Summary
우리는 생리 학적 및 병리학 관련 자극에 포상 세포 칼슘 신호와 세포의 손상을 검사의 목적을 위해 마우스에서 마우스의 췌장 포상 세포를 제조하는 재생 방법을 설명합니다. 이러한 세포의 아데노 바이러스 감염 방법도 제공됩니다.
Abstract
췌장 포상 세포 외분비 췌장의 주요 실질 세포이며, 췌장 덕트로 췌장 효소의 분비에 주요 역할을한다. 또한 췌장염의 시작을위한 사이트입니다. 여기에서 우리는 전체 췌장 조직과 세포 내 칼슘 신호의 포상 세포가 고립되는 방법을 설명하는이 측정됩니다. 또한, 우리는 체외에서 포상 세포 손상을 유발 조건에서, 아데노 바이러스 구조와 이들 세포를 형질, 이후 젖산 탈수소 효소, 세포 손상의 마커의 누설을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 포상 세포 생리학 및 병리학의 특성을 수있는 강력한 도구를 제공합니다.
Introduction
세포질 칼슘의 동적 변화는 생리적, 병리 모두 포상 세포 이벤트가 필요합니다. 칼슘이 발산 효과는 1 신호 칼슘의 독특한 공간과 시간적 패턴의 결과로 생각된다. 예를 들어, 포상 세포에서 효소 액의 분비는 분비 곳이 소요 혀끝 극의 제한된 지역에서 칼슘 스파이크로 연결됩니다. 대조적으로, 강한 비 진동 칼슘 신호에 의해 다음 글로벌 칼슘 파 급성 췌장염 3,4로 이어질 초기 병리학 적 사건과 연관됩니다. 이러한 내부 포상 단백 분해 효소 활성 감소, 효소 분비 및 포상 세포 손상이 (가) 있습니다. 우리 연구실은 생체 내 5-7 체외에서 두 질병으로 이어질 이러한 초기 병적 인 이벤트를 공부 고립 췌장암 acini를 사용합니다. 여기에 설명 된 방법은 CY 측정의 목적을 위해 기본 포상 세포의 분리 기술tosolic 칼슘 수준과 세포 손상. 이러한 세포의 아데노 바이러스 감염 방법도 제공됩니다.
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Protocol
1. 칼슘 이미징을위한 췌장 포상 세포를 준비
- 20 MM의 HEPES 95 mM의 NaCl을 4.7 mM의 KCl을, 0.6 mM의 MgCl 2, 1.3 MM의 염화칼슘, 10 mM의 포도당, 2 MM의 글루타민, 1 × 최소 이글의 중간 비 필수 아미노산을 포함하는 HEPES 배양 버퍼를 준비합니다. NaOH를 pH를 7.4로 최종 솔루션을 조정합니다.
- HEPES 배양 버퍼 (위에서 설명)의 25 ML에 BSA (1 % W / V 최종)를 추가하여 BSA 배양 버퍼를 준비합니다.
- 1.1 MG / ML (/ 200 단위 ML) 타입 4 콜라게나 제 1 MG / ML 대두 트립신 억제제 6 BSA 배양 버퍼 (위에서 설명)의 ML을 추가하여 교원질 소화 버퍼를 준비합니다.
- 두 부분 HNO 3과 2 시간 동안 한 부분 염산에 침지하여 산 세척 22x22 mm의 coverslips를. 그런 다음 70 % 에탄올에 DI 물과 저장소를 사용 가만히 따르다.
- CO 2 질식하여 한 마우스를 안락사. 동양 앙와위에서 동물, 그리고 CLE으로 복부 표면을 준비70 % 에탄올로 aning. 복강을 노출하는 개복술을 수행합니다. 췌장을 해부하고 즉시 교원질 소화 버퍼 6 ML을 포함하는 작은 무게 보트 헹구십시오.
- 지방이나 눈에 보이는 혈관의 큰 조각을 멀리 해부, 다음 콜라 소화 버퍼의 5 ML을 제거하고 15 ML 원뿔 관에 다시 추가합니다.
