Summary
We ontwierpen een nieuwe mechanische belasting bioreactor die eenassige of bi-axiale mechanische spanning voorafgaand aan de transplantatie kan toepassen op een kraakbeen biocomposite in een gewrichtskraakbeendefect.
Abstract
We ontwierpen een laadinrichting die van toepassing kan uniaxiaal of biaxiaal mechanische belasting een tissue engineered biocomposieten vervaardigd voor transplantatie. Terwijl het apparaat functioneert primair als een bioreactor die de natieve mechanische belasting nabootst, is ook uitgerust met een load cell te verschaffen force feedback of mechanische testen van de constructen. Het apparaat onderwerpen engineered kraakbeen constructies om biaxiale mechanische belasting met grote precisie van oplaaddosis (amplitude en frequentie) en is compact genoeg om te passen in een standaard weefselkweek incubator. Het laadt monsters direct in een weefselkweek plaat, en meerdere plaat maten zijn compatibel met het systeem. Het apparaat is ontworpen met behulp van onderdelen geproduceerd voor precisie-geleide laser-toepassingen. Bi-axiale belasting wordt bereikt door twee orthogonale fasen. De etappes hebben een 50 mm slaglengte en worden onafhankelijk aangedreven door stappenmotor actuatoren, bestuurd dooreen closed-loop stappenmotor driver die micro-stepping-mogelijkheden beschikt, waardoor stap kleiner dan 50 nm. Een polysulfon loading drukplaat gekoppeld met de bi-axiaal bewegend platform. Het verloop van de fasen worden gecontroleerd door Thor-labs Geavanceerde Positioning Technology (APT) software. De stappenmotor stuurprogramma wordt gebruikt met de software om bewakingsparameters frequentie en amplitude van zowel afschuiving en compressie onafhankelijk en gelijktijdig te passen. Positionele feedback wordt verstrekt door lineaire optische encoders die een bidirectionele herhaalbaarheid van 0,1 micrometer en een resolutie van 20 nm hebben, vertalen naar een positionele nauwkeurigheid kleiner dan 3 micrometer over de volledige 50 mm van reizen. Deze encoders zorgen voor de nodige terugmelding aan de aandrijfelektronica om ervoor te zorgen ware nanopositioning mogelijkheden. Om te voorzien in de force feedback op te sporen contact en evalueren laden reacties, wordt een precisie miniatuur load cell gepositioneerd tussen het laden plaat en de moving plateau. De load cell heeft een hoge nauwkeurigheid van 0,15% tot 0,25% volle schaal.
Introduction
We hebben een loading bioreactor die van toepassing kan uniaxiaal of biaxiaal mechanische belasting een tissue engineered biocomposieten vervaardigd voor transplantatie gemaakt. Dit apparaat is hoofdzakelijk ontworpen als een bioreactor van technisch vervanging van kraakbeen, maar kan ook worden gebruikt voor andere dragende weefsels in het menselijk lichaam. Onze motivatie in deze bioreactor ontwerp komt voort uit Drachman en Sokoloff 1, die de rudimentaire observatie van abnormale vorming van gewrichtskraakbeen in verlamde kippenembryo's door het ontbreken van beweging gemaakt. Ook lichaamsbeweging is essentieel voor normale ontwikkeling van spieren en botten. In overeenstemming met dit concept, hebben vele onderzoeksgroepen onderzocht hoe verschillende vormen van fysieke stimuli tijdens in vitro kweken moduleert de biochemische en mechanische eigenschappen van cel-biomateriaal biocomposieten en weefselexplantaten 2-7. Het begrip functionele tissue engineeringomvat het in vitro gebruik van mechanische stimuli om de functionele eigenschappen van weefsels verbeteren, dat wil zeggen de mechanische eigenschappen waarmee het weefsel bestand tegen de verwachting in vivo stress en spanning 8,9. Talrijke studies rapporteren het gebruik mechanische belasting in termen van afschuiving en compressie om engineered kraakbeen constructies te stimuleren voor articulaire gewrichten. Mauck et al.. 10 suggereren dat mechanische belasting alleen chondrogenese van mesenchymale stamcellen kan induceren, zelfs in afwezigheid van groeifactoren die essentieel worden beschouwd. Toepassing van intermitterende mechanische belastingen zoals druk of afschuiving tijdens weefselkweek is aangetoond moduleren kraakbeen en botvorming, maar de optimale dosimetrie van lading verschilt cellen en weefsels eigenschappen 11.
