Summary
Wir haben eine neuartige mechanische Belastung Bioreaktor uniaxialen oder biaxialen mechanischen Belastung zu einer Knorpel Biokomposit können vor der Transplantation in eine Anwendung Gelenkknorpeldefekt.
Abstract
Wir haben eine Ladevorrichtung, die in der Lage ist die Anwendung uniaxialen oder biaxialen mechanischen Belastung zu einer Gewebezüchtungen Biocomposites zur Transplantation hergestellt ist. Während das Gerät in erster Linie die Funktion eines Bioreaktors, der die einheimischen mechanischen Belastungen imitiert, ist es auch mit einer Kraftmessdose zur Bereitstellung von Force-Feedback oder mechanische Prüfung der Konstrukte ausgestattet. Das Gerät Themen entwickelt Knorpel Konstrukte biaxiale mechanische Belastung mit großer Präzision des Ladens Dosis (Amplitude und Frequenz) und ist kompakt genug, um in einem Standard Gewebekulturinkubator passen. Es lädt Proben direkt in einer Gewebekultur Platte und mehrere Plattengrößen sind kompatibel mit dem System. Das Gerät wurde entwickelt, unter Verwendung von Komponenten für präzise geführte Laser-Anwendungen hergestellt. Bi-axial Belastung wird durch zwei orthogonal Stufen erreicht. Die Etappen haben eine 50 mm Stellweg und unabhängig von Schrittmotor Aktuatoren angetrieben, gesteuert durchein geschlossenes Schrittmotor-Treiber, der Mikroschritt-Funktionen verfügt, so dass Schrittweiten von weniger als 50 nm beträgt. Ein Polysulfon Belastung Platte mit dem bi-axial beweglichen Plattform gekoppelt ist. Bewegungen der Stufen werden von Thor-labs Erweiterte Positioning Technology (APT) Software gesteuert. Der Schrittmotor-Treiber mit der Software Ladeparameter von Frequenz und Amplitude von sowohl Scher-und Kompressions unabhängig und gleichzeitig einzustellen verwendet. Stellungsrückmeldung wird durch lineare optische Encoder, die eine bidirektionale Wiederholgenauigkeit von 0,1 um und eine Auflösung von 20 nm haben, die Übersetzung zu einer Positionsgenauigkeit von weniger als 3 um über die volle 50 mm Federweg zur Verfügung gestellt. Diese Encoder bieten die notwendige Rückmeldung mit der Elektronik auf true Nanopositionier Fähigkeiten zu gewährleisten. Zur Bereitstellung der Force-Feedback zu erfassen und auszuwerten kontaktieren Laden Reaktionen ist ein Präzisions-Miniatur-Wägezelle zwischen der Platte und der Beladung Movin positioniertg-Plattform. Die Wägezelle weist eine hohe Genauigkeit von 0,15% bis 0,25% des Messbereichs.
Introduction
Wir haben eine Belastung Bioreaktor, die fähig Anwendung uniaxialen oder biaxialen mechanischen Belastung zu einer Gewebezüchtungen Biocomposites zur Transplantation hergestellt ausgelegt ist. Dieses Gerät ist in erster Linie als Bioreaktor für hochentwickelte Ersatz für Gelenkknorpel entwickelt, es könnte auch für andere tragende Gewebe im menschlichen Körper verwendet werden. Unsere Motivation in diesem Bioreaktor-Design stammt von Drachman und Sokoloff 1, der die bahnbrechenden Beobachtung abnorme Bildung von Gelenkknorpel in gelähmten Kükenembryos aufgrund der Abwesenheit von Bewegung gemacht. Ebenso ist körperliche Bewegung wichtig für die Entwicklung von normalen Muskeln und Knochen. Im Einklang mit diesem Konzept viele Forschungsgruppen haben, wie verschiedene Formen der körperlichen Reize während der in vitro Kultivierung untersucht moduliert die biochemischen und mechanischen Eigenschaften von Zell-Biomaterial Biocomposites und Gewebeexplantate 2-7. Das Konzept der funktionalen Tissue Engineeringbeinhaltet die in vitro-Verwendung von mechanischen Reizen, die funktionellen Eigenschaften von Geweben verbessern, dh die mechanischen Eigenschaften, die das Gewebe in vivo, um die Belastung zu widerstehen erwartet belasten und 8,9 zu ermöglichen. Zahlreiche Studien berichten über die Verwendung mechanischer Belastung in Bezug auf die Scher-und Kompressions zu Knorpels Konstrukte für Gelenk Gelenke zu stimulieren. Mauck et al. 10 zeigen, dass mechanische Belastung allein Chondrogenese von mesenchymalen Stammzellen auch in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren, die als entscheidend sind induzieren. Anwendung der intermittierenden mechanische Belastung wie Druck oder Scherung während Gewebekultivierung hat sich gezeigt, zu modulieren Knorpel-und Knochenbildung, aber die optimale Dosimetrie Belastung unterscheidet sich mit Zell-und Gewebe-Eigenschaften 11.