- 미세 해부 가위를 사용하면 콜라게나 소화 버퍼 1 ML을 포함하는 작은 무게 보트 췌장을 말하다. 용액이 균일하게 분산 나타날 때까지 말하다.
- 125 ML 삼각 플라스틱 플라스크에 다진 제품을 전송하고 컨테이너에 콜라 소화 버퍼의 나머지 5 ML을 추가합니다. 조직이 완전히 버퍼에 빠져들되어 있는지 확인합니다.
- 37 ° C의 물을 욕조에 플라스크를 놓고 30 분 동안 90 rpm으로 흔들어. 다운 타임이 짧은 기간 동안, 칼슘 활성화 작용제 (예 : caerulein, carbachol)를 준비하고 22x22 mm 산 세척 커버를 씻어DI 물에 미끄러 져. 건조하고 실험실 필름으로 늘어선 평평한 표면 위에 놓습니다.
- 30 분 다이제스트가 완료되면, 15 ML 원뿔 튜브로 현탁액을 전송하고 세포가 정착 할 수 있습니다. 조심스럽게 콜라게나 소화 버퍼를 피펫 BSA 부화 버퍼 6 ML로 교체합니다. 적극적으로 작은 클러스터로 세포를 분산하기 위해 10 초 동안 손으로 튜브를 흔들. 즉시 동요에, 불안 매체에서 어떤 큰 부동 파편을 제거합니다.
- 나머지 세포가 정착하고 신선한 BSA의 배양 버퍼 미디어를 교환 할 수 있습니다.
- 서스펜션은 육안으로 만 정교하게 볼 수 있습니다 만 작은 클러스터로 구성 될 때까지 두 번 1.11 단계를 반복합니다. 세포는 그림 1A (맨 윗줄)에 묘사 된 사람들과 비슷합니다.
- BSA 배양 버퍼를 제거하고 HEPES 부화 버퍼로 교체합니다.
- 10 % DMSO에 750 μM, 플루오 오전 4시의 100X 재고를 준비합니다.
- 세포 현탁액과 BSA없는 HEPES 배양 버퍼를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 세포를로드합니다. 이 작업을 수행하려면 세포 현탁액의 주식 솔루션의 적절한 볼륨 (1:100 희석)를 추가합니다. 각 22x22 mm의 coverslip에 위에이 정지 다음 접시에 500 μL.
- 상온에서 어둠 속에서 coverslips를 보관합니다. 첫 번째 칼슘 2 + 측정을 넣은 후 30 분 소요. 염료가 자동으로 염료로드 후 30 분 발생해야 관류를 시작할 때 중간에서 제거됩니다.
2. 췌장 포상 세포에서 칼슘을 측정
- DI 워터와 각 관류 셋업을 씻어 버퍼 또는 작용제의 적절한 금액으로 채 웁니다. 적절한 흐름을 확실히하기 위하여 버퍼 또는 작용제와 주요 각 주사기. 링에 주사기를 고정하면 현미경 스테이지 위의 약 1 ~ 2 발을 서있다.
- 조심스럽게 가장자리 한 coverslip을 포함하는 세포 현탁액에서 파악하는 미세 집게를 사용합니다. 덮개를 기울45 ° 슬립, 그리고 여분의 버퍼가 도망 할 수 있습니다. coverslip을 상단에 세포와 고무 개스킷의 상단에 커버 슬립을 배치하고 챔버 (그림 2A와 2B)를 조립합니다.
- 단계로 재관류 챔버를 확보하고 챔버 (그림 2C)의 제 1 입구에 버퍼를 포함 튜브를 삽입합니다. 에 버퍼를 포함하는 주사기를 돌려 버퍼가 커버 슬립의 전체 표면을 통해 붓는다 할 수 있습니다. 버퍼 챔버의 반대편에 도달하면, 진공 흡입으로 진공 라인을 삽입합니다. 챔버에 따라 적절한 위치에 다른 튜브 (포함 작용제, 억제제 등)를 삽입합니다.
