Summary
Vi har konstruert en roman mekanisk belastning bioreaktor som kan søke uniaxial eller biaxial mekanisk påkjenning for en brusk biocomposite før transplantasjon inn i en leddbruskskader.
Abstract
Vi har konstruert en lademekanisme som er i stand til å anvende uniaxial eller biaxial mekanisk belastning til en vev konstruerte biocomposites fabrikkert for transplantasjon. Mens apparatet primært fungerer som en bioreaktor som etterligner de opprinnelige mekaniske belastninger, er det også utstyrt med en lastcelle for å gi kraft tilbakemelding eller mekanisk testing av konstruksjoner. Enheten fagene konstruert brusk konstruerer til biaxial mekanisk belastning med stor presisjon av startdose (amplitude og frekvens) og kompakt nok til å passe inn i en standard vev kultur inkubator. Den laster prøver direkte i en vevkulturplate, og flere plate størrelser er kompatible med systemet. Enheten er utviklet ved hjelp av komponenter produsert for presisjonsstyrte laser-programmer. Bi-aksiell belastning oppnås ved to ortogonale faser. Etappene har en 50 mm kjøreområdet og drives uavhengig av stepper motor aktuatorer, styrt avet lukket stepper motor driver som har mikro-stepping evner, slik at trinn størrelser på mindre enn 50 nm. En polysulfon lasting platen er koplet til den bi-aksiale bevegelig plattform. Bevegelser av etappene er kontrollert av Thor-labs Avansert Positioning Technology (APT) programvare. Den stepper motor driver blir brukt sammen med programvare for å justere belastningsparametere av frekvens og amplitude av både skjær og kompresjon uavhengig av hverandre og samtidig. Posisjonelle tilbakemeldinger er levert av lineære optiske givere som har en toveis repeterbarhet på 0,1 mikrometer og en oppløsning på 20 nm, oversette til en posisjonsnøyaktighet på mindre enn tre mikrometer over hele 50 mm med reise. Disse kodere gi den nødvendige posisjon tilbakemelding til drivelektronikken å sikre sanne nanopositioning evner. For å tilveiebringe den kraft som tilbakemelding for å detektere kontakt og evaluere lasting responser, er en presisjon miniatyr lastcelle plassert mellom lastkammeret og den beveger glassplateng plattform. Lastcellen har høye nøyaktighet på 0,15% til 0,25% av full skala.
Introduction
Vi har utviklet en lasting bioreaktor som er i stand til å anvende uniaxial eller biaxial mekanisk belastning til en vev konstruerte biocomposites fabrikkert for transplantasjon. Denne enheten er i hovedsak utformet som en bioreaktor for konstruerte erstatninger for artikulær brusk, det kan også brukes for andre bærende vev i menneskekroppen. Vår motivasjon i denne bioreaktor utforming stammer fra Drachman og Sokoloff en, som gjorde banebrytende observasjon av unormal dannelse av leddbrusk i lammet kyllingembryo grunn av fravær av bevegelse. Tilsvarende er fysisk trening viktig for utvikling av normal muskel og bein. I tråd med dette konseptet, har mange forskningsgrupper undersøkt hvordan ulike former for fysiske stimuli under in vitro dyrking modulerer biokjemiske og mekaniske egenskaper av celle-biomateriale biocomposites og vev eksplantater 2-7. Begrepet funksjonell tissue engineeringinvolverer in vitro bruk av mekanisk påvirkning for å forbedre de funksjonelle egenskaper av vev, det vil si de mekaniske egenskaper som gjør at vevet for å tåle de forventede in vivo trykk og strekk, 8,9. Tallrike studier rapporterer bruk mekanisk belastning i form av skjær og komprimering for å stimulere konstruerte brusk konstruerer for articular leddene. Mauck et al. 10. antyder at mekanisk lasting alene kan indusere chondrogenesis for stamceller, selv i fravær av vekstfaktorer som anses viktig. Anvendelse av intermitterende mekanisk belastning som for eksempel kompresjon eller skjærkraft under vev dyrking har vist seg å modulere brusk og bendannelse, men den optimale dosimetri av lasting forskjellig med celle-og vevs egenskaper 11.