Die wichtigste Funktion von Gelenkknorpel ist die Fähigkeit, Druck-und Scherkräfte innerhalb widerstehendie gemeinsame, deshalb hat es eine hohe Druck-und Schermodule haben. Der Mangel an funktionalen mechanischen Festigkeit und physiologischen Ultrastruktur in Knorpels in der Aufgliederung nach neo-Knorpel in vivo und das Versagen der Knorpel in den Gelenken Ersatz Strategien geführt. Obwohl Kompression und Scherung wurden häufig unter Beweis gestellt haben zu modulieren und Verbesserung der mechanischen Festigkeit des Gelenkknorpels Biocomposites, ist eine Kombination Ansatz selten 6,12-15. Wartella und Wayne 16 entwickelt einen Bioreaktor, der Zug-und Druckkräfte bis Meniskusknorpel Ersatz produzieren angewendet. Waldman et al. Entwickelt 15 eine Einrichtung zur Kompression und Scherung zu Chondrozyten in einem porösen Substrat kultiviert Calciumpolyphosphat gelten. Bian et al. Zeigten 17 mechanischen Eigenschaften passenden nativen Knorpel mit der in-vitro-Kultivierung adulter Hunde Chondrozyten in Gelen und Anwendung von zweiachsigen mechanischer Belastung (Druck Deformationsphase Be-und Schleifkontakt Beladung).
Die biaxiale mechanische Belastung Bioreaktor wurde ursprünglich von Danielle Chu in unserem Labor mit dem übergeordneten Ziel konzipiert, morphologischen Anpassungen in Tissue Engineering Knorpel induzieren konstruiert, was zu höheren Druck-und Schermodule als die derzeit verfügbaren 18. Wir glauben, dass diese Forschung deutlich erhöhen unser erweitertes Verständnis von, wie Mechanotransduktion moduliert werden kann, um klinisch relevant Ingenieur Gewebe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biaxiale Loading Bioreaktor Entwurf
- Der Bioreaktor verwendet zwei Stufen von Thor-Labs (Newton, MA) für präzisionsgelenkte Laseranwendungen hergestellt zum Anlegen uniaxialen oder biaxialen mechanischen Dehnung bis engineered Gewebe, mit großer Präzision von Initialdosis (Amplitude und Frequenz) und Anwendung auf eine Vielzahl von Gewebekulturbedingungen von Einzel-auf 24-Well-Platten (Abbildung 1).
- Bi-axial Belastung wird durch zwei travelmax Stufen (LNR50SE) durchgeführt. Diese Stufen sind orthogonal in einer XZ-Konfiguration montiert. Die horizontale Bühne bietet dynamische Scherbewegungen durch oszillierende entlang der X-Achse. Die vertikale Stufe liefert dynamische Druckbelastung durch Oszillieren entlang der Z-Achse. Diese Stufen haben eine 50 mm Stellweg und unabhängig durch Schrittmotor Aktuatoren (DRV014) durch eine geschlossene Schleife Schrittmotor-Treiber (BSC102), die Mikroschritt-Funktionen Funktionen gesteuert wird, so dass Schrittweiten von weniger als50 nm auf.