- 488 nm의 (그림 1A, 아래)의 파장 플루오 오전 4시 염료를 자극하는 하나 200X 나 400X, 1.4 조리개 수치 목표와 아르곤 레이저를 이용하여 세포를 시각화. 레이저의 전원 설정을 조정해야하도록 광전 튜브 (PMT) 방출되는 빛에 의해 포화되어 있지 않습니다. 또한, PMT의 전압은 최대의 광 검출을 위해 최적화해야합니다.
- > 515 nm의 긴 패스 방출 신호는 2-5의 프레임 속도로 수집 된 초 빠른 글로벌 칼슘 파도 (그림 3, 4) 시각화를위한 느린 진동 패턴과 0.2 ~ 0.3 초 / 프레임을 시각화 / 프레임.
- 영상이 완료된 후, 주사기를 닫고 모든 튜브를 제거합니다. 챔버 단계를 반복 2.2-2.4를 분해한다.
- 이미지 J에 시간이 지남에 형광 강도의 수치 (건강의 국립 연구소에 의해 프리웨어로 제공하고에서 찾을 수있는 소프트웨어 패키지와 데이터 수집 http://rsb.info.nih.gov/ij/를 ).
- 실시간 세포 영상을 볼 수 있고 관심 영역 (ROI에, 즉 핵, 기저, 정점 등)를 식별
- 이러한 ROI를 및 R에 대한 형광 강도를 확보형광 강도 / 기준선 형광 강도 (즉, F/F0)로 epresent.
- F / F 0 대를 플로팅하여 표목을 생성 시간입니다. 트레이싱에 더하여, 대표 이미지는 일반적으로 제공하고 사색을 사용하여 표시됩니다.
3. 세포 상해 분석 실험을위한 췌장 포상 세포의 준비
- 따뜻한 DMEM F-12 미디어 (페놀 레드없이) 37 ° C.
- DMEM F-12 미디어 BSA (0.1 % W / V 최종) 및 염산 (50 μM 최종)를 추가합니다.
- 원뿔 튜브로 나누어지는 DMEM 50 ML을.
- 보충 DMEM F-12 매체 10 ML에 콜라게나 유형 IV의 0.5 MG / ML (12 U / ㎖)을 첨가하여 콜라 버퍼를 준비합니다.
- CO 2 질식하여 한 마우스를 안락사. 동양 앙와위에서 동물, 70 % 에탄올로 세척하여 복부 표면을 준비합니다. 복강을 노출하는 개복술을 수행합니다. 췌장을 해부하고 즉시 작은 무게 보트 C로 씻어콜라게나 버퍼의 6 mL를 ontaining.
- 3-5 분 동안이나 용액이 균일하게 분산 나타날 때까지 미세 해부 가위를 사용하여 조직을 말하다.
- 5 분 동안 90 rpm으로 흔들어 37 ° C의 물을 욕조에 추가 콜라 버퍼, 그 장소 5 ㎖와 125 ML 삼각 플라스크에 다진 조직을 전송합니다.
- 뿌리에서 제거, 세포가 간단히 해결 할 수 있도록하고, 신선한 콜라 버퍼의 5 ML과의 교류. 다음 90 rpm으로 흔들어 37 ° C의 물을 욕조에 추가 35 분 동안 품어.
- 서스펜션은 명백한 세포 대단히 짧은 시간에 균일 나타날 때까지 적극적으로 전송 피펫을 사용하여 다이제스트를 resuspend을. 그런 다음 부드럽게 삼각 플라스크에 사전에 젖은 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 피펫.
- 적극적으로 남아있는 세포를 강제하기 위해 메쉬를 통해 신선한 DMEM F-12 미디어 (콜라 포함)의 추가 3 mL를 피펫.
- 또 다른 6-10 DMEM F-12 미디어 mL를 추가2 ~ 3 분 동안 정착 세포를 노래 졌을. 두 번이 단계를 반복하여 최종 세척 후 상층 액을 제거하십시오.
