Summary
قمنا بتصميم رواية مفاعل حيوي جار الميكانيكية التي يمكن أن تنطبق ذو محورين أو ذو محورين سلالة الميكانيكية إلى biocomposite الغضروف قبل الزرع إلى خلل الغضروف المفصلي.
Abstract
قمنا بتصميم جهاز التحميل التي هي قادرة على تطبيق أحادي المحور أو ذو محورين سلالة الميكانيكية للأنسجة وbiocomposites هندسيا ملفقة لزرع. في حين أن الجهاز يعمل في المقام الأول باعتباره مفاعل حيوي الذي يحاكي سلالات الميكانيكية الأم، يتم تجهيزه أيضا مع خلية الحمل لتوفير التغذية المرتدة للقوة أو الاختبارات الميكانيكية للبنيات. الموضوعات جهاز هندسيا يبني الغضروف لتحميل الميكانيكي ذو محورين بقدر كبير من الدقة من جرعة التحميل (السعة والتردد) ومضغوط بما يكفي لتناسب داخل نسيج الثقافة الحاضنة القياسية. فإنه يحمل العينات مباشرة في لوحة زراعة الأنسجة، والأحجام لوحة متعددة متوافقة مع النظام. وقد تم تصميم الجهاز باستخدام المكونات المصنعة لتطبيقات الليزر الموجهة بدقة. ويتم إنجاز التحميل ثنائية المحوري بواسطة مرحلتين متعامد. المراحل لديها مجموعة والسفر 50 ملم وتكون مدفوعة بشكل مستقل من قبل السائر المحركات المحركات، التي تسيطر عليهاسائق حلقة مغلقة السائر المحركات التي تتميز قدرات الجزئي خطوة، خطوة تمكين أحجام أقل من 50 نانومتر. ويقترن A polysulfone التحميل الصوانى إلى منصة متحركة ثنائية المحوري. يتم التحكم في الحركات من المراحل من قبل ثور-مختبرات متطورة تكنولوجيا تحديد المواقع (APT) والبرمجيات. ويستخدم السائق السائر المحركات مع البرنامج لضبط المعلمات حمولة من التردد والسعة من كلا القص وضغط بشكل مستقل في وقت واحد. يتم توفير ردود الفعل الموضعية عن طريق الترميز الخطي البصرية التي تحتوي على التكرار ثنائية الاتجاه من 0.1 ميكرون وقرار من 20 نانومتر، وترجمة لدقة الموضعية أقل من 3 ميكرون على كامل 50 ملم من السفر. هذه الترميز وتوفير التغذية المرتدة الموقف اللازم للإلكترونيات حملة لضمان قدرات nanopositioning صحيح. من أجل توفير التغذية المرتدة للقوة للكشف عن الاتصال وتقييم الاستجابات التحميل، يتم وضع الدقة تحميل خلية مصغرة بين الصوانى التحميل وموفنز منصة. الخلية الحمل لديها دقة عالية من 0.15٪ إلى 0.25٪ نطاق كامل.
Introduction
لقد قمنا بتصميم مفاعل حيوي التحميل التي هي قادرة على تطبيق أحادي المحور أو ذو محورين سلالة الميكانيكية للأنسجة وbiocomposites هندسيا ملفقة لزرع. تم تصميم هذا الجهاز في المقام الأول باعتباره مفاعل حيوي لاستبدال هندسيا للغضروف مفصلي، ويمكن أن تستخدم أيضا لغيرها من الأنسجة الحاملة في جسم الإنسان. الدافع لدينا في هذا التصميم مفاعل حيوي ينبع من Drachman وسوكولوف 1، الذي قدم الملاحظة المنوية من تشكيل غير طبيعي للغضروف مفصلي في افراخ الدجاج مشلولة بسبب غياب الحركة. وبالمثل، ممارسة الرياضة البدنية أمر ضروري لتطوير العضلات العادية والعظام. وتمشيا مع هذا المفهوم، حققت العديد من المجموعات البحثية كيف سائط مختلفة من المحفزات المادية خلال زراعة في المختبر ينظم الخصائص الكيميائية الحيوية والميكانيكية للbiocomposites خلية بيولوجية وإإكسبلنتس الأنسجة 2-7. مفهوم هندسة الأنسجة وظيفيةينطوي على استخدام المختبر في من المحفزات الميكانيكية لتحسين الخواص الوظيفية للأنسجة، أي الخواص الميكانيكية التي تمكن من الأنسجة لتحمل الإجهاد المتوقع في الجسم الحي، ويجهد 8،9. الإبلاغ عن العديد من الدراسات التحميل الميكانيكية استخدام من حيث القص وضغط لتحفيز يبني الغضروف المفصلي هندسيا للمفاصل. Mauck وآخرون. 10 تشير إلى أن التحميل الميكانيكية وحدها يمكن أن تحفز تكون الغضروف الخلايا الجذعية الوسيطة حتى في غياب عوامل النمو التي تعتبر حيوية. وقد تبين تطبيق جار الميكانيكية متقطعة مثل الضغط أو القص أثناء زراعة الأنسجة لتعديل الغضروف وتكوين العظام، ولكن قياس الجرعات المثلى من جار يختلف مع الخلية وخصائص الأنسجة 11.