- Die Vorrichtung ist auf einem starren 25 cm x 30 cm angebracht x 12,5 mm Alu-Grundplatte, die als Plattform für die Montage von Maschinenteilen und für die Montage von Gewebekulturplatten verwendet wird. Einstellbare Anschläge kinematischen werden verwendet, um Zellkulturplatten rastet auf der Aluminium-Grundplatte. Diese kinematische Haltestellen haben Feineinstellschrauben für präzise Ausrichtung, die sonst nicht erreichbar ist von Hand zu ermöglichen. Der modulare Aufbau der Bodenplatte ermöglicht eine flexible Platzierung dieser kinematischen Stationen bis Platten in verschiedenen Größen und Formen (Petrischalen vs Multi-Well-Platten) unterzubringen.
- Ein speziell bearbeiteten Polysulfon Laden Platte ist mit dem bi-axial beweglichen Plattform über eine präzise gefertigten rechten Winkel gekoppelt. Polysulfon Material wurde aufgrund seiner Biokompatibilität gewählt, die einfache Bearbeitung und einfache Sterilisation.
- Bewegungen der Stufen werden von Thor-labs 'Advanced Positioning Technology (APT) Software gesteuert. Der Schrittmotor-Treiber ist unsed in Verbindung mit der Software, die die Einstellung der Ladeparameter von Frequenz und Amplitude von sowohl Scher-und Kompressions unabhängig und gleichzeitig ermöglicht.
- Stellungsrückmeldung wird durch lineare optische Encoder, die jedem beweglichen Plattform befestigt sind und mit der Software integriert ist. Die Geber-System verfügt über eine bidirektionale Wiederholgenauigkeit von 0,1 um und eine Auflösung von 20 nm, die Übersetzung zu einer Positionsgenauigkeit von weniger als 3 um über die vollen 50 mm Federweg. Diese Encoder bieten die notwendige Rückmeldung mit der Elektronik auf true Nanopositionier Funktionen zu gewährleisten und eine direkte Anzeige der absoluten Position.
- Zur Bereitstellung der Force-Feedback zur Erfassung von Kontakt zwischen Platte und Proben und bewerten Laden Reaktionen, ein Präzisions-Miniatur-Wägezelle (Honeywell Modell 31) zwischen der Belastung Platte und der beweglichen Plattform (Abbildung 2) positioniert. Die Wägezelle hat hohe Genauigkeiten0,15% bis 0,25% vom Endwert. Die Anzeigeeinheit (SC500) der Wägezelle kann auch Lastmessungen von bis zu 5 Nachkommastellen. Darüber hinaus hat es eine RS-232-Schnittstelle für die Datenerfassung auf einem Computer zu ermöglichen.
2. Handy-Seeded Agarose Konstrukte
- Bereiten Sie 4% igen: In 0,8 g Agarose auf 20 ml DMEM (ohne Zusätze) in einem 50 ml Kolben, kochen, und dann halten in 70 ° C-Ofen bis zur Verwendung.
- Stellen Sie die Lautstärke der Zellsuspension für doppelte Menge der gewünschten Zelle Aussaatdichte. Diese Suspension wird mit einem gleichen Volumen von 4% w / v Agarose, ein 2% Agarosegel bei der gewünschten Aussaatdichte schaffen gemischt.
- Legen Sie sowohl die Zellsuspension und einer 10 ml Pipette in den Inkubator.
- Richten Sie Gelgießen System. Ein 1,5 mm und einer 0,75 mm Distanzplatte sollte zusammengestellt werden, um eine 2,25 mm dicke Gel erstellen. Andere Größe Abstandshalterplatten verwendet zur Erstellung verschiedener Gelstärken werden. Das Gel Casting System ist nicht groß genug, um diese Platten toget haltensie, so sie müssen sicher abgeklebt werden, um undichte verhindern.
- Der nächste Schritt ist es, schnell mischen Zellsuspension mit der zuvor hergestellten Agarose und Pipette in die Gelform bevor die Agarose verfestigt. Entfernen Sie die Flüssigkeit Agarose aus dem Ofen und legen Sie eine sterile Thermometer in ihm. Die Agarose muss 42-43 ° C vor dem Mischen mit Zellen zu kühlen. Wärmen Sie die Zellsuspension auf 37 ° C. Sobald die Agarose trifft 43 ° C, schnell Pipette auf die gewünschte Menge und dann sofort Pipettieren der Zellsuspension nach oben und unten ein paar Mal zu mischen. Dann sofort Pipette das gesamte Gemisch in die Gelform.