De belangrijkste functie van gewrichtskraakbeen is het vermogen om druk-en schuifkrachten weerstaan binnenhet gewricht, dus het moet een hoge druk-en afschuiving moduli hebben. Het ontbreken van functionele mechanische sterkte en fysiologische ultrastructuur in engineered kraakbeen heeft geresulteerd in de verdeling van neo-kraakbeen in vivo en het niet vervangingsstrategieën kraakbeen in gewrichten. Hoewel compressie en afschuiving zijn vaak aangetoond moduleren en verbeteren de mechanische sterkte van gewrichtskraakbeen biocomposieten, een combinatie aanpak is zeldzaam 6,12-15. Wartella en Wayne 16 ontwierp een bioreactor die spanning en compressie te meniscus kraakbeen vervangingen produceren toegepast. Waldman et al.. 15 bedoeld een inrichting voor compressie en afschuiving toepassing chondrocyten gekweekt in een poreuze calcium polyfosfaat substraat. Bian et al.. 17 aangetoond mechanische eigenschappen bijpassende inheemse kraakbeen met het in vitro kweken van volwassen honden chondrocyten in gels en toepassing van bi-axiale mechnische belasting (druksterkte deformational laden en sleepcontact laden).
De biaxiale mechanische belasting bioreactor werd oorspronkelijk ontworpen door Danielle Chu in ons laboratorium met de algemene doelstelling om morfologische aanpassingen induceren in tissue engineered kraakbeen construeert resulteert in een hogere druk-en afschuiving moduli dan momenteel beschikbaar 18. Wij geloven dat dit onderzoek zal aanzienlijk toenemen ons breder begrip van hoe mechanotransductie gemoduleerd om klinisch ingenieur relevante weefsels kunnen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biaxiale Laden Bioreactor Ontwerp
- De bioreactor gebruikt twee fasen vervaardigd door Thor-labs (Newton, MA) voor precisie-geleide laser toepassingen aanbrengen uniaxiaal of biaxiaal mechanische stam gemanipuleerde weefsels, met grote nauwkeurigheid van ladingsdosis (amplitude en frequentie) en toepassing op allerlei weefselkweekomstandigheden van enkele tot 24 putjes (Figuur 1).
- Bi-axiale belasting wordt bereikt door twee travelmax etappes (LNR50SE). Deze stadia zijn orthogonaal in een XZ configuratie gemonteerd. De horizontale fase voorziet in dynamische scheren moties door oscillerende langs de X-as. De verticale trap levert dynamische drukbelasting door oscilleren langs de Z-as. Deze fasen hebben een 50 mm slaglengte en worden onafhankelijk aangedreven door stappenmotor actuatoren (DRV014), bestuurd door een closed-loop stappenmotor driver (BSC102) dat micro-stepping-mogelijkheden beschikt, waardoor stap kleiner dan50 nm.
- De inrichting is op een stijve 25 cm x 30 cm aangebracht x 12,5 mm aluminium voetplaat die wordt gebruikt als een platform voor het monteren van machineonderdelen en monteren van weefselkweekplaten. Verstelbare kinematische stops worden gebruikt om weefselkweek platen vast te zetten op de aluminium bodemplaat. Deze kinematische stops hebben fijnafstelling schroeven te zorgen voor nauwkeurige uitlijning die anders niet haalbaar is met de hand. Het modulaire ontwerp van de basisplaat een soepele plaatsing van deze kinematische stops om platen van verschillende afmetingen en vormen (Petrischalen versus multi-well platen) tegemoet.
- Een op maat gefreesd polysulfone laden glasplaat is gekoppeld aan de bi-axiale bewegend platform via een precisie-gefreesd rechterpunthaakje. Polysulfon materiaal werd gekozen vanwege de biologische verenigbaarheid ervan, het gemak van de bewerking en gemakkelijke sterilisatie.
- Het verloop van de fasen worden gecontroleerd door Thor-labs 'Advanced Positioning Technology (APT) software. De stappenmotor driver is onsed in combinatie met software dat de aanpassing van bewakingsparameters frequentie en amplitude van zowel afschuiving en compressie onafhankelijk en gelijktijdig maakt.
