Summary
Biz eklem kıkırdağı kusur içine önce nakli için bir kıkırdak biokompozit için tek eksenli veya çift eksenli mekanik zorlanma uygulayabilirsiniz yeni bir mekanik yüklenme biyoreaktör tasarlanmıştır.
Abstract
Biz nakli için üretilmiş bir doku mühendislik Biocomposites için tek eksenli veya çift eksenli mekanik zorlanma uygulama kapasitesine sahip bir yükleme cihazı tasarlanmıştır. Cihaz öncelikle yerli mekanik suşları taklit eden bir biyoreaktör olarak görev yaparken, aynı zamanda force feedback ya da yapıları mekanik test sağlamak için bir yük hücresi ile donatılmış. Cihaz konular yükleme dozunun büyük bir hassasiyetle (genlik ve frekans) ile iki eksenli mekanik yükleme için kıkırdak yapıları tasarlanmış ve standart bir doku kültürü inkübatör içine sığacak kadar küçük. Bu, doğrudan bir doku kültürü plakası örnekleri yükler ve birden çok plaka boyutları sistemi ile uyumludur. Cihaz hassas güdümlü lazer uygulamaları için üretilen bileşenler kullanılarak tasarlanmıştır. Bi-eksenel yükleme iki dik aşamada gerçekleştirilir. Aşamaları bir 50 mm seyahat yelpazesi var ve step motor tahrik tarafından bağımsız olarak tahrik edilir, tarafından kontrolaz 50 nm adım boyutları sağlayan, mikro-step yetenekleri özellikleri bir kapalı devre step motor sürücüsü. A polisülfon yükleme levhanın iki eksenel hareket eden bir platform ile birleştirilmiştir. Aşamaları hareketleri Thor-laboratuarları Gelişmiş Konumlandırma Teknolojisi (APT) yazılımı tarafından kontrol edilir. Step motor sürücü frekans ve kayma ve bağımsız olarak ve aynı anda sıkıştırma hem genlik yük parametrelerini ayarlamak için yazılım kullanılır. Konumsal geri seyahat tam 50 mm üzerinde en az 3 mikron bir pozisyon doğruluğu çevirme, 0.1 mikron bir çift yönlü tekrarlanabilirlik ve 20 nm çözünürlüğe sahip lineer optik kodlayıcı tarafından sağlanmaktadır. Bu kodlayıcılar gerçek nanopositioning yetenekleri sağlamak için sürücü elektronik için gerekli pozisyon geri besleme sağlar. Tespit etmek için güç geri besleme yükleme yanıtları temas ve değerlendirme sağlamak amacıyla, hassas bir minyatür bir yük hücresi yükleme levha ve hareket ediyor arasında konumlandırılmışg platformu. Yük hücresi 0.15% 0.25% tam ölçek yüksek doğruluk vardır.
Introduction
Biz nakli için üretilmiş bir doku mühendislik Biocomposites için tek eksenli veya çift eksenli mekanik zorlanma uygulama kapasitesine sahip bir yükleme biyoreaktör tasarladık. Bu cihaz, esas olarak eklem kıkırdağı için tasarlanmış değiştirmeleri için bir biyoreaktör olarak tasarlanmış olup, bu, aynı zamanda, insan vücudu içinde başka yük taşıyan dokular için kullanılabilir. Bu biyoreaktör tasarım bizim motivasyon hareket olmaması nedeniyle felç civciv embriyolarında eklem kıkırdak anormal oluşumu seminal gözlem yapılan Drachman ve Sokoloff 1, kaynaklanıyor. Benzer şekilde, fiziksel egzersiz normal kas ve kemik gelişimi için gereklidir. Bu konsept doğrultusunda, birçok araştırma grupları laboratuarda sebze yetiştirme sırasında fiziksel uyaranların ne kadar farklı modları araştırdık hücre-biyomalzeme Biocomposites ve doku eksplant 2-7 biyokimyasal ve mekanik özellikleri modüle. Fonksiyonel doku mühendisliği kavramıdokuların fonksiyonel özelliklerini artırmak için mekanik uyaranlara in vitro kullanımı içerir, doku in vivo stres beklenen dayanacak ve 8,9 zorlanma sağlayan mekanik özellikleri yani. Çeşitli çalışmalar eklem eklem için tasarlanmış kıkırdak yapıları teşvik etmek için kesme ve sıkıştırma açısından kullanımı mekanik yükleme rapor. Mauck ve ark. 10 sadece mekanik yükleme daha önemli kabul edilir, büyüme faktörlerinin yokluğunda mezenkimal kök hücreler, kıkırdak doku neden olduğunu ortaya koymaktadır. Bu tür doku işleme sırasında sıkıştırma veya kesme gibi aralıklı mekanik yükleme uygulaması kıkırdak ve kemik oluşumunu modüle ettiği gösterilmiştir, ancak yükleme optimum dozimetri hücre ve doku özellikleri 11 ile farklıdır.