- 48 잘 조직 배양 플레이트의 각 우물에 신선한 DMEM F-12 미디어 세포를 resuspend을하고, 세포 현탁액의 플레이트 500 μl를 추가합니다. 세포는 그림 1B에 묘사 된 사람들과 비슷합니다.
- 플레이트 작용제를 추가하기 전에 5 분 동안 90 rpm에서 37 ° C의 물을 욕조에 앉아 할 수 있습니다.
- 2-4 시간 동안 작용제의 변화와 세포를 자극한다.
- 세포가 정착주의 깊게 미디어 나누어지는 (일반적으로 100 μL)와 액체 질소에 플래시 동결을 피펫 할 수 있도록 각도에서 접시를 기울이십시오.
- 플래시가 남아있는 세포 현탁액을 동결. 플래시 동결 LDH 측정을 위해 필수적인 없습니다. 그들은 같은 날 assayed 또는 장기 저장을 위해 -20 ° C에 저장 될 경우 다른 샘플은 얼음에 보관하실 수 있습니다로.
4. 젖산 탈수소 효소의 누설을 측정
- 재구성 LDH 기판 (키트에 제공되는) 분석 버퍼의 12 ML로 (또한 제공).
- 상온에서 물을 욕조에서 냉동 세포 현탁액 및 미디어 샘플을 해동.
- 96 - 웰 플레이트에 각 미디어 샘플의 접시에 50 μL.
- 최종 농도가 1X되도록 세포 현탁액을, 10X 용해 버퍼의 필요한 볼륨을 추가합니다. 60 분 37 ° C에서 소용돌이 짧게 품어.
- 펠렛 세포 파편 4 분 250 XG에 용해 샘플을 원심 분리기.
- 세포 용 해물을 위해, 96 웰 플레이트에 1:10 희석 플레이트 50 μL.
- 각각의 well에 재구성 기판의 50 μl를 추가하고, 30 분 동안 상온에서 어둠 속에서 접시를 품어.
- 하여 반응을 정지각각의 well에 스톱 솔루션 (키트에 포함)의 50 μl를 추가 할 수 있습니다.
- 490 nm에서 흡광도를 측정한다.
- % LDH 유출을 계산하려면 다음 공식을 사용합니다. 아래의 광학 밀도는 잘 만있는 PBS, 기판에서 빈 OD 읽기를 빼서 수정 및 솔루션을 중지 할 수 있습니다.
미디어 =있는 LDH (미디어 OD492) × (미디어 희석 계수) × (미디어 권)는 미디어 샘플을 희석하는 것이 필요하기 때문에 *, 희석 요인을 가장 자주 equal1.
총 LDH = ((해물 OD 490) × (lysate의 희석 계수) × (세포 현탁액의 권)) + ((미디어 OD 490) × (희석 계수) × (샘플링 분주 미디어 권))
5. 아데노 바이러스로 췌장 포상 세포를 감염
- 준비췌장 포상 세포는 3 장에서 설명했다.
- 단계 3.12에 따라 세포 현탁액에 아데노 바이러스 10 7 전염성 단위 (IFUs) 추가 37 30 분 품어 ° C.를
- 6 - 잘 접시에 세포 현탁액의 균등 판 2 ㎖.
- 대부분의 표현 구조의 경우, 세포가 적절하게 18 시간 내에 감염되어야하고, 단지 6 시간 내에 몇 루시퍼 구조를 위해.
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Representative Results
생리적 자극에 응답 포상 세포의 칼슘 측정의 예는 그림 3에 나와 있습니다. 포상 세포는 칼슘에 의해로드 된 염료 플루오 4 아세틸 콜린 아날로그 carbachol (CCH, 1 μM)로 관류) 8. 세포는 혀끝의 지역에서 시작하고 기저 영역 3,9에 전파 칼슘 파의 형태로 반응했다. 그림 3b에서와 같이 대표 표목은 일반적으로 1 μM의 carbachol 관찰 전형적인 피크 고원 패턴을 보여줍니다. 반대로, 콜레시스토키닌 아날로그 caerulein (10시)의 하위 최대 용량을 사용하여 진동 칼슘 응답 (그림 4) 10 얻을 수 있습니다.