- Lassen Sie das Gel für 10-15 min verfestigen und dann vorsichtig kippen in eine horizontale Position.
- Entfernen Sie die obere Glasplatte und Punsch Festplatten mit der Biopsie Punch. Disks können mit einem kleinen sterilen Spatel abgeholt werden. Nach unserer Erfahrung war ein 9 ml Gel groß genug, um mehr als hundert 5-mm-Scheiben mit einem Durchmesser machen.
3. Kultur die Disks
4. Immobilisierung von Proben für Mechanische Belastung
- Herstellung von 4% Agarose (kein Zellsuspension) und das Gel sollte dünner sein als die Proben selbst (um Störungen während des Ladens zu verhindern). Die empfohlene Stärke 1,5-1,9 mm ist (für 2,25 mm dicken Proben).
- Einmal geliert, Punsch 16 mm Scheiben mit einem Durchmesser von 24-Well-Platten. In jeder Platte, um Punsch ein 5 mm Loch für die Probe platziert werden in. Wenn gewünscht, Punsch noch 5 mm Loch am Rand der Scheibe für die Pipette während Änderungen Medien platziert werden.
- Sobald Agarose Brunnen vorgenommen wurden, erfolgt in 24-Well-Platte, wie in Abbildung 3 dargestellt.
- Nachdem die Agarose-wEllen sind in der 24-Well-Platte, drücken Sie passen Proben in jede Vertiefung. Die Probe sollte aus der Spitze der Agarose gut überstehen.
5. Mechanische Belastung
- Sterilisieren Platte (Abbildung 2).
- Sichern Aluminiumplatte Zelle laden. Sicheres Laden Platte / Wägezelle / Aluminiumplatte Montage auf die Bühne.
- Schalten Sie Schrittmotorsteuerung (Schalter an der Rückseite).
- Schalten Sie PC und öffnen Sie "APT User"-Programm (Abbildung 4).
- Linker Bildschirm steuert horizontal Schrittmotor. Rechter Bildschirm steuert vertikalen Schrittmotor. In jedem Bildschirm "Graphical Control" Tab ermöglicht die manuelle Positionierung und "Move Sequencer" Registerkarte können für die Automatisierung. Alle Einheiten sind mm.
- Gehen Sie auf "Grafische Control" Reiter auf beiden Bildschirmen und drücken Sie "Start / Zero"-Taste. Sowohl Schrittmotoren haben eine Reichweite von 50 mm. Durch Drücken von "Home / Null" wird sowohl Schrittmotoren in die Nullstellung (oben und rechts meisten Positionen) zu senden.
- Prepare die Proben in 24-Well-Platte zu laden, indem einige Medien aus jeder Vertiefung. Nicht mehr als 1 ml Medium sollte in jedem gut gelassen werden, um einen Überlauf während des Ladens zu verhindern. Achten Sie darauf, dass genügend Material in den Brunnen gelassen wird, um die Probe bedeckt.
- Beachten Sie, dass der Inkubator in niedriger Luftfeuchtigkeit gehalten wird, um Fehler zu verhindern Instrument.
- Platz 24 Well-Platte in Bioreaktor und vorsichtig eine Linie mit der Platte.
- Die Platte wird in den Bioreaktor mit vier einstellbare kinematische Lokatoren gesichert. Um es einfacher zu Line-Up der Platte wurden die beiden linken Locator worden vorpositioniert. Ziehen Sie die beiden rechten Locator so dass die Platte sicher ist. Achten Sie darauf, die Platte bis bündig mit der Front des Bioreaktors Basislinie.
- In "Graphische Control" Registerkarte kann eine bestimmte Schrittmotorposition manuell durch Klicken auf die Position eingegeben werden. Verwenden Sie diese Funktion, um die Platte langsam senken und verschieben Sie sie horizontal, Line-Up mit der Platte. </ Ol>
- Sobald die Platte ist in der Nähe in Kontakt zu kommen mit den Proben beginnen, um die Platte zu bringen, die in sehr langsamen Schritten (0,1 mm), bis Sie die vorgegebene Startposition zu erreichen (siehe Teil 6).