Eklem kıkırdağı en önemli fonksiyonu içinde basınç ve kesme kuvvetlerine karşı yeteneğidirortak, bu nedenle yüksek basınç ve kesme modülü sahip olması gerekir. Mühendislik kıkırdak fonksiyonel mekanik dayanım ve fizyolojik ultrastrüktür eksikliği in vivo neo-kıkırdak üzerinde arıza ve eklemlerde kıkırdak değiştirme stratejilerinin başarısızlıkla sonuçlandı. Sıkıştırma ve kesme yaygın modüle ve eklem kıkırdağı Biocomposites mekanik gücünü artırmak için gösterilmiştir olmasına rağmen, bir arada yaklaşım nadir 6,12-15 olduğunu. Wartella ve Wayne 16 menisküs kıkırdak yerine üretmek için gerilim ve sıkıştırma uygulanan bir biyoreaktör tasarlanmıştır. Waldman ve ark. 15 gözenekli bir kalsiyum polifosfat yüzey kültüre kondrosit sıkıştırma ve kesme uygulamak için bir cihaz tasarlanmış. Bian ve ark. 17 in vitro jeller yetişkin köpek kondrosit ekimi ve çift eksenli mekanik uygulama ile yerli kıkırdak eşleşen mekanik özellikler göstermiştiranical yükleme (basınç deformasyon yükleme ve sürgülü temas yükleme).
Iki eksenli mekanik yüklenme biyoreaktör ilk doku mühendisliği kıkırdak morfolojik uyarlamalar ikna etmek için genel amacı ile laboratuarımızda Danielle Chu tarafından tasarlanan mevcut 18 daha yüksek basınç ve kesme modülü ile sonuçlanan oluşturur. Bu araştırmanın önemli mechanotransduction klinik dokulara mühendisi modüle ne kadar bizim geniş bir anlayış artacağına inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. İki eksenli Yükleniyor Biyoreaktör Tasarım
- Biyoreaktör büyük yükleme dozunun hassas (genlik ve frekans) ve çok çeşitli uygulama ile, mühendislik dokulara tek eksenli veya çift eksenli mekanik zorlanma uygulamak için hassas güdümlü lazer uygulamaları için Thor-laboratuarları (Newton, MA) tarafından üretilen iki aşamada istihdam Tek bir 24 oyuklu plakalar (Şekil 1) için doku kültürü koşulları.
- Bi-eksenel yükleme iki travelmax aşamada (LNR50SE) gerçekleştirilir. Bu aşamalar bir XZ yapılandırmasında dikey olarak monte edilir. Yatay aşama X ekseni boyunca salınım yapan dinamik kesme hareketleri içerir. Dikey aşamada Z ekseni boyunca salınan tarafından dinamik basınç yükleme sağlar. Bu aşamalar daha az adım boyutları sağlayan, bir 50 mm seyahat aralığı vardır ve mikro-step yetenekleri özellikleri bir kapalı devre step motor sürücüsü (BSC102) tarafından kontrol step motor tahrik (DRV014), bağımsız olarak tahrik edilir50 nm.