Den viktigste funksjon av leddbrusk er evnen til å motstå trykk-og skjær-krefter innenforfelles, derfor har det å ha høy komprimering og skjær moduli. Mangelen på funksjonell mekanisk styrke og fysiologiske ultrastructure innen utformet brusk har resultert i nedbryting på neo-brusk in vivo og svikt i brusk erstatning strategier i leddene. Selv kompresjons-og skjær-er blitt hyppig vist seg å modulere og bedre mekanisk styrke i leddbrusk biocomposites, er en kombinasjon tilnærming sjelden 6,12-15. Wartella og Wayne 16 utviklet en bioreaktor som gjaldt strekk og kompresjon for å produsere menisk brusk erstatninger. Waldman et al. 15. konstruert en enhet for å bruke komprimering og skjær til chondrocytes dyrket i et porøst kalsium polyphosphate underlaget. Bian et al. 17. demonstrert mekaniske egenskaper matchende innfødte brusk med in vitro dyrking av voksen hjørnetann chondrocytes i geler og anvendelse av biaxial mechanical lasting (compressive DEFORMASJONS lasting og glidekontakt lasting).
Den biaxial mekanisk belastning bioreaktor ble opprinnelig designet av Danielle Chu i vårt laboratorium med overordnet mål å indusere morfologiske tilpasninger i vev konstruert brusk konstruerer resulterer i høyere trykk-og skjær moduli enn tiden tilgjengelig 18. Vi tror denne forskningen vil øke vår bredere forståelse av hvordan mechanotransduction kan moduleres til ingeniør klinisk relevante vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Biaxial Laster Bioreactor Design
- Bioreaktor sysselsetter to etapper produsert av Thor-Labs (Newton, MA) for presisjonsstyrte laser-programmer for å søke uniaxial eller biaxial mekanisk påkjenning å utviklet vev, med stor presisjon av startdose (amplitude og frekvens) og søknad til et bredt spekter av vevskulturstudier forhold fra én til 24 brønners plater (figur 1).
- Bi-aksial lasting oppnås ved to travelmax stadier (LNR50SE). Disse stadiene er montert vinkelrett i en XZ-konfigurasjon. Den horisontale fasen gir dynamiske klipping bevegelser ved oscillerende langs X-aksen. Den vertikale fasen gir dynamisk derfor belastningen ved å oscillere langs Z-aksen. Disse stadiene har en 50 mm kjøreområdet og drives uavhengig av stepper motor aktuatorer (DRV014), kontrollert av et lukket stepper motor driver (BSC102) som har mikro-stepping evner, slik at trinn størrelser på mindre enn50 nm.
- Apparatet er montert på et stivt 25 cm x 30 cm x 12,5 mm aluminium bunnplate som brukes som en plattform for montering av maskinkomponentene og for montering av vevskulturplater. Justerbare kinematiske stopper er brukt for å låse vevskulturplater på plass på aluminium bunnplaten. Disse kinematiske stoppesteder har fine justeringsskruer for å tillate presis justering som ellers ikke oppnåelig for hånd. Den modulære utformingen av bunnplaten fleksibel plassering av disse kinematiske stopper for å imøtekomme plater av forskjellige størrelser og former (petriskåler vs multi-brønn plater).
- En custom-maskinerte polysulfon lasting platen er koblet til bi-aksial bevegelig plattform via en presisjonsmaskinert rett vinkel braketten. Polysulfone materialet ble valgt på grunn av dets bioforlikelighet, enkel maskinering, og enkel sterilisering.
- Bevegelser av etappene er kontrollert av Thor-labs 'Advanced Positioning Technology (APT) programvare. Stepper motor driver er ossed i kombinasjon med programvare som tillater justering av belastningsparametere av frekvens og amplitude av både skjær og kompresjon uavhengig av hverandre og samtidig.
