Summary
هناك حاجة إلى تحسين فهم بيولوجيا سرطان البنكرياس حاسمة لتمكين وضع خيارات علاجية أفضل لعلاج سرطان البنكرياس. لتلبية هذه الحاجة، ونحن لشرح نموذج مثلي من سرطان البنكرياس الذي يسمح للرصد غير الغازية من تطور سرطان باستخدام
Abstract
Introduction
سرطان البنكرياس هو رابع سبب رئيسي للوفاة المتصلة بالسرطان، مع معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات من 4-6٪، 1،2 15٪ فقط من المرضى يتم تشخيصهم في وقت مبكر بما فيه الكفاية في هذا المرض ليكون مؤهلا لإجراء عملية جراحية، والأورام تتكرر في> 80٪ من هؤلاء المرضى. يستخدم 3،4 جيمسيتابين لعلاج الأورام الغدية السرطانية البنكرياس، ومع ذلك، مقاومة كيميائية هو شائع وغالبا ما يكون الدواء له تأثير يذكر على البقاء على قيد الحياة عموما. هناك حاجة ماسة 5 استراتيجيات الدوائية جديدة لعلاج سرطان البنكرياس. تنميتها يعتمد على تحسن كبير في فهم الخطوات الرئيسية لتطور المرض التي قد تكون حساسة لتدخل علاجي.
نماذج مثلي من سرطان البنكرياس تحاكي جوانب رئيسية من الأمراض التي تصيب البشر، مما يجعلها أدوات مثالية لدراسة علم الأحياء من سرطان البنكرياس. 6-9 وعلى النقيض من في المختبر المقايسات خلية مقرها من سرطان البنكرياس سلوك الخلية عند تحت الجلد في النماذج الحية من سرطان البنكرياس، ونماذج مثلي تسمح التحقيق في التفاعلات الخلايا السرطانية مع المكروية البنكرياس. حركية تطور المرض هي تكرار للغاية في نماذج مثلي وتحدث على مدى فترة زمنية قصيرة (أسابيع)، مما يجعلها مناسبة تماما لاختبار ما قبل السريرية لعلاجات جديدة. هذا هو على النقيض من النماذج المعدلة وراثيا حيث تحدث بداية ظهور أعراض المرض على مدى زمني أطول وأكثر متغير (أشهر إلى سنة 1). 10 عندما تستخدم مع خطوط الخلايا أكثر عدوانية، ونماذج مثلي من سرطان البنكرياس لديهم أنماط من ورم خبيث عفوية مماثلة لتلك التي ظهرت في المرضى. 8 التعبير عن جينات مراسل إضاءة الحيوية مثل luciferase يراعة يسهل الرصد الطولي للنمو الورم، ونشر النقيلي، تكرار وردا على التداوي. 6،11
نحن هنا وصف نموذج مثلي من سرطان البنكرياس التي تستخدم MATRIGEL للتسليم خلية محلية والتصوير في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي لرصد غير الغازية من تطور الورم. هذا نموذج مثلي من سرطان البنكرياس يسمح التحليلات غير الغازية من تطور المرض والاستجابة للتدخلات العلاجية في نماذج syngenic أو طعم أجنبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ بروتوكول يتم شرحها تحت إشراف وموافقة من مؤسسة رعاية الحيوان المؤلف واللجنة الاستخدام. يتم تنفيذ جميع التجارب في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية واللوائح والوكالات التنظيمية ذات الصلة.
1. Transducing سرطان البنكرياس خطوط الخليوي
- خلايا سرطان البنكرياس تنبيغ للتعبير عن وسيفيراز كما هو موضح سابقا. 12،13 بانكايك ه-1-1 وCapan البنكرياس خطوط الخلايا السرطانية ترانسدوسيد مع luciferase يراعة تستخدم هنا.
ملاحظة: يمكن أيضا وسيفيراز Renilla أو وسيفيراز البكتيرية استخدامها.
2. سرطان البنكرياس خلية التحضير
- ثقافة ترانسدوسيد خلايا سرطان البنكرياس حتى 70٪ متموجة.
- رفع خلايا البنكرياس وضمان بقاء أكبر من 90٪.
- Resuspend في 2 × 10 7 خلية / مل في خليط 03:02 من Matrigel مبردة: الفوسفات مخزنة SALالمعهد الوطني للإحصاء (PBS).
- إبقاء التعليق على Matrigel الخلية على الجليد قبل الحقن في البنكرياس.
ملاحظات: لضمان التصلب السريع للMatrigel، والحد من حجم PBS لحساب حجم الخلية بيليه. التعامل مع Matrigel باستخدام أدوات الجليد الباردة والمحاقن في جميع الأوقات لمنع التصلب قبل الحقن. عدد الخلايا اقترح هو دليل وينبغي أن تحدد تجريبيا لكل خط الخلية.