- Cihaz, bir katı 25 cm üzerine monte edilir x 30 cm x 12,5 makine elemanlarının montajı için bir platform olarak ve doku kültürü plakaları monte etmek için kullanılan mm kalınlığında alüminyum taban plakası. Ayarlanabilir kinematik durur alüminyum taban plakası üzerinde yerinde doku kültürü plakaları kilitlemek için kullanılır. Bu kinematik durur aksi elle elde değil tam bir bağlantı için izin vermek için ince ayar vidası var. Taban plakasının modüler tasarımı farklı boyut ve şekillerde (Petri kapları vs çok iyi plakaları) plakaları karşılamak için bu kinematik durak esnek yerleştirme sağlar.
- Özel bir işlenmiş polisülfon yükleme merdane bir hassas işlenmiş sağ açılı ayraç ile iki eksenli hareketli platform bağlanmıştır. Polisülfon malzeme işleme kolaylığı ve sterilizasyon kolaylığı, nedeniyle biyouyumluluk için seçildi.
- Aşamaları hareketleri Thor-laboratuarları 'Gelişmiş Konumlandırma Teknolojisi (APT) yazılımı tarafından kontrol edilir. Step motor sürücüsü bizizFrekans ve kesme kuvveti ve bağımsız bir şekilde ve aynı anda her iki sıkıştırma amplitüdünde yük parametreleri ayarına izin verir yazılımı ile birlikte ed.
- Konumsal geribildirim her hareketli platform bağlı olan ve yazılım ile entegre lineer optik kodlayıcı tarafından sağlanmaktadır. Enkoder sistemi seyahat tam 50 mm üzerinde en az 3 mikron bir pozisyon doğruluğu çevirme, 0.1 mikron bir çift yönlü tekrarlanabilirlik ve 20 nm çözünürlüğe sahip. Bu kodlayıcılar gerçek nanopositioning yetenekleri sağlamak için sürücü elektronik ve mutlak konum doğrudan bir okuma için gerekli pozisyon geri besleme sağlar.
- Merdanenin numuneleri arasındaki teması ortaya çıkarmak için gerekli olan güç geri besleme sağlamak ve yükleme yanıtları, yükleme levha ve hareketli platform (Şekil 2) arasında yerleştirilmiş olan bir hassas minyatür bir yük hücresi (Honeywell modeli 31) değerlendirilmesi için. Yük hücresi yüksek doğrulukları vardır0.15% 0.25% tam ölçek. Yük hücresi için gösterge ünitesi (SC500) da 5 ondalık basamağa kadar yük ölçümleri sağlayabilir. Ayrıca, bir bilgisayarda veri toplama için izin vermek için bir RS-232 bağlantı noktası var.
2. Hücre-Tohumlu Agaroz Yapıları
- % 4 agaroz hazırlanması: 20 ml 50 ml'lik bir şişe içinde DMEM (hiçbir katkı maddesi), kaynamış ve daha sonra 70 tutulması kullanılana kadar ° C fırın ile 0.8 g agarozun ekleyin.
- İstenilen hücre tohumlama yoğunluğunun iki katı için hücre süspansiyonu ses seviyesini ayarlayın. Bu süspansiyon, istenen tohum yoğunluğu bir% 2 agaroz jel oluşturmak için% 4 w / v agaroz arasında eşit bir hacmi ile karıştırılır.
- Inkübatör hücre süspansiyonu ve bir 10 ml pipet hem yerleştirin.
- Jel döküm sistemi kurun. Bir 1.5 mm ve bir 0.75 mm mesafe plakası bir 2.25 mm kalınlığında jel oluşturmak için bir araya koymak gerekir. Diğer boyutu mesafe tabanları farklı jel kalınlıklarda oluşturmak için kullanılabilir. Jel döküm sistemi bu plakalar toget tutacak kadar büyük değildironu, bu yüzden güvenli bir sızıntı önlemek için bantlanmış olmalıdır.