- Positionele feedback wordt verstrekt door lineaire optische encoders die aan elk bewegend platform zijn bevestigd en zijn geïntegreerd met de software. De encoder systeem heeft een bidirectionele herhaalbaarheid van 0,1 micrometer en een resolutie van 20 nm, het vertalen naar een positionele nauwkeurigheid kleiner dan 3 micrometer over de volledige 50 mm van reizen. Deze encoders zorgen voor de nodige terugmelding aan de aandrijfelektronica om ervoor te zorgen ware nanopositioning mogelijkheden en een directe uitlezing van de absolute positie.
- Om de kracht noodzakelijk voor het detecteren feedback contact tussen plaat en monsters en laden reacties een nauwkeurige miniatuur load cell (Honeywell Model 31) gepositioneerd tussen het laden plaat en de bewegende platform (figuur 2) te evalueren. De load cell heeft een hoge nauwkeurigheid van0,15% tot 0,25% volle schaal. Het display (SC500) voor de meetcel kan ook last metingen van maximaal 5 cijfers achter de komma. Daarnaast heeft een RS-232 poort maakt het verzamelen van gegevens op een computer.
2. Cel-Seeded Agarose constructen
- Bereid 4% agarose: Voeg 0,8 g agarose tot 20 ml DMEM (zonder additieven) in een flesje van 50 ml, kook, en blijf dan in 70 ° C oven tot gebruik.
- Stel het volume van de celsuspensie voor dubbele hoeveelheid van het gewenste cel zaaien dichtheid. Deze suspensie wordt gemengd met een gelijk volume van 4% w / v agarose een 2% agarosegel maken op de gewenste zaaidichtheid.
- Plaats zowel de celsuspensie en een 10 ml pipet in de incubator.
- Opgezet gel casting systeem. Een 1.5 mm en een 0,75 mm spacer plaat moeten worden samengevoegd tot een 2,25 mm dikke gel te creëren. Andere maat spacer plaatjes worden gebruikt voor het maken verschillende diktes gel. De gel gietsysteem is niet groot genoeg om deze platen toget houdenhaar, dus moeten stevig worden geplakt om lekken te voorkomen.
- De volgende stap is de celsuspensie snel mengen met de vooraf bereide agarose en pipet in de gel vorm voor de agarose stolt. Verwijder de vloeistof agarose uit de oven en plaats een steriele thermometer erin. De agarose moet afkoelen tot 42-43 alvorens te mengen met cellen ° C. Warmen de celsuspensie tot 37 ° C. Nadat de agarose raakt 43 ° C, snel pipet op de gewenste hoeveelheid en meteen daarna pipet de celsuspensie op en neer een paar keer om te mengen. Dan onmiddellijk pipet het gehele mengsel in de gel vorm.
- Laat de gel stollen gedurende 10-15 minuten en vervolgens voorzichtig kantelen naar een horizontale positie.
- Verwijder de bovenste glasplaat en punch schijven met de biopsie punch. Schijven kunnen worden opgehaald met een kleine steriele spatel. In onze ervaring, een 9 ml gel was groot genoeg om meer dan honderd 5-mm-diameter schijven maken.
3. Cultuur de Schijven
4. Immobilisatie van Monsters voor Mechanische belasting
- Bereid 4% agarose (geen celsuspensie toegevoegd) en de gel moet dunner zijn dan de monsters zelf (om interferentie tijdens het laden te voorkomen) zijn. De aanbevolen dikte is 1,5-1,9 mm (voor 2,25 mm dik stalen).
- Eenmaal gegeleerde, pons 16 mm diameter schijven voor 24 well platen. In elke schijf, punch een gat van 5 mm voor de steekproef te worden geplaatst inch Desgewenst stempel nog eens 5 mm gat aan de rand van de schijf voor het pipet tijdens het verwisselen van media worden geplaatst.
- Zodra agarose putten zijn aangebracht, in 24 putjes, zoals getoond in figuur 3.
- Nadat de agarose wellen zijn in de 24 well plaat, drukt passen monsters in elk putje. Het monster moet uitsteken boven de agarose ook.
5. Mechanische belasting
- Steriliseren glasplaat (Figuur 2).