أهم وظيفة من الغضروف المفصلي هو القدرة على الصمود أمام قوات الضغط والقص داخلالمفصل، وبالتالي فإنه لا بد أن يكون الضغط العالي ومعاملات الرجوعية القص. وقد أدى عدم وجود القوة الميكانيكية وظيفية والتركيب الدقيق الفسيولوجية في الغضروف هندسيا في انهيار الجدد على الغضروف في الجسم الحي وفشل استراتيجيات استبدال الغضروف في المفاصل. على الرغم من الضغط والقص أثبتت عادة لتعديل وتحسين القوة الميكانيكية من biocomposites الغضروف المفصلي، وهو نهج مزيج نادر 6،12-15. Wartella وواين 16 تصميم مفاعل حيوي أن يطبق التوتر وضغط لإنتاج بدائل الغضروف الهلالي. والدمان وآخرون. 15 تصميم جهاز لتطبيق الضغط والقص إلى غضروفية تربيتها في مسامية الكالسيوم الركيزة متعدد الفوسفات. بيان وآخرون. أظهرت 17 الخواص الميكانيكية مطابقة الغضروف الأصلي مع زراعة في المختبر من غضروفية الكلاب الكبار في المواد الهلامية وتطبيق ذو محورين الميكانيكيةanical التحميل (الضغط التشوهي التحميل وانزلاق جار الاتصال).
تم تصميم مفاعل حيوي ذو محورين جار الميكانيكية الأصلية كتبت بواسطة دانيال تشو في مختبرنا مع الهدف العام للحث على التكيفات المورفولوجية في أنسجة الغضروف المهندسة يبني مما أدى إلى معاملات الرجوعية الضغط والقص أعلى من المتاحة حاليا 18. ونحن نعتقد أن هذا البحث زيادة كبيرة في فهم أوسع لكيفية mechanotransduction يمكن التضمين لهندسة الأنسجة سريريا ذات الصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ذو محورين جار تصميم مفاعل حيوي
- مفاعل حيوي يعمل على مرحلتين المصنعة من قبل ثور-مختبرات (نيوتن، MA) لتطبيقات الليزر الموجهة بدقة لتطبيق ذو محورين أو ذو محورين سلالة الميكانيكية إلى الأنسجة المهندسة، بقدر كبير من الدقة من جرعة التحميل (السعة والتردد) وتطبيقها على مجموعة واسعة من شروط زراعة الأنسجة من واحد الى 24 لوحات جيدة (الشكل 1).
- ويتم إنجاز التحميل ثنائية المحوري بواسطة مرحلتين TravelMax (LNR50SE). هي التي شنت هذه المراحل متعامد في تكوين XZ. يوفر مرحلة الأفقي الاقتراحات القص الديناميكية التي تتأرجح على طول محور X. يوفر مرحلة الرأسي التحميل الضغط الديناميكي بواسطة تتأرجح على طول المحور Z. هذه المراحل لديها مجموعة والسفر 50 ملم وتكون مدفوعة بشكل مستقل من قبل السائر المحركات محرك (DRV014)، التي تسيطر عليها سائق حلقة مغلقة السائر المحركات (BSC102) أن ملامح قدرات الجزئي خطوة، خطوة تمكين أحجام أقل من50 نانومتر.