- Posisjonelle tilbakemeldinger er levert av lineære optiske givere som er knyttet til hver bevegelig plattform og blir integrert med programvaren. Den giversystem har et toveis repeterbarhet på 0,1 mikrometer og en oppløsning på 20 nm, oversette til en posisjonsnøyaktighet på mindre enn tre mikrometer over hele 50 mm på reise. Denne giveren gi den nødvendige posisjon tilbakemelding til drivelektronikken å sikre ekte nanopositioning evner og en direkte avlesning av den absolutte posisjonen.
- For å gi den force feedback nødvendig for å påvise kontakt mellom platen og prøver og vurdere lasting svar, en presisjon miniatyr last celle (Honeywell Model 31) er plassert mellom lasting platen og bevegelig plattform (figur 2). Lastcellen har høye nøyaktighet på0,15% til 0,25% av full skala. Skjermenheten (SC500) for belastningscellen kan også gi belastning målinger av opptil 5 desimaler. I tillegg har den en RS-232 port for å muliggjøre innsamling av data på en datamaskin.
2. Cell-Last Agarose konstruerer
- Forbered 4% agarose: Legg 0,8 g agarose til 20 ml DMEM (ingen tilsetningsstoffer) i en 50 ml flaske, koke, og deretter holde i 70 ° C ovnen til bruk.
- Juster volumet av cellesuspensjon for dobbel mengde av den ønskede celle seeding tetthet. Denne suspensjonen ble blandet med likt volum av 4% w / v agarose for å skape en 2% agarosegel ved ønsket seeding tetthet.
- Plasser både cellesuspensjonen og en 10 ml pipette i kuvøsen.
- Sett opp gel casting system. Ett 1,5 mm og en 0,75 mm mellomlagsplaten skulle settes sammen for å skape en 2,25 mm tykk gel. Andre størrelse spacer plater kan benyttes for å skape en annen gel tykkelser. Gelen casting system er ikke stor nok til å holde disse platene togethenne, så de må være forsvarlig teipet for å hindre lekkasje.
- Det neste trinnet er å raskt blande cellesuspensjon med den tidligere fremstilte agarose og pipette til gelen formen før agarosen størkner. Fjern væsken agarose fra ovnen og plasser et sterilt termometer i den. Agarose må avkjøles til 42-43 ° C før blanding med cellene. Varm opp cellesuspensjon til 37 ° C. Når agarose treffer 43 ° C, raskt pipetter opp på ønsket beløp og deretter umiddelbart pipette cellen suspensjon opp og ned et par ganger for å blande. Deretter pipetteres umiddelbart på hele blandingen i gel form.
- La gelen stivne i 10-15 minutter og deretter forsiktig vippe den til en horisontal stilling.
- Fjern den øverste glass plate og punsj disker med biopsipunch. Disker kan plukkes opp med en liten steril spatel. Vår erfaring var en 9 ml gel stor nok til å gjøre mer enn hundre 5-mm-diameter plater.
3. Kultur de Disks
4. Immobilisering av prøver for Mekanisk belastning
- Forbered 4% agarose (ingen cellesuspensjon tilsatt), og gelen bør være tynnere enn prøvene selv (for å forhindre forstyrrelser under lasting). Den anbefalte tykkelse er 1,5-1,9 mm (i 2,25 mm tykke prøver).
- Når gelert, punsj 16 mm diameter disker for 24 brønners plater. På hver disk, til en dor 5 mm hull for prøven plasseres i. Dersom det er ønskelig, en annen dor 5 mm hull på kanten av skiven for pipetten til å bli plassert under endring av medier.
- Når agarose brønner har blitt gjort, sted i 24 brønns plate, som vist i figur 3..
- Når agarose walen er i 24 brønners plate, trykker du passe prøver i hver brønn. Prøven skal stikke ut fra toppen av agarose også.
5. Mekanisk Loading
- Steriliser platen (figur 2).
- Sikre aluminiumsplate å laste celle. Sikker lasting platen / last celle / aluminium plate montering på scenen.
- Slå på stepper motor styringen (bryter på baksiden).
- Slå på PCen og åpne "APT Bruker" program (figur 4).