- Sobald die Ausgangsposition erreicht ist, gehen Sie auf "Verschieben Sequencer" und laden Sie die gewünschte Zugfolge durch Drücken "Load". Drücken Sie dann auf "Ausführen" zu starten. (Abbildung 5) Siehe Teil 7. Schreibe eine Dosierung Protokoll.
- Wenn fertig geladen, manuell erhöhen die Walze. Wenn irgendwelche Proben an der Platte stecken, vorsichtig legte sie zurück in die entsprechende Vertiefung mit einem sterilen Spatel.
- Entfernen 24-Well-Platte von Bioreaktor und ersetzen Sie die Medien.
- Entfernen Sie vorsichtig die Platte aus der Wägezellen und schalten Sie dann Instrumente.
6. Kalibrieren Loading Platen
Um sicherzustellen, dass die richtigen Stämme Proben angewendet werden, muss jede Platte sorgfältig kalibriert sein, bevor die ein Experiment.
- Manuelles setzen horizontal Schrittmotor an der Position 25 mm.
- Vorsichtig untere Platte, bis sie gerade noch in Kontakt mit dem Boden des Bioreaktors. Wägezellen werden erhöhte Belastungen an dieser Stelle zeigen. Beachten Sie die genaue Position des vertikalen Schrittmotor (so genau wie möglich, da alle Stauchung Messungen von diesem Wert berechnet wird).
- Notieren Sie die Position. Dieser Wert wird verwendet, um eine Dosierung Protokoll auf Probe Abmessungen und gewünschten Stämme basierend schreiben.
7. Schreibe eine Dosier-Protokoll
- Der Bioreaktor kann die Anwendung sowohl Druck-und Scherbeanspruchung, entweder gleichzeitig oder einzeln. Die drei wichtigsten Parameter entschieden werden muss: Tara Stauchung, dynamischen Belastung Amplitude und Frequenz Laden.
- Als Tara Stamm aufgebracht wird, um dem Abheben der Platte aus der Probe zu verhindern.
- Beispiel dynamische Dehnungsamplitude und Laden freFrequenz gewählt werden.
In dieser Studie haben wir definieren Druck und Scherung wie folgt: 
Beispiel Biaxiale Dosierung Protokoll
Probendicke: 2,25 mm
Tara Stamm (Kompression): 10% der Dicke der Probe (0,225 mm)
Dynamische Dehnungsamplitude (Kompression): 10% (+ / - 5% der Dicke der Probe)
Frequency (Compression): 1 Hz
Dynamische Dehnungsamplitude (Shear): 25% der Dicke der Probe (0,5625 mm): Shear Stress ist
die auf die Probe durch die Platte horizontal bewegt.
Frequency (Shear): 0,5 Hz
Typische Dosierung Protokoll ist 3 Stunden zum Laden pro Tag.
In diesem Beispiel wird dynamisch und Scherbeanspruchung aufgebracht gleichzeitig anstatt nacheinander. Wir glauben, dass dieses Muster besser mimics die komplexen Beanspruchungen Umwelt im menschlichen Knie.
- Sobald ein Dosier-Protokoll gewählt wurde, muss eine Kompression Bewegungssequenz Programm geschrieben werden.
- Die Zugfolge ist genau das, was es heißt, eine Liste der Positionen, die der Schrittmotor wird nach einem festgelegten Beschleunigung und maximale Geschwindigkeit bewegen klingt.
- Berechnen gewünschten vertikalen Positionen auf Dosierung Protokoll und Platte Kalibrierung Wert (von Teil 6) basiert.