- هي التي شنت الجهاز على جامدة 25 سم × 30 سم × 12.5 ملم الألومنيوم قاعدة لوحة يستخدم كمنصة لتجميع مكونات الجهاز وللتركيب لوحات زراعة الأنسجة. وتستخدم محطات الحركية قابل للتعديل لقفل لوحات زراعة الأنسجة في مكان على لوحة الألومنيوم قاعدة. هذه مواقف الحركية لديهم مسامير التكيف غرامة للسماح للمحاذاة دقيقة وهذا هو خلاف ذلك لا يمكن تحقيقه باليد. تصميم وحدات من قاعدة لوحة يسمح لوضع مرنة من هذه الحركية توقف لاستيعاب لوحات من الأحجام والأشكال (أطباق بتري مقابل لوحات متعددة جيدا) مختلفة.
- ويقترن مخصص تشكيله polysulfone التحميل الصوانى إلى منصة متحركة ثنائية المحوري عبر الدقة تشكيله الحق قوس الزاوية. وقد تم اختيار المواد Polysulfone نظرا لتوافق مع الحياة، وسهولة التشغيل الميكانيكي، وسهولة التعقيم.
- يتم التحكم في حركات مراحل متقدمة تكنولوجيا تحديد المواقع عن طريق ثور-مختبرات '(APT) والبرمجيات. لسائق السيارات السائر هو لناإد في تركيبة مع البرنامج الذي يسمح التعديل من المعلمات حمولة من التردد والسعة لكل من القص وضغط بشكل مستقل في وقت واحد.
- يتم توفير ردود الفعل الموضعية عن طريق الترميز الخطي البصرية التي تعلق على كل منصة متحركة وتتكامل مع البرنامج. نظام التشفير لديه التكرار ثنائية الاتجاه من 0.1 ميكرون وقرار من 20 نانومتر، وترجمة لدقة الموضعية أقل من 3 ميكرون على كامل 50 ملم من السفر. هذه الترميز وتوفير التغذية المرتدة الموقف اللازم للإلكترونيات حملة لضمان قدرات nanopositioning صحيح وقراءات مباشرة من موقف المطلقة.
- من أجل توفير التغذية المرتدة للقوة اللازمة للكشف عن اتصال بين الصوانى والعينات وتقييم الاستجابات التحميل ودقة مصغر خلية الحمل (هانيويل نموذج 31) يتوضع بين التحميل الصوانى ومنصة متحركة (الشكل 2). الخلية الحمل لديها دقة عالية من0.15٪ إلى 0.25٪ نطاق كامل. يمكن وحدة العرض (SC500) للخلية الحمل أيضا توفير قياسات الحمل لمدة تصل إلى 5 منازل عشرية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يحتوي على منفذ RS-232 للسماح لجمع البيانات على جهاز كمبيوتر.
2. خلية المصنفة التركيبات الاغاروز
- إعداد 4٪ الاغاروز: إضافة 0.8 غرام الاغاروز إلى 20 مل DMEM (أي إضافات) في قارورة مل 50، يغلي، ثم نضع في الفرن 70 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- ضبط مستوى الصوت من تعليق خلية لكمية مضاعفة من كثافة بذر الخلية المطلوبة. يتم خلط هذا التعليق مع حجم مساو من 4٪ ث / ت الاغاروز لإنشاء 2٪ agarose هلام في كثافة البذر المطلوب.
- وضع كل من تعليق خلية واحدة 10 مل ماصة في الحاضنة.
- اقامة نظام الصب هلام. وينبغي وضع واحد 1.5 ملم واحدة 0.75 ملم لوحة فاصل معا لخلق 2.25 ملم هلام سميكة. ويمكن استخدام حجم التبادل غيرها من لوحات لإنشاء سمك هلام مختلفة. نظام الصب هلام ليست كبيرة بما يكفي لعقد هذه اللوحات togetلها، لذلك يجب أن تكون مسجلة بشكل آمن لمنع تسريب المعلومات.
- والخطوة التالية هي لخلط بسرعة تعليق الخلية مع معدة مسبقا الاغاروز وماصة في القالب هلام قبل يتصلب الاغاروز. إزالة الاغاروز السائل من الفرن ووضع ميزان حرارة العقيمة في ذلك. الاغاروز يجب أن تبرد إلى 42-43 درجة مئوية قبل الاختلاط مع الخلايا. الاحماء تعليق الخلية إلى 37 درجة مئوية. وبمجرد أن يضرب الاغاروز 43 ° C، بسرعة ماصة صعودا المبلغ المطلوب ومن ثم ماصة على الفور تعليق الخلية صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط. ثم ماصة على الفور الخليط كله في القالب هلام.