- Venstre skjermen styrer horisontal stepper motor. Høyre skjerm styrer vertikal stepper motor. I hvert skjermbilde, "Grafisk Control"-kategorien tillater manuell posisjonering og "Flytt Sequencer"-kategorien tillater automatisering. Alle enheter er mm.
- Gå til "Grafisk Control"-kategorien på begge skjermene, og trykk "Home / Zero"-knappen. Både stepper motorer har en rekkevidde på 50 mm. Ved å trykke "Home / Zero" vil sende både stepper motorer til nullstilling (topp-og høyre-de fleste posisjoner).
- Forberedee prøvene i 24 brønners plate for lasting ved å fjerne noen medier fra hver brønn. Ikke mer enn 1 ml av media bør bli igjen i hver brønn for å forhindre overflyt under lasting. Pass på at nok medier er igjen i brønnen for å holde prøven dekket.
- Merk at inkubatoren er holdt i lav luftfuktighet for å hindre instrumentfeil.
- Place 24 brønners plate i bioreaktor og nøye stille opp med platen.
- Platen er festet til bioreaktoren ved hjelp av fire justerbare kinematiske posisjonsvisere. For å gjøre det lettere å stille opp platen, har de to venstre locator blitt plassert. Stram de to høyre locator slik at platen er sikker. Sørg for å stille platen opp i flukt med fronten av bioreaktor basen.
- I "Grafisk Control"-kategorien, kan en bestemt stepper motor posisjon legges inn manuelt ved å klikke på stillingen boksen. Bruk denne muligheten til å sakte senke platen og flytt den horisontalt for å stille opp med plate. </ Ol>
- Når platen er nær å komme i kontakt med prøver, begynner å få platen ned i svært langsom trinn (0,1 mm) til du kommer til forhåndsbestemt startposisjon (se del 6).
- Når startposisjon er nådd, går du til "Flytt Sequencer"-fanen og laste den ønskede farten sekvensen ved å trykke på "Load". Trykk deretter på "Kjør" for å starte. (Figur 5) Se del 7. Skrive en dosering protokollen.
- Når du er ferdig lasting, manuelt heve platen. Hvis noen prøver fast til platen, nøye satt dem tilbake i riktig godt med en steril spatel.
- Fjern 24 bra plate fra bioreaktor og erstatte media.
- Fjern forsiktig platen fra lasten cellen og deretter slå av instrumenter.
6. Kalibrering Loading Platen
For å sikre at de riktige stammer brukes på prøvene, må hver platen være nøye kalibrert før du starter et eksperiment.
- Manuelt sette horisontal stepper motor på 25 mm posisjon.
- Senk glassplaten inntil det bare kommer knapt i kontakt med bunnen av bioreaktoren. Lastcellen vil vise økt belastning på dette punktet. Legg merke til den nøyaktige plasseringen av den vertikale stepper motor (være så presis som mulig, som alle komprimering Strainmåling vil bli beregnet fra denne verdien).
- Ta opp stillingen. Denne verdien vil bli brukt til å skrive en dosering protokoll basert på prøven dimensjoner og ønsket belastninger.
7. Skrive en doseringsprotokoll
- Bioreaktoren er stand til å anvende både trykk-og skjær-påkjenninger, enten samtidig eller hver for seg. Tre viktigste parametrene må avgjøres: tara kompresjons belastninger, dynamisk belastning amplitude, og lasting frekvens.
- En tara tøyning påføres for å hindre oppskyting av platen fra prøven.
- Sample dynamisk belastning amplitude og lasting frefrekvensen er valgt.
I denne studien definerer vi kompresjon og skjærspenning påkjenning som følger: 
Eksempel Biaxial doseringsprotokoll
Sample tykkelse: 2,25 mm
Tare stamme (kompresjon): 10% av prøvens tykkelse (0,225 mm)
Dynamisk Strain Amplitude (kompresjon): 10% (+ / - 5% av prøvens tykkelse)
Frekvens (Compression): 1 Hz
Dynamisk Strain Amplitude (skjær): 25% av prøvens tykkelse (0,5625 mm): Forskyvningstrykk
påført prøven ved platen beveger seg horisontalt.