췌장염 유도 작용제 님의 질문에 포상 세포의 LDH의 유출은 그림 5에 나와 있습니다. 여기에서 우리는 caerulein, carbachol, 또는 T의 존재 LDH 유출의 농도에 따라 증가 보여그는 담즙산 taurolithocholic 산 3 황산 (TLCS). LDH의 최대 누설을 유도하기 위해 필요한 농도는, 내부 포상 프로테아제 활성화 및 병리학 칼슘 신호를 유발하는 데 필요한과 일치하는 이러한 이벤트를 제안 부상으로 이어질 수 있습니다.
포상 세포는 활성화 된 T 세포의 하류 CN 음향, 핵 인자 (; 그림 6A NFAT)의 프로모터에 의해 구동됩니다 루시 페라 제 리포터 아데노 바이러스에 감염되었다. 우리는 TLCS (그림 6B 및 6C)의 존재 NFAT - 루시 페라 제 활동의 농도 및 시간 의존적 인 증가를 보여, 우리의 감염 방법의 유효성을 검사하는 대표적인 데이터를 제공합니다.
그림 1. 췌장 포상 세포의 대표 이미지 FOL다양한 준비를 lowing. (A) 포상 세포는 630X 배율에서 시각화, 캘리포니아 2 + 측정을위한 준비. 맨 윗줄 밝은 필드 현미경을 묘사, 아래쪽 행은 칼슘 2 + 염료 플루오로-4와 함께로드 포상 세포를 묘사하고 형광 현미경을 사용하여 시각. (B) 포상 세포로 400X 배율에서 시각화, 세포 독성 분석을 준비했습니다.
그림 2. . perifusion 챔버 (A) 챔버은 3 개의 층으로 이루어져있다 :. 고무 틈막이, 금속베이스와 플라스틱 커버 (B) 고무 가스켓은 금속 기초의 상단 세포가 배치 포함 22x22 mm의 coverslip에 배치됩니다 고무 개스킷의 상단에있는 위쪽. 플라스틱 덮개는 금속베이스에 나사로되어 18 × 18 mm의 coverslip에이 상단에 배치됩니다. (C) 챔버 다음이다현미경 스테이지에 고정. 튜브, 포함하는 버퍼 또는 작용제는 챔버의 가장자리 (화살표)에있는 입구로 공급된다. 별도의 튜브는 진공 (화살표 머리)에 이르게한다.
그림 3. carbachol (1 μM)의 자극에 따라 전형적인 피크 고원 칼슘 신호. . (A) 왼쪽에서 오른쪽으로, (A) 피칼에 표시된 acinus 및 (B) 포상 세포의 관심 asolateral 지역의 시야보기 세포는 칼슘 표시기 플루오로-4 (5 μM)에 의해로드 된. 생리적 carbachol (1 μM, 이크 아날로그)로 자극시 이후 이미지가 기초 영역에 전파 뒤에 혀끝 지역에서 칼슘 신호의 시작을 표시 (B) 각각의 패널로 화상 (1-4), 프레임에 해당합니다. 각 관심 영역에 대해 시간에 따른 형광 변화의 추적 대표를 따라. 이미지는색 눈금 (오른쪽 아래)와 사색에서 표현입니다. 왼쪽 및 오른쪽 화살표는 각각 정점과 기초 지역에서 처음으로 칼슘 상승 시간을 보여줍니다. 이 그림은 원래 생물학 화학의 전표에서 간행되었다. (Orabi AI, 샤 AU, Muili K., 루오 Y., 마흐무드 SM, 아마드 A., 리드 A., Husain SZ 에탄올은 carbachol에 의한 단백질 분해 효소의 활성을 강화하고 고립 된 쥐의 췌장 acini에서 칼슘 파도를 가속화합니다. 생물학 화학의 전표 2, 86, 14090-14097 (2011)).