- السماح لترسيخ هلام لمدة 10-15 دقيقة ثم إمالة بعناية إلى وضع أفقي.
- إزالة لوحة من الزجاج العلوي والأقراص لكمة مع خزعة لكمة. الأقراص يمكن التقاطها مع ملعقة صغيرة معقمة. في تجربتنا، وكان 9 مل هلام كبيرة بما يكفي لجعل أكثر من مائة أقراص 5 ملم القطر.
3. ثقافة الأقراص
4. الشلل من العينات لتحميل الميكانيكية
- إعداد 4٪ الاغاروز (لا تعليق خلية عند إضافته) وينبغي أن يكون جل أرق من عينات أنفسهم (لمنع التدخل أثناء التحميل). سمك الموصى بها هي 1،5-1،9 ملم (2.25 لعينات سميكة ملم).
- مرة واحدة تبلور، لكمة 16 ملم أقراص قطرها عن 24 لوحات جيدة. في كل قرص، لكمة واحد 5 مم حفرة لعينة لتوضع فيه. إذا كان المطلوب، لكمة 5 مم ثقب آخر على حافة القرص للماصة لتوضع خلال التغييرات الوسائط.
- مرة واحدة وقد بذلت الاغاروز الآبار، مكان في 24 لوحة جيدا، كما هو مبين في الشكل (3).
- مرة واحدة في الاغاروز ثells هي في 24 لوحة جيدا، اضغط تناسب العينات في كل بئر. العينة يجب أن نتأ من أعلى البئر الاغاروز.
5. جار الميكانيكية
- تعقيم الصوانى (الشكل 2).
- تأمين لوحة الألومنيوم لتحميل الخلية. آمنة الصوانى / خلية / الألومنيوم حمولة لوحة التجميع إلى مرحلة التحميل.
- تشغيل وحدة تحكم محرك السائر (التبديل في الظهر).
- بدوره على فتح برنامج "المستخدم APT" (الشكل 4) PC و.
- شاشة اليسار يسيطر الأفقي السائر المحركات. الشاشة الأيمن يسيطر على رأسي السائر المحركات. في كل شاشة، "التحكم الرسومية" علامة التبويب يسمح لتحديد المواقع والدليل "التسلسل تحريك" علامة التبويب يسمح لأتمتة. جميع الوحدات مم.
- انتقل إلى "التحكم الرسومية" علامة على كل الشاشات واضغط على "الصفحة الرئيسية / صفر" الزر. كلا السائر المحركات لديها مجموعة من 50 ملم. الضغط على "الصفحة الرئيسية / صفر" سوف ترسل كلا المحركات السائر إلى الموضع صفر (أعلى وأقصى اليمين وظيفة).
- Preparه العينات في 24 لوحة جيدا لتحميل عن طريق إزالة بعض وسائل الإعلام من كل بئر. ينبغي أن يترك ما لا يزيد عن 1 مل من وسائل الإعلام في كل بئر لمنع تجاوز أثناء التحميل. تأكد من أن يتم ترك ما يكفي من وسائل الاعلام في البئر للحفاظ على عينة المشمولة.
- لاحظ أن الحاضنة يتم الاحتفاظ بها في ظروف الرطوبة المنخفضة لمنع فشل الصك.
- مكان 24 لوحة جيدا في مفاعل حيوي وخطا دقيقا حتى مع الصوانى.
- يتم تأمين لوحة لمفاعل حيوي باستخدام أربعة تحديد المواقع الحركية قابل للتعديل. لجعله أسهل ليصطف على الصوانى، وهما تحديد المواقع اليسرى وقد تم وضعه مسبقا. تشديد اثنين من معينات المواقع الحق في ذلك أن لوحة آمنة. تأكد من يبطن لوحة حتى الاحمرار مع الجزء الأمامي من قاعدة مفاعل حيوي.
- في "التحكم الرسومية" علامة التبويب، موضع معين السائر المحركات يمكن إدخالها يدويا عن طريق النقر على مربع موقف. استخدام هذه الإمكانية لخفض ببطء الصوانى وتحريكه أفقيا ليصطف مع لوحة. </ OL>
- مرة واحدة في الصوانى بالقرب القادمة في اتصال مع العينات، والبدء في تقديم الصوانى أسفل بزيادات بطيئة جدا (0.1 ملم) حتى تصل إلى نقطة الانطلاق المحددة سلفا (انظر الجزء 6).