Frekvens (Shear): 0,5 Hz
Typisk dosering protokollen er 3 hr av lasting per dag.
I dette eksemplet, er dynamisk og skjær-lasting anvendt samtidig i stedet for etter hverandre. Vi tror dette mønsteret bedre mimics komplekset lasting miljø i det menneskelige kne.
- Når en dosering protokollen er valgt, må en komprimering flytte sekvens programmet bli skrevet.
- Flyttingen sekvens er akkurat hva det høres ut som, en liste over stillinger som stepper motor vil flytte til på en spesifisert akselerasjon og maksimal hastighet.
- Beregn ønskede vertikale posisjoner basert på doseringsprotokoller og platen kalibrering verdi (fra del 6).
- Eksempel beregninger for Platen 1 er gitt nedenfor:
| Forskjellen fra Kalibrering Verdi | Vertikal posisjon | |
| Platen Kalibrering verdi (berører bunnen av bioreaktor) | 0 mm | 29,7700 mm |
| Platen kommer i kontakt med Sample (2,25 mm sample) | 4,4140 mm | 25,3560 mm |
| Stregn (5% Tykkelse) | 4,3015 mm | 25,4705 mm |
| Strain (10% Tykkelse) | 4,1890 mm | 25,5810 mm |
| Strain (15% Tykkelse) | 4,0765 mm | 25,6955 mm |
- Når stillinger er beregnet, eksperimentere med akselerasjon og maksimal hastighet verdier for å få riktig frekvens. Antallet sykluser som bør velges, tilsvarende (f.eks 10.800 sykluser i 3 timer ved 1 Hz).
- Eksempel dynamisk kompresjon Move Sequence Program (10% tara komprimering, 10% dynamisk belastning amplitude, 1 Hz) (figur 5)
- Dynamisk skjær flytte sekvens program: Antallet sykluser bør velges i henhold til ønsket frekvens og varighet (f.eks 5400 sykluser for 3 hr på 0,5 Hz).
- Eksempel Dynamic Shear Move Sequence Program (10% tare kompresjon, 0,5625 mm (25% av tykkelsen) dynamisk klippe belastning amplitude, 0.5Hz) (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enheten ble testet ved hjelp av agarosegeler sådd med 20 millioner celler / ml chondrocytes og dyrket i nærvær av enakset (kompresjon) eller biaksiale (kompresjons-og skjær-) mekanisk belastning. Primære porcine kondrocytter ble isolert fra leddbrusk fra 2-4 måneder gamle griser. 5 mm diameter og 1,5 mm tykke prøver ble dyrket i 2 ml definert chondrogenic kultur medium (høy glukose DMEM, 1% SIN + Premiks, 100 E / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 2,5 ug / ml amfotericin B, 50 ug / ml askorbinsyre, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 0,4 mM prolin,) i 24-brønners plater ved 37 ° C, 5% CO2. 10 -7 M deksametason og 10 ng / ml TGF-β1 ble levert for de første 10 dagene av kultur. Prøvene ble lastet i 3 timer / dag mellom dager 10-30. Uniaksial lasting besto av 10% kompresjon topp-til-topp amplitude, besto 1 Hz og biaksial lasting på 0,15 mm (10% tykkelse) for komprimering og 0.075mm skjær peak-to-peak amplitude, 1 Hz. Den dynamiske belastningen amplitude og lasting frekvens er valgt basert på publiserte studier 17,19. Ved slutten av 30 dager biokjemiske og mekaniske egenskaper av konstruerte brusk ble vurdert.