- Beispiel Berechnungen für Platen 1 sind unten angegeben:
| Abweichung von Calibration Wert | Vertikale Position | |
| Platen Calibration Wert (Boden berührt Bioreaktor) | 0 mm | 29,7700 mm |
| Platen in Kontakt mit der Probe (2,25 mm Probe) | 4,4140 mm | 25,3560 mm |
| Stregen (5% Dicke) | 4,3015 mm | 25,4705 mm |
| Stamm (10% Stärke) | 4,1890 mm | 25,5810 mm |
| Stamm (15% Stärke) | 4,0765 mm | 25,6955 mm |
- Sobald Positionen berechnet werden, experimentieren mit Beschleunigung und maximale Geschwindigkeit Werte, um die richtige Frequenz zu bekommen. Die Anzahl der Zyklen sollte so gewählt werden, entsprechend (zB 10.800 Zyklen 3 h bei 1 Hz).
- Beispiel Dynamische Kompression Move Sequence Program (10% Tara Kompression, 10% dynamisch Dehnungsamplitude, 1 Hz) (Abbildung 5)
- Dynamische Scherfestigkeit Bewegungssequenz Programm: Die Anzahl der Zyklen ist entsprechend der gewünschten Frequenz und der Dauer (zB 5.400 Zyklen 3 h bei 0,5 Hz) gewählt werden.
- Beispiel Dynamische Shear Move Sequence Program (10% Tara Kompression, 0,5625 mm (25% der Dicke) dynamische Scherung Amplitude, 0,5Hz) (Abbildung 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das Gerät wurde unter Verwendung von Agarosegelen entkernt mit 20 Millionen Zellen / ml Chondrozyten getestet und kultiviert in Gegenwart von einachsigen (Kompression) oder zweiachsigen (Kompression und Scherung) mechanische Belastung. Primäre porcine Chondrozyten wurden aus dem Gelenkknorpel von 2-4 Monate alten Schweinen isoliert. 5 mm Durchmesser und 1,5 mm dicken Proben wurden in 2 ml definiert chondrogene Kulturmedium (DMEM high glucose, 1% ITS + Premix, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 2,5 ug / ml kultiviert Amphotericin B, 50 ug / ml Ascorbinsäure, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 0,4 mM Prolin) in 24-Well-Platten bei 37 ° C, 5% CO 2. 10 -7 M Dexamethason und 10 ng / ml TGF-β1 wurden für die ersten 10 Tage des Kultur geliefert. Die Proben wurden für 3 h / Tag zwischen 10-30 Tagen geladen. Einachsiger Belastung bestand aus 10% Kompression Spitze-zu-Spitze-Amplitude bestand 1 Hz und biaxialen Belastung von 0,15 mm (10% Stärke) Kompression und 0,075mm Scherung Spitze-zu-Spitze-Amplitude, 1 Hz. Die dynamische Belastung Amplitude und Frequenz Belastung basieren auf veröffentlichten Studien 17,19 gewählt. Am Ende von 30 Tagen biochemischen und mechanischen Eigenschaften des Knorpels beurteilt.
Diese Studie beschäftigt drei Gruppen: 1 - Keine Ladekontrolle, 2 - einachsig (Druck) Laden, 3 - zweiachsig (Druck und Scherung) loading. Die DNA-Inhalte und die nassen Gewichte Konstrukte blieb ähnlich in den drei Gruppen nach 30 Tagen Kultivierung (p> 0,05). Die GAG-Gehalt war am höchsten in der Gruppe, die zweiachsige Belastung ausgesetzt wurde (Gruppe 3, p <0,001 im Vergleich mit der Kontrollgruppe), gefolgt von der einachsigen Belastung (Gruppe 2, p <0,05) (Abbildung 6). Die GAG Inhalte der Gruppen 2 und 3 bis 48% und 50% der nativen Knorpel entsprechen. Gruppe 3 führte zu einer signifikant höheren Anteil an Kollagen als Gruppen 1 und 2 (p <0,01). Gruppe 2 hatte auch dicker Konstrukte than Gruppe 1 (p <0,01). Überraschenderweise war das Gleichgewicht Druckbelastung Elastizitätsmodul der höchste in der Gruppe 2 (einachsiger Belastung, p <0,01) und es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen 3 und 1. Der Elastizitätsmodul der Gruppe 2 entsprach 60,1% der einheimischen Schweine Knorpel.
Die histologischen Analysen zeigten positive und homogene Färbung für Glykosaminoglykane (Alcianblau, Safranin O) und Typ-II-Kollagen (Abbildung 7). Alle Gruppen gefärbt für Kollagen vom Typ I (nicht gezeigt) negativ.