- مرة واحدة يتم الوصول إلى نقطة الانطلاق، انتقل إلى "تحريك التسلسل" علامة التبويب وتحميل تسلسل الخطوة المطلوبة بالضغط على "تحميل". ثم اضغط على "تشغيل" لبدء. (الشكل 5) انظر الجزء 7. كتابة بروتوكول الجرعات.
- عند الانتهاء من التحميل، ورفع الصوانى يدويا. إذا كنت عالقة أي عينات إلى الصوانى، وضعت بعناية مرة أخرى في مناسبة جيدا باستخدام ملعقة معقمة.
- إزالة 24 لوحة جيدا من مفاعل حيوي واستبدال وسائل الإعلام.
- بعناية إزالة الصوانى من الخلية تحميل وثم إيقاف الصكوك.
6. معايرة تحميل الصوانى
لضمان أن يتم تطبيق سلالات السليم للعينات، كل الصوانى يجب معايرة بعناية قبل بدء التجربة.
- وضع يدويا الأفقي السائر المحركات في موقف مم 25.
- انخفاض بعناية الصوانى حتى بالكاد يأتي في اتصال مع قاعدة من مفاعل حيوي. سوف تحميل الخلية تظهر زيادة الأحمال في هذه المرحلة. يحيط علما الموضع الدقيق للالسائر المحركات عمودي (تكون دقيقة قدر الإمكان، كما سيتم احتساب جميع القياسات سلالة ضغط من هذه القيمة).
- تسجيل موقف. وسوف تستخدم هذه القيمة لكتابة بروتوكول الجرعات على أساس عينة الأبعاد والسلالات المرغوبة.
7. كتابة بروتوكول الجرعات
- مفاعل حيوي قادر على تطبيق الضغط على حد سواء الضغط والقص، وإما في وقت واحد أو بشكل فردي. ويجب أن يقرر ثلاثة معالم رئيسية هي: الفارغة سلالة الضغط، السعة الحيوية سلالة، وتردد التحميل.
- يتم تطبيق سلالة الفارغة من أجل منع الاقلاع من الصوانى من العينة.
- عينة ديناميكية السعة سلالة وتحميل الصحائفويتم اختيار الجنوح.
في هذه الدراسة أن نحدد سلالة الضغط والقص على النحو التالي: 
بروتوكول الجرعات ذو محورين سبيل المثال
سماكة العينة: 2.25 مم
الفارغة سلالة (ضغط): 10٪ من عينة سماكة (0.225 مم)
السعة الإجهاد الحيوي (ضغط): 10٪ (+ / - 5٪ من سمك العينة)
تردد (ضغط): 1 هرتز
السعة الحيوية سلالة (القص): 25٪ من سمك العينة (0.5625 ملم): إجهاد القص هو
تطبيقها على عينة من الصوانى تتحرك أفقيا.
تردد (القص): 0.5 هرتز
بروتوكول الجرعات النموذجية هي 3 ساعة من التحميل في اليوم الواحد.
في هذا المثال، يتم تطبيق تحميل الديناميكي والقص في وقت واحد بدلا من بالتسلسل. ونحن نعتقد أن هذا النمط أفضل MIMICS البيئة التحميل معقدة في الركبة الإنسان.
- مرة واحدة وقد تم اختيار بروتوكول الجرعات، يجب أن تكون مكتوبة على برنامج التحرك تسلسل ضغط.
- تسلسل الخطوة هو بالضبط ما يبدو، لائحة من المواقع التي السائر المحركات سينتقل إلى في تسريع المحدد والحد الأقصى للسرعة.
- حساب المواقف الرأسي المطلوب يعتمد على الجرعات البروتوكول وقيمة المعايرة الصوانى (من الجزء 6).
- يتم توفير حسابات سبيل المثال لالصوانى 1 أدناه:
| الفرق من قيمة المعايرة | الوضع الرأسي | |
| الصوانى قيمة المعايرة (اللمسات السفلي من مفاعل حيوي) | 0 مم | 29،7700 مم |
| الصوانى يجعل الاتصال مع عينة (2.25 ملم العينة) | 4.4140 مم | 25،3560 مم |
| شارعأمطار (5٪ سماكة) | 4.3015 مم | 25،4705 مم |
| سلالة (10٪ سماكة) | 4.1890 مم | 25،5810 مم |
| سلالة (15٪ سماكة) | 4.0765 مم | 25،6955 مم |
- مرة واحدة يتم احتساب المناصب، والتجربة مع تسارع والقيم السرعة القصوى للحصول على التردد الصحيح. ينبغي اختيار عدد من الدورات، وفقا لذلك (على سبيل المثال 10،800 دورات لمدة 3 ساعة على 1 هرتز).