- Beveilig aluminiumplaat naar cel te laden. Veilige laad-platen / load cell / aluminiumplaat montage aan het podium.
- Schakel stappenmotor controller (schakelaar aan de achterkant).
- Schakel de PC en open "Gebruiker APT"-programma (figuur 4).
- Linkerscherm bestuurt horizontale stappenmotor. Rechterscherm bestuurt verticale stappenmotor. In elk scherm, tabblad "Grafische Control" maakt het mogelijk voor handmatige positionering en tabblad "Move Sequencer" zorgt voor automatisering. Alle units zijn mm.
- Ga naar het tabblad "Grafische Control" op beide schermen in en druk op "Home / Zero"-knop. Beide stappenmotoren hebben een bereik van 50 mm. Door op "Home / Zero" zal zowel stappenmotoren te sturen naar de nulstand (boven-en de meest rechtse posities).
- Prepare de monsters in de 24 wells plaat voor het laden door het verwijderen van sommige media uit elk putje. Niet meer dan 1 ml van de media moet worden overgelaten in elk putje te overstromen tijdens het laden te voorkomen. Zorg ervoor dat er voldoende media is links in de put om het monster bedekt te houden.
- Merk op dat de incubator in lage luchtvochtigheid wordt bewaard tot mislukking instrument te voorkomen.
- Plaats 24 goed plaat in bioreactor en zorgvuldig line-up met de plaat.
- De plaat is bevestigd aan de bioreactor met vier verstelbare kinematische locators. Om het gemakkelijker maken om line-up van de plaat, de twee linker locators zijn pre-gepositioneerd. Draai de twee rechter locators zodat de plaat is veilig. Zorg ervoor dat de plaat omhoog gelijk met de voorzijde van de bioreactor basislijn.
- In het tabblad "Grafische Control", kan een specifiek stappenmotor positie handmatig worden ingevoerd door te klikken op de doos staat. Gebruik deze mogelijkheid om langzaam lager de glasplaat en verplaats deze horizontaal op een lijn met plaat. </ Ol>
- Zodra de plaat dicht bij in contact komt met monsters, beginnen de drukplaat in zeer langzame stappen brengen (0,1 mm) tot de vooraf bepaalde startpositie bereikt (zie deel 6).
- Zodra de uitgangspositie is bereikt, gaat u naar "Move Sequencer" tab en laadt de gewenste verhuizing reeks in door op "Load". Druk vervolgens op "Run" om te beginnen. (Figuur 5) Zie deel 7. Het schrijven van een dosering protocol.
- Wanneer u klaar bent laden, handmatig de glasplaat te verhogen. Eventuele monsters worden geplakt op de glasplaat legt, voorzichtig zet ze terug in de juiste goed af met een steriele spatel.
- Verwijder de 24 wells plaat uit bioreactor en de media te vervangen.
- Verwijder voorzichtig de glasplaat van de load cell en dooft instrumenten.
6. Kalibreren Laden Platen
Om de juiste spanningen worden toegepast op monsters, elke plaat moet nauwkeurig geijkt voorafgaand aan het starten van een experiment.
- Handmatig gezet horizontale stappenmotor op de 25 mm stand.
- Zorgvuldig onderdegel totdat het gewoon nauwelijks in contact komt met de bodem van de bioreactor. Load cell zal verhoogde belastingen tonen op dit punt. Kennis te nemen van de exacte positie van de verticale stappenmotor (zo nauwkeurig mogelijk, als alle compressie rekmetingen zal worden berekend op basis van deze waarde).
- Noteer de positie. Deze waarde wordt gebruikt om een doseringsprotocol basis van monsterafmetingen en de gewenste stammen schrijven.
7. Het schrijven van een Doseren Protocol
- De bioreactor van toepassing kan zowel druk-en afschuifspanning, ofwel gelijktijdig of afzonderlijk. Drie belangrijke parameters moeten worden beslist: tarra stuik, dynamische spanning amplitude, en het laden frequentie.
- Een tarra stam wordt toegepast met het oog op lancering van de glasplaat te voorkomen dat het monster.
- Monster dynamische spanning amplitude en laden frefrequentie worden gekozen.