Zusammenfassend deuten diese vorläufigen Ergebnisse, dass diese erfolgreich Bioreaktor Kompression und zweiachsigen (Kompression und Scherung) mechanische Belastung während langfristig Anbau von gentechnisch Gewebe aufgetragen. In dieser Studie biaxial Beladung wurde die Proteoglykan und Kollagen Abscheidung und die Dicke der Gewebe Knorpels Proben gezeigt. Einachsige Kompression erhöht sowohl die proteoglycan Abscheidung und die Young-Modul.
Abbildung 1. Biaxiale Belastung wird durch die X-Stufe (Scherung) und der Z-Stufe (Kompression) durchgeführt. Die Abbildung zeigt eine maßgeschneiderte Laden Platte, die an den Stufen, um Proben in einer 24-Well-Platte laden. Die Be-Parameter sind mit einem Computer verbunden, um die Schrittmotoren 18 gesteuert.
Abbildung 2. Links: Das Polysulfon Laden Platte für 24-Well-Platten ausgelegt. Rechts: Die Beladung Platte Befestigung an der biaxialen Belastung Bioreaktor.
Abbildung 3. Herstellung von Agarose Brunnen zur Immobilisierung von Proben während der Scherbelastung. Das immobilisierte Konstrukt in der Agarose gut für mechanische Belastung platziert. Diese Figur zeigt eine 1,5 mm dicke Agarose Brunnen und eine 2.25 mm dicke Probe.
Abbildung 4. Die grafische Benutzeroberfläche, um die biaxiale Belastung steuern. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50387/50387fig5.jpg "/>
Abbildung 5. Beispiel Biaxiale Loading Move Sequence Programm Graphical User Interface: Dynamische Kompression Move Sequence Program (10% Tara Kompression, 10% dynamisch Dehnungsamplitude, 1 Hz) und dynamische Shear Move Sequence Program (10% Tara Kompression, 25% dynamisch Scherdehnung Amplitude, 0,5 Hz). Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 6. Biochemische und mechanische Tests Ergebnisse (n = 6) *** p <0,001, ** p <0,01, * p <0,05 im Vergleich zu Gruppe 1 (unbelasteten Kontrollgruppe 2:.. Einachsige Druckbelastung, Gruppe 3: Druck-und Scher Biaxiale Laden.
Abbildung 7. Histologie: Alcianblau / Kernechtrot Färbung, Safranin O / Fast Green, Immunochemie für Typ-II-Kollagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir haben eine Ladevorrichtung, die in der Lage ist die Anwendung uniaxialen oder biaxialen mechanischen Belastung des Gewebes engineered Konstrukte zur Transplantation hergestellt ausgelegt ist. Das Gerät kann als Bioreaktor zur in vitro Kultivierung von technischen Biocomposites oder als Testvorrichtung verwendet werden, um die mechanischen Eigenschaften des nativen Gewebes oder nach anderen Behandlungen vor beschreiben. Die Vorrichtung Themen entwickelt Gewebekonstrukte einer biaxialen mechanischen Belastung mit großer Präzision von Initialdosis (Amplitude und Frequenz) und Anwendung auf eine Vielzahl von Gewebekulturbedingungen von Einzel-auf 24-Well-Platten.
Die Anwendung der Querlast präsentiert eine Reihe von einzigartigen Herausforderungen für die Gestaltung dieses Systems. Um Nährstoff zu maximieren, wurden Konstrukte ursprünglich in einzelnen Vertiefungen einer 24-Well-Platte unconfined. Das ist nicht ein Problem für dynamische Kompression, da die Tara-Stauchung versichert, dassProbe-Platten-Kontakt wurde nicht verloren. Wenn Scherung auf das Protokoll aufgenommen, jedoch rutschte unconfined Proben entlang der Unterseite der Platte und einige verlor den Kontakt mit der Walze. Zusätzlich während der biaxialen Belastung Protokolle Proben hatten die Tendenz, umdrehen, was inkonsistent loading. Wir lösten dieses Problem, indem die Agarose Brunnen Proben immobilisiert wie im Verfahren beschrieben. Diese Agarose Brunnen ermöglichen konsequente zweiachsige Belastung der Proben ohne Einschränkung die Verfügbarkeit von Nährstoffen zu den Proben.