- الديناميكي ضغط البرنامج تسلسل تحريك سبيل المثال (10٪ الفارغة ضغط، 10٪ دينامية السعة سلالة، 1 هرتز) (الشكل 5)
- ديناميكية القص برنامج تسلسل التحرك: وينبغي اختيار عدد من الدورات وفقا لتردد المطلوب والمدة (على سبيل المثال 5،400 دورات لمدة 3 ساعة على 0.5 هرتز).
- الديناميكي القص برنامج تسلسل تحريك سبيل المثال (10٪ الفارغة ضغط، 0.5625 ملم (25٪ من سمك) دينامية القص السعة سلالة، 0.5هرتز) (الشكل 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم اختبار الجهاز باستخدام الاغاروز المواد الهلامية المصنف مع 20 مليون خلية / مل غضروفية وزراعتها في وجود أحادي المحور (ضغط) أو ذو محورين (الضغط والقص) تحميل الميكانيكية. تم عزل غضروفية الخنازير الأساسي من الغضروف المفصلي من 2-4 الخنازير القديمة الشهر. ومثقف 5 مم وقطرها 1.5 عينات سميكة ملم في 2 مل من مستنبت محدد مكون للغضروف (ارتفاع مستوى السكر في DMEM، 1٪ + بريمكس ITS، و 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 2 مم L-الجلوتامين، 2.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B، 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، 0.4 ملم البرولين،) في 24 لوحات جيدة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. تم تزويد 10 -7 M ديكساميثازون و 10 نانوغرام / مل TGF-β1 لأول 10 أيام من الثقافة. تم تحميل هذه العينات لمدة 3 ساعة / يوم بين 10-30 يوما. وتألفت التحميل أحادي المحور من 10٪ ضغط ذروة إلى ذروة السعة، 1 هرتز وجار ذو محورين يتألف من 0.15 ملم (10٪ سمك) ضغط و0.075مم القص الذروة إلى الذروة السعة، 1 هرتز. يتم اختيار السعة الحيوية وسلالة تردد التحميل على أساس الدراسات التي نشرت 17،19. في نهاية 30 يوما تم تقييم الخصائص الكيميائية الحيوية والميكانيكية للغضروف هندسيا.
استخدمت هذه الدراسة ثلاث مجموعات: 1 - لا تحكم التحميل، 2 - أحادي المحور (الضغط) تحميل، 3 - ذو محورين (الضغط والقص) تحميل. ظلت محتويات الحمض النووي والأوزان الرطب من بنيات مماثلة في المجموعات الثلاث بعد 30 يوما من زراعة (P> 0.05). وكان المحتوى GAG أعلى في المجموعة التي تعرضت للجار ذو محورين (المجموعة 3، P <0.001 بالمقارنة مع مجموعة المراقبة)، تليها الفئة جار أحادي المحور (المجموعة 2، P <0.05) (الشكل 6). محتويات GAG المجموعات 2 و 3 تتوافق مع 48٪ و 50٪ من الغضروف الأصلي، على التوالي. أدت المجموعة 3 في مبلغ أعلى بكثير من الكولاجين من المجموعات 1 و 2 (P <0.01). وكان الفريق 2 أيضا سمكا بنيات ثان المجموعة 1 (P <0.01). والمثير للدهشة، وكان معامل التوازن الضغط يونغ أعلى في المجموعة 2 (جار ذو محورين، P <0.01) وعدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعة 3 و 1. معامل يونغ من المجموعة 2 يتفق مع 60.1٪ من الغضروف الخنازير الأم.
وأشارت التحليلات النسيجية تلطيخ إيجابية ومتجانسة لالجليكوزامينوجليكان (زرقة الألسيان، safranin O) والنوع الثاني الكولاجين (الشكل 7). جميع الفئات ملطخة السلبية للنوع الأول من الكولاجين (لا يظهر).