- Bir sonraki adım, agaroz katılaşır önce hızlı bir şekilde jel kalıp içine önceden hazırlanmış ve agaroz pipet ile hücre süspansiyonu karıştırmaktır. Fırından sıvı agaroz çıkarın ve steril bir termometre yerleştirin. Agaroz ° C hücreleri ile karıştırılmadan önce 42-43 kadar soğutulması gerekir. 37 ° C için hücre süspansiyonu Isınma Agaroz 43 vurur sonra ° C, hızlı bir şekilde istenen miktarda pipet ve hemen karıştırmak için birkaç kez aşağı hücre süspansiyonu kadar pipet ve. Sonra derhal jel kalıp içine tüm karışım pipetle.
- Jel 10-15 dakika sağlamlaştırmak ve daha sonra dikkatli bir şekilde yatay konuma yatırmak için izin verin.
- Üst cam levha ve biyopsi yumruk ile yumruk diskleri çıkarın. Diskler küçük steril spatula ile alınabilir. Deneyimlerimiz, 9 ml jel yüzden fazla 5 mm çaplı diskler için yeterince büyük.
3. Kültür Diskler
4. Mekanik Yükleme için Örnekler immobilizasyonu
- % 4 agaroz (herhangi bir hücre süspansiyonu ilave edildi) ve jel örneklerine (yükleme sırasında parazit oluşumunu önlemek için) daha ince olması gerekmektedir hazırlayın. Tavsiye edilen kalınlığı 1.5-1.9 mm (2.25 mm kalınlığında örnekler için) 'dir.
- Bir kez 24 kuyucuğu için yumruk 16 mm çapında diskler, jel. Eğer arzu edilirse her diskin, numune için kesme bir 5 mm delik açma, ortam değişiklikleri esnasında yerleştirilmesi için pipet için disk kenarında bir 5 mm delik içeri yerleştirilmesi için.
- Sonra agaroz kuyu 24 plaka yeri olarak Şekil 3'te gösterildiği gibi, yapılmıştır.
- Agaroz w kezarşın 24 plaka olan, her iyi örnekleri uyum basın. Örnek agaroz de üstünden çıkıntı yapmalıdır.
5. Mekanik Yükleniyor
- Merdane (Şekil 2) sterilize edin.
- Hücre yüklemek için alüminyum levha sabitleyin. Güvenli merdane / sahneye yük hücresi / alüminyum levha montaj yükleme.
- Step motor kontrol (geri düğmesi) açın.
- PC ve açık "APT Kullanıcı" programı (Şekil 4) açın.
- Sol ekran yatay step motor kontrol eder. Sağ ekranda dikey step motor kontrol eder. Her ekranında, "Grafiksel Kontrol" sekmesini manuel konumlandırma sağlar ve "Taşı Sequencer" sekmesi otomasyon sağlar. Tüm birimler mm.
- Her iki ekranda da "Grafiksel Kontrol" sekmesine gidin ve "Ev / Sıfır" düğmesine basın. Her iki adım motorları 50 mm bir dizi var. "Ana Sayfa / Sıfır" basılması sıfır konumu (üst ve sağ en pozisyonları) her iki step motorlar göndereceğiz.
- PreparE, her kuyudan bazı medya kaldırarak yüklenmesi için 24 plaka örnekleri. Medyanın en fazla 1 ml yükleniyor sırasında taşmasını önlemek için her kuyuda bırakılmalıdır. Yeterli medya örnek kapalı tutmak için iyi kalır emin olun.
- Inkübatör enstrüman başarısızlığı önlemek için düşük nem koşullarında muhafaza unutmayın.
- Sıra 24 de biyoreaktör plaka ve merdane ile dikkatlice hizaya.
- Plaka dört ayarlanabilir kinematik bulma kullanarak biyoreaktör sabitlenir. Daha kolay merdane sıraya yapmak için, iki sol bulma önceden yerleştirilmiş. Plaka güvenli olacak şekilde iki sağ bulma sıkın. Biyoreaktör tabanının ön ile aynı hizada plaka hattına emin olun.
- "Grafiksel Kontrol" sekmesinde, belirli bir step motor pozisyonu elle konum kutusu tıklayarak girilebilir. Yavaşça merdane düşürmek ve plaka ile sıraya yatay olarak taşımak için bu özelliği kullanın. </ Ol>
- Merdane örnekleri ile temas yakın sonra, çok yavaş artışlarla merdane aşağı getirmek başlar (0,1 mm) Eğer önceden belirlenmiş başlangıç pozisyonuna gelinceye kadar (bölüm 6).