그림 4. 자극 caerulein (10시).에 따라 일반적으로 칼슘 발진 (A) 전체 세포 세포질 칼슘의 변화는 염료 플루오 4 / 오전 칼슘을 사용하여 시간 경과 공 촛점 현미경에 의해 초에 한번씩 측정 하였다. 이미지는 색상의와 사색에 표시됩니다케일 (오른쪽). (B) 시간이 지남에 따라 형광의 대표 플롯은 산도 7.4에서 caerulein (10시)로 처리 한 세포에서 기록되었다. 이 그림은 원래 생물학 화학의 전표에서 간행되었다. (리드 AM, Husain SZ, 던지는 E., 알렉산더 M. 샤 A., Gorelick FS, 네이던 MH 낮은 세포 외 pH가 생물학 화학의 전표, 286, 1919-1926을 (신호 강화 칼슘에 의한 췌장 포상 세포의 손상을 유도 2011)).
그림 5. 다양한 췌장염 유도 길항제로 치료 포상 세포에서 세포 손상을 측정합니다. 격리 포상 세포, 젖산 탈수소 효소 (LDH) 누설 BI로 사용되었다부상의 ochemical 표시. 절연 포상 세포 (A) caerulein가 (1-100 nm의) (B) carbachol (1 μM -1 MM) 및이 (C) TLCS (50-500 μM) 및 % LDH 유출이 2 후 측정 농도의 변화로 치료했다 시간. (n = 3). #, *, P <0.05는 각각 제어 및 TLCS 형에 비해.
그림 6. 아데노-NFAT - 루시퍼에 감염된 췌장 포상 세포에서 루시 페라 제 활동을 측정합니다. (A) TLCS와 발광 아데노 바이러스 NFAT - 루시 페라. (B) TLCS (5-500 μM)에 의한 NFAT - 루시 페라 제 활동.의 관리는 (C) 시간 코스 시연 축적과 기본 마우스 췌장 포상 세포의 감염에 대한 스키마 (500 μM) 6에 주어진기간을 시간. (n = 3). *, #, P는 각각 단독으로 컨트롤이나 TLCS을 기준으로 <0.05,.
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Discussion
세포 분리 방법과 이후의 분석은 외분비 췌장의 생리적 및 병리 적 특징을 연구하는 강력한 도구를 나타냅니다 여기 아닙니다. 분산 췌장 포상 세포를 분리하는 방법은 1972 년 11 암스테르담 제이미 슨에 의해 설명되었다. 여기에 제시된 방법은 반 애커와 동료 (12)에 의해 설명 최근 분리 방법에서 적응되었다. 이러한 기술은 높은 재현성 쉽게 배울 수 있지만, 정확하게 수행해야합니다 각각의 방법에는 몇 가지 중요한 기능이 있습니다. 이러한 기술적 인 세부 사항을 이해하면 문제 해결 쉽고 향상된 응용 프로그램을 허용합니다.
칼슘 측정을위한 세포를 준비하고, 우리는 젊은 쥐에서 췌장이 더 일관된 결과를 얻을 것으로 나타났습니다. 그들은 덜 석면 - 지방 조직을 포함 가능성이 있기 때문에 acini 더 균등하게 분배됩니다. 용 칼슘 2 + 측정, 우리는 최적의 단일 세포 이미징을위한 작은 acini를 준비합니다. 이 LDH 측정을 위해 사용 된 것보다 높은 콜라 농도 (1.1 밀리그램 / ML, 200 U / ML)가 필요합니다. 이 방법은 초기에 적은 부상의 원인이되기 때문에 LDH 측정을 위해, 우리는 큰 acini을 준비합니다. 준비는, 그러므로, 낮은 콜라 농도 (0.5 밀리그램 / ML 또는 91 U / ㎖)를받습니다.