وباختصار، تشير هذه النتائج الأولية أن هذا مفاعل حيوي تطبيقها بنجاح ضغط وذو محورين (الضغط والقص) تحميل الميكانيكية أثناء زراعة على المدى الطويل من الأنسجة هندسيا. في هذه الدراسة تم إظهار جار ذو محورين للبروتيوغليكان وترسب الكولاجين وسماكة أنسجة الغضروف عينات هندسيا. زيادة ضغط أحادي المحور كل من ترسب وبروتيوغليكان معامل يونغ.
الشكل 1. ويتم إنجاز جار ذو محورين من مراحل X (قص) وZ-مرحلة (ضغط). يظهر الرقم الصوانى التحميل حسب الطلب تعلق على مراحل لتحميل العينات في 24 لوحة جيدا. يتم التحكم المعلمات التحميل مع جهاز كمبيوتر متصلة بشبكة المحركات السائر 18.
الشكل 2. اليسار: polysulfone التحميل الصوانى مصممة لل24 لوحات جيدة. اليمين: تحميل المرفقات الصوانى إلى مفاعل حيوي جار ذو محورين.
الشكل (3). إعداد الاغاروز الآبار للشل حركة عينات أثناء التحميل القص. وبناء يجمد وضعها في الاغاروز جيدا للتحميل الميكانيكية. يعرض هذا الشكل 1.5 مم الاغاروز جيدا و2.25 ملم عينة سميكة.
الشكل 4. واجهة مستخدم رسومية للتحكم في الجهاز ذو محورين التحميل. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
hres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50387/50387fig5.jpg "/>
الشكل 5. مثال ذو محورين جار نقل تسلسل برنامج واجهة المستخدم الرسومية: ضغط البرنامج تسلسل نقل الحيوي (10٪ الفارغة ضغط، 10٪ دينامية السعة سلالة، 1 هرتز) والبرنامج تسلسل نقل القص الديناميكي (10٪ الفارغة ضغط، 25٪ دينامية القص السعة سلالة، 0.5 هرتز). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل (6). نتائج الاختبارات البيوكيميائية والميكانيكية (ن = 6) *** P <0.001 **، P <0.01، * P <0.05 مقارنة مع مجموعة 1 (مراقبة تفريغ المجموعة 2:. تحميل الضغط أحادي المحور، المجموعة 3: الضغط ذو محورين والقص تحميل.
together.within الصفحات = "دائما"> 
الرقم 7. علم الأنسجة: زرقة الألسيان / تلطيخ الأحمر سريع النووية، Safranin O / سريع الخضراء، كيمياء مناعية للنوع الثاني الكولاجين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد قمنا بتصميم جهاز التحميل التي هي قادرة على تطبيق أحادي المحور أو ذو محورين سلالة الميكانيكية للأنسجة بنيات هندسيا ملفقة لزرع. الجهاز يمكن أن تستخدم مفاعل حيوي لزراعة في المختبر من biocomposites هندسيا أو كجهاز اختبار لوصف الخصائص الميكانيكية للأنسجة الأم أو بعد العلاجات الأخرى قبل. الموضوعات جهاز هندسيا يبني الأنسجة لتحميل الميكانيكي ذو محورين بقدر كبير من الدقة من جرعة التحميل (السعة والتردد) وتطبيقها على مجموعة واسعة من الظروف زراعة الأنسجة من واحد الى 24 لوحات جيدة.
تقديم الطلب من التحميل القص مجموعة من التحديات الفريدة لتصميم هذا النظام. لتعظيم نقل المواد الغذائية، وغير محصورة أصلا يبني في الآبار الفردية من 24 لوحة جيدا. وهذا لا يمثل مشكلة للضغط ديناميكي، كما سلالة الضغط الفارغة المؤمن أنلم فقدت الاتصال عينة الصوانى. عندما أضيف سلالة القص في البروتوكول، ومع ذلك، انخفض عينات غير محصورة على طول الجزء السفلي من لوحة وبعض فقدت الاتصال مع الصوانى. بالإضافة إلى ذلك، خلال محورين التحميل بروتوكولات عينات كان الميل إلى الوجه أكثر، مما تسبب في تحميل غير متناسقة. أننا نجحنا في حل هذه المشكلة عن طريق إنشاء الآبار الاغاروز لشل حركة العينات كما هو موضح في الإجراء. هذه الاغاروز الآبار تسمح جار ذو محورين ثابت من العينات دون الحد من توافر المواد الغذائية لعينات.