Denne studien ansatt tre grupper: 1 - Ingen lasting kontroll, 2 - uniaxial (trykkfasthet) lasting, 3 - Biaxial (kompresjon og skjærspenning) loading. DNA-innhold og de våte tykkelser konstruksjoner lik i de tre gruppene etter 30 dagers dyrking (p> 0,05). Gag-innholdet var høyest i gruppen som ble underkastet biaksial lasting (3-gruppe, p <0,001 sammenlignet med kontrollgruppen), etterfulgt av uniaksial lasting gruppe (gruppe 2, p <0,05) (figur 6). Gag-innholdet i gruppene 2 og 3 svarer til 48% og 50% av opprinnelig brusk, henholdsvis. Gruppe 3 førte til en signifikant høyere mengde av kollagen enn gruppe 1 og 2 (p <0,01). Gruppe 2 hadde også tykkere konstruksjoner than gruppe 1 (p <0,01). Overraskende nok var det likevekt kompresjons Youngs modulus høyest i gruppe 2 (uniaxial lasting, p <0,01) og det var ingen signifikante forskjeller mellom gruppe 3 og en. Den Youngs modul for gruppe 2 tilsvarte 60,1% av innfødte svin brusk.
De histologiske analyser indikerte positive og homogen farging for glycosaminoglycans (Alcian blå, safranin O) og type II kollagen (figur 7). Alle gruppene farget negativt for type I kollagen (ikke vist).
Oppsummert disse foreløpige resultatene tyder på at dette bioreaktor vellykket anvendt kompresjon og biaxial (kompresjon og skjær) mekaniske lasting under langvarig dyrking av utviklet vev. På denne studien biaksial lasting ble vist til proteoglykan og kollagen avsetning og tykkelsen på vev konstruert brusk prøvene. Uniaxial kompresjon økt både proteoglycan deponering og Youngs modul.
Figur 1. Biaxial lasting oppnås ved X-scenen (klipping) og Z-scenen (kompresjon). Figuren viser en skreddersydd lasting platen festet til stadier å laste prøver i en 24-brønners plate. De lasting parametere styres med en datamaskin koblet til steppermotorer 18.
Figur 2. Til venstre: polysulfon lasting platen designet for 24-brønners plater. Høyre: Lastingen platen vedlegg til biaxial lasting bioreaktor.
Figur 3. Utarbeidelse av agarose brønner for immobilisering av prøvene under shear lasting. Den immobilisert konstruere plassert i agarose godt for mekanisk belastning. Denne figuren viser en 1,5 mm tykk agarose godt og en 2,25 mm tykk prøven.
Figur 4. Det grafiske brukergrensesnittet til å kontrollere biaxial lademekanisme. Klikk her for å se større figur .
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50387/50387fig5.jpg "/>
Figur 5. Eksempel Biaxial Laster Move Sequence Program Graphical User Interface: Dynamic Compression Move Sequence Program (10% tare kompresjon, 10% dynamisk belastning amplitude, 1 Hz) og Dynamic Shear Move Sequence Program (10% tare kompresjon, 25% dynamisk skjær belastning amplitude, 0.5 Hz). Klikk her for å se større figur .
Figur 6. Biokjemiske og mekanisk testing resultater (n = 6) *** p <0,001, ** p <0.01, * p <0,05 sammenlignet med gruppe 1 (ubelastet kontroll Gruppe 2:.. Uniaxial derfor belastningen, gruppe 3: Biaxial kompresjon og skjærspenning lasting.
Figur 7. Histologi: Alcian blå / kjernefysisk fort røde flekker, safranin O / fast grønt, immunokjemi for type II kollagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utviklet en lademekanisme som er i stand til å anvende uniaxial eller biaxial mekanisk belastning til vev konstruerte konstruerer fabrikkert for transplantasjon. Anordningen kan benyttes som en bioreaktor for in vitro dyrking av konstruerte biocomposites eller som en testanordning for å beskrive de mekaniske egenskapene til den opprinnelige vev eller etter annen behandling før. Enheten fagene konstruert vev konstruerer til biaxial mekanisk belastning med stor presisjon av startdose (amplitude og frekvens) og søknad til et bredt utvalg av vevskulturstudier forhold fra én til 24 brønners plater.
