.
Figur 4.. Den grafiske brugergrænseflade til at styre biaxial læsseindretningen. Klik her for at se større figur .
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50387/50387fig5.jpg "/>
Figur 5. Eksempel Biaksial Loading Move Sequence Program Graphical User Interface: Dynamisk Compression Move Sequence Program (10% tara kompression, 10% dynamisk belastning amplitude, 1 Hz) og Dynamic Shear Move Sequence Program (10% tara kompression, 25% dynamisk forskydning belastning amplitude, 0,5 Hz). Klik her for at se større figur .
Figur 6.. Biokemiske og mekaniske testresultater (n = 6) *** p <0,001, ** p <0,01, * p <0,05 sammenlignet med gruppe 1 (ubelastede kontrol Gruppe 2:.. Uniaxial trykbelastning gruppe 3: Biaxial trykstyrke og forskydning lastning.
Figur 7. Histologi: Alcian blå / nukleare hurtig rød farvning Safranin O / hurtig grøn, immunkemi for type II-collagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har designet en belastning enhed, der er i stand til at anvende énakset eller biaksial mekanisk belastning til manipuleret væv konstruktioner fremstillet til transplantation. Enheden kan anvendes som en bioreaktor til in vitro dyrkning af industrielt biokompositter eller som en testindretning til at beskrive de mekaniske egenskaber af det native væv eller efter andre behandlinger før. Enheden emner manipuleret vævskonstruktioner til biaxial mekanisk belastning med stor præcision bolusdosis (amplitude og frekvens) og anvendelse på en bred vifte af vævskulturbetingelser fra én til 24 brønde plader.
Anvendelsen af forskydningslast præsenterede et sæt af unikke udfordringer for udformningen af dette system. At maksimere næringsstof overførsel blev konstruktioner oprindeligt unconfined i individuelle brønde i en plade med 24 brønde. Dette ikke udgør et problem for dynamisk kompression, som tara trykstyrke stammen forsikret, atprøve-glaspladen kontakten blev ikke tabt. Når forskydningstøjning sattes til protokollen imidlertid indesluttet prøver gled langs bunden af pladen og nogle mistet kontakten med valsen. Desuden blev der i biaksiale lastning protokoller prøver havde en tendens til at vende i løbet, der forårsager inkonsekvent belastning. Vi løst dette problem ved at skabe den agarose brønde til at immobilisere prøver som beskrevet i proceduren. Disse agarose brønde tillader konsekvent toakset belastning af prøver uden at begrænse tilgængeligheden af næringsstoffer til prøver.
I modsætning til de kompression bioreaktorer, der er meget udbredt forsket 20,21, er vores enhed i stand til at anvende præcise stammer på flere akser. Disse akser kan styres uafhængigt. Multiaksial belastning kan anvendes sekventielt eller samtidigt. Det er muligt at gennemføre en tredje Y-aksen for at tilvejebringe mekanisk belastning i tre dimensioner for at efterligne in vivo betingelser.
Mensandre multiaksial bioreaktorer er blevet udviklet til at efterligne den mekaniske miljø af leddet, de har store begrænsninger i forhold til vores system. En forskydning og kompression apparat designet af Frank et al. tillader op til 12 prøver, der skal lastes samtidig med load feedback, er dog konstruktioner ikke begrænset eller sikret 6.. Under forsøg med forskydningstøjning, er det vigtigt, at konstruktionerne fastgøres, så det ikke glider under lastning valsen. Glidende vil resultere i ujævn og usammenhængende forskydningskraft af prøven. Nyere bioreaktorer, såsom unikke "rullende kugle"-system 22,23 og en biaksial stimulering anordning 16, skabe et langt mere realistisk og konsistent belastningsmiljø, men de tillader kun én prøve, der skal lastes på et tidspunkt. Store prøvestørrelser er afgørende for at udføre de nødvendige biokemiske, mekaniske og histologiske analyser af konstruktioner med en høj grad af tillid. Additionelt, "rullende kugle"-system mangler force feedback, et vigtigt middel til konstruktion udvikling gennem langsigtede in vitro dyrkning. Det giver også mulighed for forebyggelse af glaspladen-modellen ikke-kontakt og modellen overbelastning, som vil uoprettelig skade manipuleret væv konstruktioner. En glidende kontakt bioreaktor udviklet af Bian, et al. Tillader op til fire konstruktioner, der skal lastes på samme tid, men stadig mangler denne værdifulde force feedback-mekanisme 17..
Den nuværende opsætning med plader med 24 brønde tillader samtidig lastning af 24 prøver flere prøver er mulige med modifikationer af geometrien af lastning valsen. Belastningen glaspladen giver enorme fleksibilitet nye design. Det valgte materiale polysulfon er porøs, kan steriliseres og dyrkes i fugtige og varme omgivelser i en inkubator. Det er let bearbejdelig, der muliggør en bred vifte af geometrier og antallet af prøver, der skal lastes samtidigely.
Som konklusion, gør den nye biaxial lastning bioreaktor for tissue engineering langsigtet in vitro dyrkning af manipuleret væv konstruktioner. Biaksial belastning øget proteoglycan og kollagen deposition og tykkelsen af manipuleret væv brusk prøver, men synes ikke at have væsentlig indflydelse på mekaniske egenskaber af manipuleret brusk, som vi hypotese. Enaksede kompression øget både proteoglycan deposition og Youngs modul. Vi mener, at den optimale dosis af mekanisk belastning er forskellig med celler og væv egenskaber. Fremtidige studier af kollagen arkitektur og dosimetri for lastning vil give os mulighed for fuldt ud at evaluere effekten af biaksial belastning på udviklingen af manipuleret væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Kontoret for forskning og udvikling, RR & D-service, US Department of Veterans Affairs, NIH Cobre 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 og Department of Defense W81XWH-10-1-0643.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. Bilgen, B., et al. 57th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (ORS), , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