- Başlangıç konumuna ulaştıktan sonra, sekme "Sequencer Taşı" ve basarak istediğiniz hareket dizisi yüklemek için gidin "Yük." Daha sonra başlatmak için "Çalıştır" tuşuna basın. (Şekil 5) bir parçası 7'ye bakın. Bir Dozajlama Protokol yazma.
- Yükleme bittiğinde, el merdane yükseltmek. Herhangi bir örnek merdane yapışmış ise, dikkatle de steril bir spatula kullanarak uygun içine geri koymak.
- Biyoreaktör 24 plaka çıkarın ve medya değiştirin.
- Dikkatlice yük hücresinden merdane kaldırmak ve aletleri kapatın.
6. Kalibre Yükleniyor Plaka
Uygun suşları örnekleri uygulanır emin olmak için, her merdane dikkatli bir deney başlamadan önce kalibre edilmelidir.
- El 25 mm konumda yatay step motor koydu.
- Zar zor biyoreaktör tabanı ile temas dikkatlice düşük merdane gelene kadar. Yük hücresi bu noktada artan yükler gösterecektir. Dikey step motor (tüm sıkıştırma uzama ölçümleri bu değerden hesaplanan olacak gibi, mümkün olduğunca kesin) tam pozisyonuna dikkat ediniz.
- Konumunu kaydetmek. Bu değer, Örnek boyutları ve arzu edilen suş dayalı bir doz protokolü yazmak için kullanılır.
7. Bir Doz Protokol Yazma
- Biyoreaktör ya aynı anda veya ayrı ayrı, basınç ve kesme hem gerginlik uygulama yeteneğine sahiptir. Dara basınç gerginlik, dinamik gerilme genlik ve frekans yükleme: üç ana parametreleri karar verilmelidir.
- Bir dara gerginlik numuneden levhanın Fırlatmaya önlemek için uygulanır.
- Örnek dinamik gerilim amplitüd ve frekans yüklemefrekans seçilir.
Bu çalışmada şu şekilde basınç ve kayma gerilme tanımlayın: 
Örnek eksenli Dozaj Protokolü
Örnek kalınlığı: 2.25 mm
Dara Gerilme (sıkıştırma): örnek kalınlığının% 10 (0.225 mm)
Dinamik gerilme genliği (sıkıştırma):% 10 (+ / - örnek kalınlığının% 5)
Frekans (Sıkıştırma): 1 Hz
Dinamik Gerilme Genlik (Kesme): Örnek kalınlığı (0.5625 mm) 25%: Kesme stres
yatay hareket merdane ile örnek uygulanır.
Frekans (Kesme): 0,5 Hz
Tipik doz protokolü günde yükleme 3 saat olduğunu.
Bu örnekte, dinamik ve kesme yükleme aynı anda yerine sıralı olarak uygulanır. Bu desen daha iyi mim inanıyoruminsan diz ics karmaşık yükleme ortamı.
- Bir doz protokolü seçildikten sonra, bir sıkıştırma hareket sırası programı yazılmalıdır.
- Hareket dizisi step motor belirli bir ivme ve maksimum hızda hareket edeceğini pozisyonların bir listesi gibi geliyor tam olarak budur.
- Protokol ve merdane kalibrasyon değeri (bölüm 6) dozaj dayalı istenen dikey pozisyonları hesaplamak.
- Plaka 1 için örnek hesaplamalar aşağıda verilmiştir:
| Kalibrasyon Değer farkı | Dikey Konum | |
| Platen Kalibrasyon Değer (biyoreaktör indiğinden) | 0 mm | 29,7700 mm |
| Merdane Örnek ile temas (2,25 mm örnek) yapar | 4,4140 mm | 25,3560 mm |
| Styağmur (5% kalınlığı) | 4,3015 mm | 25,4705 mm |
| Gerilme (10% Kalınlığı) | 4,1890 mm | 25,5810 mm |
| Gerilme (15% Kalınlığı) | 4,0765 mm | 25,6955 mm |
- Bir kez pozisyonları, ivme ve doğru frekansı almak için maksimum hız değerleri ile deney hesaplanır. Çevrim sayısı (1 Hz, 3 saat boyunca örneğin 10.800 devir) buna uygun olarak seçilmelidir.