على عكس المفاعلات الحيوية ضغط التي يتم بحثها على نطاق واسع جدا 20،21، لدينا جهاز قادر على تطبيق سلالات دقيقة على محاور متعددة. هذه المحاور يمكن التحكم بشكل مستقل. تحميل عديد المحاور يمكن تطبيقها بالتتابع أو في وقت واحد. فمن الممكن لتنفيذ الثلث العمودي لتوفير التحميل الميكانيكية في ثلاثة أبعاد لتقليد أفضل في ظروف فيفو.
في حينوقد تم تطوير المفاعلات الحيوية عديد المحاور الأخرى لمحاكاة بيئة الميكانيكية للمشترك، لديهم قيود كبيرة مقارنة مع نظامنا. A جهاز القص وضغط صممه فرانك، وآخرون. يسمح ما يصل الى 12 عينة ليتم تحميلها في وقت واحد مع ردود فعل الحمل، لا تقتصر لكن بنيات أو تأمين 6. خلال التجارب التي تنطوي على سلالة القص، فمن الضروري أن يتم تأمين البنى بحيث لا تنزلق تحت الصوانى تحميل. سوف يؤدي إلى انزلاق غير المتكافئ وغير متناسقة التحميل القص للعينة. المفاعلات الحيوية الحديثة، مثل "شعرة معاوية" النظام الفريد 22،23 وجهاز التحفيز ذو محورين 16، وخلق بيئة جار أكثر واقعية وثابتة، إلا أنها تسمح فقط عينة واحدة ليتم تحميلها في وقت واحد. أحجام عينة كبيرة ضرورية لأداء التحاليل البيوكيميائية، والميكانيكية، والنسيجية اللازمة على بنيات مع مستوى عال من الثقة. عديtionally، و "شعرة معاوية" يفتقر النظام إلى ردود فعل قوة، وهو مقياس أساسي للتنمية بناء خلال فترة طويلة في زراعة المختبر. كما يسمح للوقاية من الصوانى-العينة عدم الاتصال والتحميل الزائد عينة، والتي سوف تلحق الضرر بشكل لا رجعة فيه بنيات الأنسجة المهندسة. مفاعل حيوي الاتصال انزلاق وضعتها بيان، وآخرون. يسمح ما يصل الى أربع بنيات ليتم تحميلها في وقت واحد، ولكن لا تزال تفتقر إلى هذه الآلية ردود فعل قوة قيمة 17.
الإعداد الحالي باستخدام 24 لوحات جيدة تسمح للتحميل في وقت واحد من 24 عينة، وأكثر عينات ممكنة مع بعض التعديلات من الشكل الهندسي للالصوانى تحميل. الأسطوانة التحميل يوفر مرونة واسعة لتصميم الرواية. المواد المختارة polysulfone يسهل اختراقها، ويمكن تعقيمها وزراعتها في بيئة رطبة ودافئة للحاضنة. فمن ألالة بسهولة، وتمكين مجموعة متنوعة من هندستها وأعداد العينات المراد تحميلها في وقت واحدLY.
في الختام، مفاعل حيوي جار ذو محورين جديدة لهندسة الأنسجة تمكن على المدى الطويل في زراعة الأنسجة في المختبر من بنيات هندسيا. زيادة التحميل ذو محورين للبروتيوغليكان وترسب الكولاجين وسماكة أنسجة الغضروف عينات هندسيا ولكن لا يبدو أن تؤثر تأثيرا كبيرا على الخواص الميكانيكية للغضروف هندسيا كما افترضنا. زيادة ضغط أحادي المحور كل من ترسب بروتيوغليكان ومعامل يونغ. ونحن نعتقد أن الجرعة المثلى من التحميل الميكانيكية يختلف مع الخلية وخصائص الأنسجة. والدراسات المستقبلية العمارة الكولاجين وقياس الجرعات التحميل تسمح لنا لإجراء تقييم كامل لآثار جار ذو محورين على تطوير الأنسجة المهندسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مكتب البحوث والتنمية، RR & D خدمة، وزارة شؤون المحاربين القدامى، المعاهد الوطنية للصحة كوبر 1P20RR024484، NIH K24 AR02128 وزارة الدفاع W81XWH-10-1-0643.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. Bilgen, B., et al. 57th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (ORS), , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