In deze studie druk-en afschuifspanning definiëren we als volgt: 
Voorbeeld Biaxiale Doseren Protocol
Monster dikte: 2.25 mm
Tarra Strain (compressie): 10% van de monsterdikte (0.225 mm)
Dynamic Strain Amplitude (compressie): 10% (+ / - 5% van de monsterdikte)
Frequentie (Compression): 1 Hz
Dynamische Strain Amplitude (Shear): 25% van de steekproef dikte (0,5625 mm): Shear stress is
toegepast op het monster door de plaat die horizontaal bewegen.
Frequentie (Shear): 0,5 Hz
Typische dosering protocol is 3 uur van het laden per dag.
In dit voorbeeld wordt dynamisch en schuifspanning tegelijk en niet sequentieel toegepast. Wij geloven dat dit patroon beter mimics de complexe lading milieu in de menselijke knie.
- Zodra een dosering protocol is geselecteerd, moet compressie verplaatsingsreeks programma geschreven.
- De verhuizing volgorde is precies wat het klinkt als, een lijst van de posities die de stappenmotor zal verhuizen naar een gespecificeerde acceleratie en maximale snelheid.
- Bereken gewenste verticale posities op basis van doseringsprotocol en glasplaat kalibratie waarde (van deel 6).
- Voorbeeld berekeningen voor glasplaat 1 worden hieronder gegeven:
| Verschil van Kalibratie Waarde | Verticale positie | |
| Glasplaat Calibration Value (accenten onderaan bioreactor) | 0 mm | 29,7700 mm |
| Platen maakt contact met Monster (2.25 mm sample) | 4,4140 mm | 25,3560 mm |
| Stregen (5% Dikte) | 4,3015 mm | 25,4705 mm |
| Stam (10% dikte) | 4,1890 mm | 25,5810 mm |
| Strain (15% dikte) | 4,0765 mm | 25,6955 mm |
- Zodra posities worden berekend, experimenteren met acceleratie en maximale snelheid waarden op de juiste frequentie krijgen. Het aantal cycli worden gekozen overeenkomstig (bijv. 10.800 cycli gedurende 3 uur bij 1 Hz).
- Voorbeeld dynamische compressie Move Sequence Program (10% tarra compressie, 10% dynamische spanning amplitude, 1 Hz) (figuur 5)
- Dynamic shear verplaatsingsreeks programma: Het aantal cycli kiezen naargelang de gewenste frequentie en duur (bijv. 5.400 cycli gedurende 3 uur bij 0,5 Hz).
- Voorbeeld Dynamic Shear Move Sequence Program (10% tare compressie 0,5625 mm (25% van de dikte) dynamic shear strain amplitude, 0,5Hz) (Figuur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het apparaat werd getest door agarose gels geënt met 20 miljoen cellen / ml chondrocyten gekweekt in aanwezigheid van uniaxiale (compressie) of biaxiale (compressie en afschuiving) mechanische belasting. Primaire varkens chondrocyten werden geïsoleerd uit het kraakbeen van 2-4 maanden oude varkens. 5 mm diameter en 1,5 mm dikke monsters werden gekweekt in 2 ml van gedefinieerde chondrogene kweekmedium (hoog glucose DMEM, 1% ITS + Premix, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, 2,5 ug / ml amfotericine B, 50 ug / ml ascorbinezuur, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren (NEAA), 0,4 mM proline,) in 24-putjes platen bij 37 ° C, 5% CO2. 10 -7 M dexamethason en 10 ng / ml TGF-β1 werden geleverd voor de eerste 10 dagen van de cultuur. De monsters werden geladen voor 3 uur / dag tussen dag 10-30. Uniaxiale lading bestond uit 10% compressie peak-to-peak amplitude, 1 Hz en biaxiale laden bestond van 0,15 mm (10% dikte) compressie en 0,075mm shear peak-to-peak amplitude, 1 Hz. De dynamische spanning amplitude en frequentie hiervan zijn gekozen op basis van gepubliceerde studies 17,19. Aan het einde van 30 dagen biochemische en mechanische eigenschappen van engineered kraakbeen werden beoordeeld.