Den påvirkning av skjærkraft lasting presentert et sett med unike utfordringer for utformingen av dette system. For å maksimere næringsstoff overføring, ble konstruerer opprinnelig unconfined i individuelle brønner på en 24 brønns plate. Dette ikke presentere et problem for dynamisk komprimering, som tare kompresjons belastninger forsikret atsample-platen kontakten ble ikke tapt. Når skjær-stamme ble tilsatt til protokollen, men skyves unconfined prøvene langs bunnen av platen, og noen mistet kontakten med valsen. I tillegg, under biaxial lasting protokoller prøver hadde en tendens til å snu, forårsaker inkonsekvent lasting. Vi har løst dette problemet ved å lage agarose brønner for å immobilisere prøvene som beskrevet i prosedyren. Disse agarose brønner tillate konsekvent biaxial lasting av prøvene uten å begrense næringsstoffer til prøvene.
I motsetning til komprimering bioreaktorer som er svært mye forsket 20,21, er vår enhet stand til å anvende presise stammer på flere akser. Disse akser kan styres uavhengig av hverandre. Multiaksial lasting kan påføres sekvensielt eller samtidig. Det er mulig å implementere et tredje Y-aksen for å gi mekanisk belastning i tre dimensjoner for å bedre etterligner in vivo-forhold.
Menshar andre multiaksiale bioreaktorer blitt utviklet for å etterligne den mekaniske miljøet i felles, de har store begrensninger i forhold til vårt system. Et skjær og kompresjon apparat utformet av Frank, et al. tillater opp til 12 prøver som skal lastes samtidig med last tilbakemeldinger, er imidlertid konstruerer ikke innestengt eller sikret seks. Under forsøk med skjær belastning, er det viktig at konstruksjoner være sikret slik at de ikke skyve under lasting platen. Skyve vil resultere i ujevn og inkonsekvent skjærkraft lasting av prøven. Nyere bioreaktorer, slik som den unike "rullende ball"-systemet 22,23 og en biaksial stimulering anordning 16, skaper et mye mer realistisk og konsistent lasteomgivelser, men de bare tillater én prøve for å bli lastet samtidig. Store utvalgene er avgjørende for å utføre de nødvendige biokjemiske, mekanisk, og histologiske analyser på de konstruerer med et høyt nivå av tillit. Addinalt, mangler det "rullende ball" system force feedback, en viktig mål på konstruere utvikling under langvarig in vitro dyrking. Den gjør også forebygging av glassplaten-prøven ikke-kontakt og prøven overbelastning, noe som vil gjøre ubotelig skade vev konstruert konstruksjoner. En glidekontakt bioreaktor utviklet av Bian, et al. Tillater opp til fire konstruksjoner som skal lastes samtidig, men fortsatt mangler denne verdifulle force feedback mekanisme 17.
Den aktuelle installasjonen med 24-brønners plater tillater samtidig tilførsel av 24 prøver, flere prøver er mulig med modifikasjoner av geometrien til lasting pressplaten. Lastingen platen tilbyr stort fleksibilitet til romanen design. Den valgte materialet polysulfon er porøst, kan steriliseres og dyrket i fuktige og varme miljøet i en inkubator. Det er lett bearbeidbar, slik at en rekke ulike geometrier og numrene av prøvene som skal lastes simultanly.
I konklusjonen, gjør den nye biaxial lasting bioreaktor for tissue engineering langsiktig in vitro dyrking av vev konstruerte konstruksjoner. Biaxial lasting økte proteoglycan og kollagen deponering og tykkelsen på vev konstruerte brusk prøvene, men synes ikke å ha stor innflytelse de mekaniske egenskapene til konstruerte brusk som vi hypotese. Uniaxial kompresjon økt både proteoglycan deponering og Youngs modul. Vi mener at den optimale dosen av mekanisk belastning varierer med celler og vev egenskaper. Fremtidige studier av kollagen arkitektur og dosimetri av lasting vil tillate oss å fullt ut vurdere virkningene av biaxial lasting på utvikling av konstruerte vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Office of Research and Development, RR & D tøy, US Department of Veterans Affairs, NIH Cobre 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 og Department of Defense W81XWH-10-1-0643.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. Bilgen, B., et al. 57th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (ORS), , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