칼슘 2 + 측정, 그것은 세포가 산 세척의 coverslips에 도금하는 것이 중요합니다. 산 세척의 목적은 깨끗한 표면뿐만 아니라 acini의 최대 부착을 허용 정전기 상호 작용을 제공하는 것입니다. 세포 탁 (BD 바이오 사이언스는) 대신에, 또는이 메소드에 추가하여 사용할 수 있습니다. 또한, 칼슘 2 + 염료 BSA 바인딩에서 염료를 방지하기 위해서 BSA가없는 배양 버퍼 (1)에로드 (2) acini는 최대한 산 세척의 coverslips을 준수 할 수 있도록하는 중요 .
t "는 설명> 재관류 챔버 맞춤 설계. 상업 회의소 및 흐름 시스템은, 그러나, 워너 악기를 통해 사용할 수 있습니다했습니다. 관류뿐만 아니라, 제대로 규제 진공을 설정하면 전원을 흡입되는 포상 세포를 방지하는 중요한 요소이다 coverslip을.췌장 포상 세포에서 칼슘 신호를 측정 할 때, 우리는 공 촛점 현미경의 사용을 설명합니다. 공 촛점 이미징 위 또는 초점 평면 아래에서 빛을 제거하기 위해 광전 튜브의 앞에 작은 구멍을 사용합니다. 대조적으로, 넓은 필드 영상은 시편의 형광 이미지를 오염 (초점 원하는 평면 위 아래 즉 빛) 초점 빛에서 허용 표본의 여기 경로에 걸쳐 빛을 감지합니다. 넓은 필드 위에 공 촛점 현미경의 장점은 얇은 단면 시료의 영상뿐만 아니라, 함께 수집 된 광학 조각의 3D 재건 수 있다는 것입니다Z-축. 또한, 공 초점 현미경, 라인 스캐너, sweptfield 스캐너 또는 포인트 스캐너도 좁혀 영역을 회전 디스크를 사용하여 칼슘 형광 빠른 변화를 캡처 할 수 있습니다 고속 수집 시스템을 제공합니다.
이러한 각각 파도와 진동 같은 칼슘 신호 패턴의 시공간적 변화가 안정적으로 F / F 0 계산을 사용하여 측정하지만,이 [칼슘 2 +]의 진정한 표시되지 않습니다 수 있습니다. 정량적으로 측정 [칼슘 2 +]는 오류가 손실 13,14을 photobleaching에 염료로 인해 이러한 측정에서 발생할 수 있지만, 단일 파장의 여기와 같은 플루오로-4로 배출 칼슘 염료를 사용하여 계산 될 수있다. [칼슘 2 +] 같은 Fura2 또는 Indo1 15와 같은 비례 염료를 사용하여보다 정확하게 측정하지만,이 때문에 여기에 대한 UV 레이저의 요구의 대부분을 공 촛점 현미경에 허무 할 수 있습니다. 한편, concomita에플루오 3 플루오 4의 Fura-레드 NT를 사용하는 대부분의 공 촛점 현미경 16에 존재하는 488 nm의 여기 줄을 사용하여 비율 이미징을 허용 할 수 있습니다.
LDH 누설 포상 세포 손상에게 7,17 측정을위한 중요한 도구입니다. 또 다른 보완적인 방법의 propidium 요오드 섭취 18. 아데노 바이러스 감염은 배양 acini 19 높은 감염률을 얻을 수 있습니다. 바이러스의 농도가 적정해야 할 수 있습니다. 또한, 다른 관련이없는 아데노 바이러스 구조도 감염되는 비교 제어 환경을 제공하기 위해 도움이됩니다. 12 시간 이하에 대한 최근 우리의 감염 대부분의 연구. 그러나 오랜 기간 동안 항생제는 처음에 DMEM-F12 미디어에 추가 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 보조금 DK083327 및 DK093491의 국립 연구소 (SZH까지)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 um pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 | |
References
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