Deze studie gebruikt drie groepen: 1 - Geen lading controle, 2 - eenassige (druksterkte) laden, 3 - tweeassige (druksterkte en afschuiving) laden. De DNA inhoud en natte gewicht van constructen grotendeels gelijk in de drie groepen na 30 dagen kweek (p> 0,05). De GAG gehalte was het hoogst in de groep die werd onderworpen aan biaxiale loading (groep 3, p <0,001 vergeleken met de controlegroep), gevolgd door de eenassige loading groep (groep 2, p <0,05) (Figuur 6). De inhoud GAG van groepen 2 en 3 komen overeen met 48% en 50% van de inheemse kraakbeen respectievelijk. Groep 3 resulteerde in een significant grotere hoeveelheid collageen dan groepen 1 en 2 (p <0,01). Groep 2 had ook dikkere constructies than groep 1 (p <0.01). Verrassenderwijs het evenwicht samendrukkende modulus was het hoogst in groep 2 (eenassige loading, p <0,01) en er waren geen significante verschillen tussen groep 3 en 1. De Young's modulus van groep 2 kwam overeen met 60,1% van de autochtone varkens kraakbeen.
De histologische analyses toonden positieve en homogene kleuring van glycosaminoglycanen (alcianblauw, safranine O) en type II collageen (Figuur 7). Alle groepen gekleurd negatief type I collageen (niet getoond).
Samengevat, deze voorlopige resultaten suggereren dat dit bioreactor met succes toegepast compressie en biaxial (compressie en afschuiving) mechanische belasting tijdens langdurige teelt termijn van gemanipuleerde weefsel. In deze studie werd aangetoond biaxiale loading de proteoglycan en collageen afzetting en de dikte van de tissue engineered kraakbeen monsters. Eenassige compressie verhoogd zowel de proteoglycanen depositie en de Young's modulus.
Figuur 1. Biaxiale lading wordt bereikt door het X-fase (afschuiving) en de Z-fase (compressie). De figuur toont een maat loading platen aan de stadia samples in een 24-wells plaat. Het laad parameters worden geregeld met een computer verbonden met de stappenmotoren 18.
Figuur 2. Links: De polysulfone laden glasplaat ontworpen voor 24-well platen. Rechts: Het laden glasplaat bevestiging aan de biaxiale laden bioreactor.
Figuur 3. Voorbereiding van de agarose putten voor het immobiliseren van monsters tijdens schuifspanning. Het geïmmobiliseerde construct geplaatst in de agarose goed voor mechanische belasting. Deze figuur toont een 1,5 mm dik agarose goed en een 2,25 mm dik monster.
Figuur 4. De grafische user interface voor de biaxiale laden apparaat te bedienen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50387/50387fig5.jpg "/>
Figuur 5. Voorbeeld Biaxiale Laden Move Sequence Programma Graphical User Interface: dynamische compressie Move Sequence Program (10% tarra compressie, 10% dynamische spanning amplitude, 1 Hz) en Dynamic Shear Move Sequence Program (10% tarra compressie, 25% dynamische afschuifhoek amplitude, 0.5 Hz). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 6. Biochemische en mechanische testresultaten (n = 6) *** p <0,001, ** p <0,01, * p <0,05 vergeleken met groep 1 (ongeladen control Groep 2:.. Eenassige drukbelasting, groep 3: Biaxial druk-en afschuifkrachten laden.
Figuur 7. Histologie: alcianblauw / kernechtrood kleuring, Safranine O / fast groen, immunochimie voor type II collageen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben ontworpen een laad-apparaat dat in staat is om het toepassen van eenassige of tweeassige mechanische belasting op weefselmanipulatieproducten constructies gefabriceerd voor transplantatie. De inrichting kan worden gebruikt als een bioreactor voor de in vitro kweek van gemanipuleerde biocomposieten of een testinrichting voor de mechanische eigenschappen van het natieve weefsel of als andere behandelingen voor beschrijven. De inrichting proefpersonen ontworpen weefselconstructen aan biaxiale mechanische belasting met grote precisie ladingsdosis (amplitude en frequentie) en toepassing op een breed scala van weefselkweek omstandigheden van enkele tot 24 putjes.