Im Gegensatz zu den Kompressions-Bioreaktoren, die sehr weit verbreitet 20,21 erforscht, ist unser Gerät in der Lage präzise Anwendung Stämme auf mehreren Achsen. Diese Achsen können unabhängig voneinander gesteuert werden. Mehrachsiger Beanspruchung können nacheinander oder gleichzeitig angewendet werden. Es ist möglich, eine dritte Y-Achse der mechanischen Beanspruchung in drei Dimensionen bereitzustellen, um besser in vivo Bedingungen nachahmen implementieren.
Währendanderen mehrachsigen Bioreaktoren entwickelt wurden, um die mechanische Umgebung des Gelenks nachzuahmen, haben sie große Einschränkungen im Vergleich zu unserem System. Eine Scherung und Kompression Gerät von Frank et al konzipiert. können bis zu 12 Proben gleichzeitig mit Last Feedback geladen werden, sind jedoch nicht beschränkt Konstrukte oder 6 gesichert. Während Experimente mit Scherung, ist es wichtig, dass Konstrukte so gesichert werden, dass sie nicht unter der Belastung Platte gleiten. Schiebetüren werden in unebenem und inkonsistent Scherbeanspruchung der Probe führen. Neuere Bioreaktoren, wie die einzigartige "rollenden Ball"-System 22,23 und einem zweiachsigen Stimulation 16, eine viel realistischere und konsistente Belastung Umwelt, aber sie erlauben nur eine Probe zu einem Zeitpunkt geladen werden. Große Fallzahlen sind unerlässlich für die Durchführung der notwendigen biochemischen, mechanische und histologische Analysen der Konstrukte mit einem hohen Maß an Vertrauen. Additional, fehlt dem "rollenden Ball"-System Force-Feedback, eine wesentliche Maßnahme des Konstrukts Entwicklung während langfristig in vitro-Kultivierung. Es ermöglicht auch die Prävention von Platte-Probe berührungslos und Probe Überlastung, die irreversibel beschädigt wird Tissue Engineering Konstrukten. Ein Schleifkontakt Bioreaktor von Bian, et al. Entwickelt wurde, ermöglicht bis zu vier Konstrukte gleichzeitig geladen werden, aber immer noch nicht diese wertvolle Force-Feedback-Mechanismus 17.
Das aktuelle Setup mit 24-Well-Platten ermöglicht die gleichzeitige Beladung von 24 Proben, mehr Proben sind möglich mit Modifikationen der Geometrie der Platte laden. Die Beladung Platte bietet große Flexibilität für den neuartigen Design. Das gewählte Material Polysulfon porös ist, können sterilisiert sein und kultiviert in der feuchten und warmen Umgebung eines Inkubators. Es ist leicht zu bearbeiten, so dass eine Vielzahl von Geometrien und die Zahl der Proben, die geladen werden, die gleichzeitigely.
Zusammenfassend ermöglicht die neue zweiachsige Belastung Bioreaktor für das Tissue Engineering langfristig in vitro-Kultivierung von Gewebe engineered Konstrukte. Biaxiale Belastung erhöht die proteoglycan und Kollagenablagerung und die Dicke der Gewebe Knorpels Proben aber offenbar nicht wesentlich beeinflussen die mechanischen Eigenschaften des Knorpels, wie wir vermutet. Uniaxialen Verpressen erhöht sowohl die Proteoglykan Abscheidung und der Young-Modul. Wir glauben, dass die optimale Dosis der mechanischen Belastung mit Zell-und Gewebeeigenschaften unterscheidet. Zukünftige Studien von Kollagen Architektur und Dosimetrie Laden wird uns erlauben, vollständig zu bewerten die Auswirkungen der biaxialen Belastung auf die Entwicklung von technischen Geweben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Amt für Forschung und Entwicklung, RR & D Service, US Department of Veterans Affairs, NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 und Department of Defense W81XWH-10-1 bis 0643 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. Bilgen, B., et al. 57th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (ORS), , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