- Örnek Dinamik Sıkıştırma hareket Program Sırası (% 10 dara sıkıştırma,% 10 dinamik gerilme genliği, 1 Hz) (Şekil 5)
- Dinamik kesme hamle sırası programı: devir sayısı istenen sıklığı ve süresi (0,5 Hz az 3 saat örneğin 5400 devir) göre seçilmelidir.
- Örnek dinamik kesme hareket Program Sırası (% 10 dara sıkıştırma, 0.5625 mm (kalınlığının% 25) dinamik kesme gerilme genliği, 0.5Hz) (Şekil 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cihaz 20 milyon hücre / ml 'kondrositler ile boyanmış agaroz jel tohumlu kullanılarak test edilmiş ve tek eksenli (sıkıştırma) veya çift eksenli (sıkıştırma ve kesme kuvveti) mekanik yükleme varlığında yetiştirildiği. İlköğretim domuz kondrositlere 2-4 aylık domuz eklem kıkırdağı izole edilmiştir. 5 mm çapında ve 1,5 mm kalınlığında örnekleri tanımlanan kondrojenik kültür ortamı (yüksek glikoz DMEM,% 1 BAĞLI + karışımlar, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin, 2.5 ug / ml, 2 ml içinde kültürlendi amfoterisin B, 37, 24-yuvalı plakalar içinde 50 mg / ml askorbik asit, 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), prolin, 0.4 mM) ° C,% 5 CO2. 10 -7 M deksametazon ve 10 ng / ml TGF-β1 kültürünün ilk 10 gün için, teslim edilen. Numuneler gün 10-30 arasında 3 saat / gün için yüklendi. Tek eksenli yükleme% 10 sıkıştırma tepe-tepeye genlik oluşuyordu, 1 Hz ve iki eksenli yükleme 0.15 mm (% 10 kalınlık) sıkıştırma ve 0.075 oluşuyordumm kesme pik-tepeye genlik, 1 Hz. Dinamik gerilme genliği ve yükleme frekans yayınlanmış çalışmaların 17,19 göre seçilir. 30 gün sonunda işlenmiş kıkırdak biyokimyasal ve mekanik özellikleri değerlendirilmiştir.
- Hayır yükleme kontrol, 2 - Tek Eksenli (basınç) yükleme, 3 - İki eksenli (basınç ve kesme) yükleme 1: Bu çalışma üç grup istihdam. DNA içeriği ve yapıları ıslak ağırlıkları ekiminin 30 gün (p> 0.05) sonra üç grupta da benzer kaldı. GAG içeriği tek eksenli yükleme grubu (Grup 2, p <0.05) (Şekil 6) takip (grup 3, s kontrol grubuna göre <0.001) iki eksenli yükleme maruz kaldığı grupta en yüksek oldu. Grup 2 ve 3 arasında GAG muhtevaları, sırası ile,% 48 ve doğal kıkırdak% 50 karşılık gelir. Grup 3 grup 1 ve grup 2 (p <0.01) 'den daha yüksek kolajen miktarı ile sonuçlandı. Grup 2, aynı zamanda kalın yapıları tha vardıN Grup 1 (p <0.01). Şaşırtıcı bir şekilde, denge basınç Young modülü grup 2'de en yüksek olduğu (tek eksenli yükleme, p <0.01) ve grup 3 ile 1 arasında anlamlı farklılık yoktu. Grup 2 Young modülü yerli domuz kıkırdak 60.1% karşılık geldi.
Histolojik analizler glikozaminoglikanların (alcian mavi, safranin O) ve tip II kollajen (Şekil 7) için pozitif ve homojen boyama belirtti. Tüm gruplar tip I kollajen (şekilde gösterilmemiştir) için negatif boyandı.