De toepassing van schuifspanning gepresenteerd een set unieke uitdagingen voor het ontwerp van het systeem. Om overdracht voedingsstoffen te maximaliseren, werden constructen oorspronkelijk onbeperkt in individuele wells van een 24 wells plaat. Dit niet vormen een probleem voor de dynamische compressie, zoals de tarra stuik verzekerd datsample-glasplaat contact werd niet verloren. Wanneer afschuifhoek het protocol werd toegevoegd, echter onbeperkte monsters gleed langs de onderkant van de plaat en wat verloren contact met de plaat. Bovendien, tijdens biaxiale laden protocollen monsters hadden de neiging om om te draaien, waardoor inconsistente laden. We dit probleem opgelost door het creëren van de agarose putten monsters immobiliseren zoals beschreven in de procedure. Deze agarose putten toelaten consistente biaxiale laden van monsters zonder beperking van beschikbaarheid van voedingsstoffen aan monsters.
In tegenstelling tot de compressie bioreactoren die zeer grote schaal worden onderzocht 20,21, ons apparaat is geschikt voor het toepassen van nauwkeurige spanningen op meerdere assen. Deze assen kunnen onafhankelijk worden geregeld. Multiaxiale belasting kan achtereenvolgens of gelijktijdig worden toegepast. Het is mogelijk de uitvoering een derde Y-as op mechanische belasting voorzien in drie dimensies beter nabootsen in vivo omstandigheden.
Terwijlandere multiaxiale bioreactoren ontwikkeld om de mechanische omgeving van het gewricht nabootsen, ze grote beperkingen tegenover ons systeem. Een afschuiving en compressie apparaten ontworpen door Frank, et al.. kunnen maximaal 12 monsters gelijktijdig met last feedback worden geladen, worden echter constructen niet afgesloten of beveiligd 6. Tijdens experimenten met afschuifhoek, is het essentieel dat constructies worden bevestigd zodat ze niet schuiven onder het laden glasplaat. Sliding zal resulteren in een ongelijke en inconsistente afschuiving laden van het monster. Nieuwere bioreactoren, zoals de unieke 'rollende bal "systeem 22,23 en een tweeassige stimulatie-apparaat 16, maakt u een veel realistischer en consistente lading milieu, maar ze staan alleen een monster tegelijk worden geladen. Grote steekproefomvang zijn essentieel voor het uitvoeren van de noodzakelijke biochemische, mechanische en histologische analyses op de constructen met een hoge mate van vertrouwen. Addinaal, de "rollende bal" systeem ontbeert force feedback, een essentiële maatregel van construct ontwikkeling gedurende lange termijn in vitro teelt. Het laat ook de preventie van glasplaat-specimen non-contact en specimen overbelasting, die onherstelbaar beschadigen tissue engineered constructies. Een glijcontact bioreactor ontwikkeld door Bian, et al.. Kunnen maximaal vier constructen tegelijk worden geladen, maar mist nog deze waardevolle forcefeedback-mechanisme 17.
De huidige opstelling met 24 putjes kunnen tegelijk laden van 24 monsters, meer monsters zijn mogelijk met modificaties van de geometrie van de belasting plaat. Het laden glasplaat biedt enorme flexibiliteit om het nieuwe design. Het gekozen materiaal polysulfone poreus is, kan worden gesteriliseerd en gecultiveerd in de vochtige en warme omgeving van een incubator. Het is gemakkelijk bewerkbaar, waardoor verschillende geometrieën en aantallen monsters tegelijkertijd worden geladenly.
Kortom, de nieuwe biaxiale laden bioreactor voor tissue engineering maakt op lange termijn in vitro teelt van tissue engineered constructen. Biaxiale laden verhoogde de proteoglycanen en collageen depositie en de dikte van het weefsel engineered kraakbeen monsters, maar leek niet te veel invloed op de mechanische eigenschappen van gemanipuleerde kraakbeen als we veronderstelden. Eenassige compressie verhoogd zowel de proteoglycanen depositie en de Young's modulus. Wij geloven dat de optimale dosis van mechanische belasting verschilt cellen en weefsels eigenschappen. Toekomstige studies van collageen architectuur en dosimetrie van lading zal ons toelaten om de effecten van biaxiale lading volledig te evalueren op de ontwikkeling van gemanipuleerde weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Bureau van Onderzoek en Ontwikkeling, RR & D service, US Department of Veterans Affairs, NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 en het ministerie van Defensie W81XWH-10-1-0643.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. Bilgen, B., et al. 57th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (ORS), , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