Özetle, bu ön sonuçları bu biyoreaktör başarılı sıkıştırma ve iki eksenli (sıkıştırma ve kesme) mühendislik dokuların uzun süreli yetiştirme sırasında mekanik yükleme uygulanan öneririz. Bu çalışmada iki eksenli yükleme proteoglikan ve kolajen birikimi ve doku mühendisliği kıkırdak numune kalınlığına gördü. Tek eksenli basınç proteoglikan birikimi ve hem de arttı Young modülü.
Şekil 1. Çift eksenli yükleme X-aşaması (makaslama) ve Z-aşama (sıkıştırma) ile gerçekleştirilir. Şekil 24 kuyulu bir levha örnekleri yük aşamalarına bağlı bir ölçüye yükleme plakasını göstermektedir. Yükleme parametreleri step motorlar 18 bağlı bir bilgisayar ile kontrol edilir.
Şekil 2. Sol: 24-iyi plakaları için tasarlanmış polisülfon yükleme merdane. Sağ: iki eksenli yükleme biyoreaktör için yükleme merdane eki.
Şekil 3,. Kesme yükleme sırasında örnekleri hareketsizleştirir için agaroz kuyu hazırlanması. Mekanik yükleme için de agaroz yerleştirilen hareketsiz yapı. Bu rakam ve bir 2.25 mm kalınlığında örnek bir 1.5 mm kalınlığında agaroz gösterir.
Şekil 4. Iki eksenli yükleme cihazı kontrol etmek için grafik kullanıcı arayüzü. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50387/50387fig5.jpg "/>
Şekil 5,. Örnek eksenli Yükleniyor hareket Sıra Program Grafik Kullanıcı Arayüzü: Dinamik Sıkıştırma hareket Sıra Programı (10% dara sıkıştırma, 10% dinamik gerilme genliği, 1 Hz) ve Dinamik Kesme Taşı Dizi Programı (10% dara sıkıştırma, 25% dinamik kayma gerilme genliği, 0.5 Hz). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
6 Şekil. Biyokimyasal ve mekanik test sonuçları (n = 6) *** p <0.001, ** p <0.01, * p Grup 1 (yüksüz kontrol Grup 2 ile karşılaştırıldığında <0.05:.. Tek eksenli basınç yükleme, grup 3: İki eksenli basınç ve kesme yükleme.
Şekil 7. Histoloji: Alsiyan mavisi / nükleer hızlı kırmızı boyama, Safranin O / hızlı yeşil, tip II kollajen için immünokimyanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz nakli için üretilmiş doku mühendislik yapıları için tek eksenli veya çift eksenli mekanik zorlanma uygulama kapasitesine sahip bir yükleme cihazı tasarladık. Cihaz, doğal dokunun ya da öncesinde diğer tedavilerden sonra mekanik özelliklerini tanımlamak için tasarlanmış Biocomposites in vitro kültürü için bir biyoreaktör ya da bir test cihazı olarak kullanılabilir. Cihaz konular 24 kuyucuğu tek gelen büyük yükleme dozunun hassas (genlik ve frekans) ve doku kültürü koşulları çok çeşitli uygulama ile iki eksenli mekanik yüklenme doku yapıları mühendisliği.
Kesme Yükleme uygulaması bu sistemin tasarımı için benzersiz zorluklar bir dizi sundu. Besin transferi maksimize etmek için, yapıları aslında bir 24 plaka bireysel kuyularda unconfined edildi. Dara basınç gerginlik sigortalı olarak, dinamik sıkıştırma için bir sorun mevcut olmadığınıÖrnek-merdane temas kayıp değildi. Kayma gerilme protokol eklendi, ancak, serbest örnekleri plakanın alt kısmı boyunca kaydırdı ve merdane ile bazı kaybetti temas. Ayrıca, iki eksenli yükleme protokolleri örnekleri sırasında tutarsız yükleme neden çevirmek eğilimi vardı. Biz yordamda açıklandığı gibi örnekleri hareketsiz agaroz kuyu oluşturarak bu sorunu çözdü. Bu agaroz kuyuları örnekleri besin durumu sınırlamadan örneklerin tutarlı iki eksenli yükleme sağlar.
Çok yaygın olarak 20,21 araştırılır sıkıştırma biyoreaktörler aksine, bizim cihaz birden fazla eksende hassas suşları uygulama yeteneğine sahiptir. Bu eksen bağımsız olarak kontrol edilebilir. Eksenli yükleme sırayla veya aynı anda uygulanabilir. Bu, daha iyi bir in vivo koşullarda taklit etmek için, üç boyutlu mekanik yükleme sağlamak için Y ekseni, bir üçüncü uygulamak mümkündür.
Sürediğer çok eksenli biyoreaktörlerin ortak mekanik ortamı taklit için geliştirilmiştir, bizim sisteme göre büyük kısıtlamalar bulunmaktadır. Frank ve arkadaşları tarafından tasarlanan kesme ve sıkıştırma cihazı. yük geri besleme ile aynı anda yükleme için 12 örnekleri kadar izin verir, ancak yapıları sınırlı veya 6 güvenli değildir. Kayma gerilme ilgili deneyler sırasında, yapıları onlar yükleme plaka altında slayt kalmamak için güvenli olması esastır. Sürgülü numunenin dengesiz ve tutarsız kesme yükleme neden olacaktır. Bu eşsiz "yuvarlanan top" sistemi 22,23 ve iki eksenli stimülasyon cihazı 16 gibi yeni biyoreaktörler, çok daha gerçekçi ve tutarlı bir yükleme ortamı oluşturmak, ancak, sadece bir örnek aynı anda yüklü izin verir. Büyük çaplı bir güven düzeyi yüksek yapıları üzerinde gerekli biyokimyasal, mekanik ve histolojik analizler gerçekleştirmek için gereklidir. Addirak, "yuvarlanan top" sistemi force feedback, in vitro yetiştiriciliğinde uzun döneminde yapı geliştirme önemli bir ölçü yoktur. Ayrıca merdane-numune temassız ve geri dönüşümsüz doku mühendisliği yapıları zarar verir numune aşırı yüklenme, önlenmesi sağlar. Bian, et al. Tarafından geliştirilen sürgülü temas biyoreaktör aynı anda yükleme için dört yapıları kadar izin verir, ama yine de bu değerli force feedback mekanizması 17 yoksundur.
24 oyuklu plakalar kullanılarak geçerli ayar 24 örnek eş zamanlı olarak yüklenmesini sağlar Daha fazla numune yükleme levhanın geometrisi değişiklikler mümkündür. Yükleme merdane yeni tasarım için büyük esneklik sunar. Polisülfon gözenekli olan, seçilmiş malzeme, steril ve bir kuluçka nemli ve sıcak bir ortamda yetiştirilebilir. Bu örneklerin geometri ve sayı çeşitli eş zamanlı yüklenecek sağlayan, kolayca işlenebilirly.
Sonuç olarak, doku mühendisliği için yeni iki eksenli yükleme biyoreaktör doku mühendislik yapıları in vitro yetiştiriciliğinde uzun vadeli sağlar. İki eksenli yükleme proteoglikan ve kollajen birikimi ve doku mühendislik kıkırdak örnekleri kalınlığı artmış ama biz hipotezi önemli ölçüde mühendislik kıkırdak mekanik özelliklerini etkilemek için görünmüyordu. Tek eksenli basınç proteoglikan birikimi ve Young modülü de arttı. Biz mekanik yüklenme en uygun dozu hücre ve doku özellikleri ile farklı olduğunu inanıyoruz. Kollajen mimarisi ve yükleme dozimetre Geleceği çalışmalar bize tam mühendislik dokuların gelişimi üzerine çift eksenli yükleme etkilerini değerlendirmek sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Araştırma ve Geliştirme, RR-Ge Servisi, Gazi İşleri ABD, NIH Cobre 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 ve Savunma W81XWH-10-1-0643 Bölümü Dairesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. Bilgen, B., et al. 57th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (ORS), , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