3. إعداد الماوس
- تخدير الماوس باستخدام استنشاقه 2-3٪ isoflurane و. تحديد عمق التخدير عن طريق عدم وجود منعكس دواسة لقرصة اصبع القدم لطيف.
- تطبيق مواد التشحيم للعيون لمنع جفاف.
- ضع الماوس على ظهرها على 37 درجة مئوية وسادة التدفئة وتشغيل بلطف الماوس لرفع الجانب الأيسر من البطن.
- إعداد البطن مع 10٪ البوفيدون محلول اليود.
ملاحظات: Injectabجنيه التخدير يمكن أن تستخدم بدلا من التخدير بالاستنشاق. الصيام قبل العملية ليست ضرورية.
4. البطن
- استخدام الأدوات الجراحية المعقمة جعل 1.5 سم شق في الجلد حوالي 1 سم الجانبي الأيسر من خط الوسط.
- جعل شق 1.5 سم في عضلة البطن الأساسية.
- حدد موقع الطحال باستخدام ملقط وإزالة بلطف والطحال من تجويف البطن. تأمين الطحال على طول برعم القطن المعقم لفضح البنكرياس الكامنة.
- تحديد موقع الذيل من البنكرياس المتاخمة للالطحال.
- باستخدام 29 G 0.3 مل حقنة الأنسولين، وضخ 20 ميكرولتر من التعليق على Matrigel خلية في البنكرياس.
- بعد الحقن، والاستمرار على حقنة في البنكرياس لمدة 30-60 ثانية حتى وطدت Matrigel. هذه الخطوة الهامة يقلل من تسرب الخلية.
- تفقد موقع الحقن لضمان حدثت أي تسرب.
- عودة الطحال والبنكرياس إلى تجويف البطن.
ملاحظة: احرص على تجنب ثقب الجانب الظهري من البنكرياس والتي قد تكون رقيقة.
5. إغلاق جدار البطن
- إغلاق الجهاز العضلي في البطن من الفأرة مع خياطة 4-0 مضفر امتصاص بإبرة جولة باستخدام غرزة المستمر.
- إغلاق الجلد الخارجية مع غير قابل للامتصاص حيدة 6-0 خياطة بإبرة القطع باستخدام غرزة المستمر.
- إزالة الماوس من مخدر المستنشق وحقن 0.05-0.1 ملغم / كغم البوبرينورفين تحت الجلد.
- السماح للماوس على التعافي في قفصه وضعت على 37 ° C سادة التدفئة مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. إذا الفئران تظهر علامات للألم مثل hunching أو إعاقة حركية، بوبرينورفين قد تعطى كل 12 ساعة على مدى فترة 36 ساعة.
- بعد التئام الجروح (7-10 أيام)، تخدير الماوس وإزالة الخيوط الجراحية الخارجية.
6. تتبع إضاءة الحيوية من كانكون البنكرياسإيه التقدم
- تخدير الماوس باستخدام استنشاق isoflurane و.
- حقن 150 ملغم / كغم D-وسيفيرين عبر الوريد الذيل.
- ضع الماوس في نظام التصوير إضاءة الحيوية والتقاط الصور البيضاء الخفيفة وتلألؤ بيولوجي كما هو موضح سابقا. 14،15
- إزالة الماوس من مخدر المستنشق والسماح لها للتعافي في قفص وطنه.
ملاحظة: إضاءة الحيوية التصوير هو غير الغازية ويمكن أن تجرى بشكل دوري للتحقيق حركية نمو الورم. لورم الصورة في ذيل البنكرياس من المهم وضع الماوس على جانبها الأيسر، وبالتالي فإن نقاط ورم في اتجاه الكاميرا. نحن تصويرها مرة واحدة في الأسبوع مع زيادة تردد تصل إلى ثلاث مرات في الأسبوع قبل نقطة النهاية التجريبية باستخدام نظام التصوير الثاني لومينا (بيركن، إلمر، سابقا الفرجار علوم الحياة) تشغيل المعيشة البرمجيات 4.3.1 التصوير مع binning 4، FOV 12.5، F-1 توقف، والتعرض 1-60 ثانية (يحدده أعلى إكسبosure دون التشبع بكسل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا الأسلوب نموذج مثلي من سرطان البنكرياس باستخدام العمليات الجراحية، بما في ذلك تحريض التخدير، البطن، حقن الخلايا السرطانية في إغلاق Matrigel والبطن (الشكل 1A). حقن الخلايا تشكيل فقاعة في سطح البنكرياس (1B الشكل). تطور سرطان البنكرياس قد يكون رصدها باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي في الجسم الحي لتعقب انتشار الخلايا السرطانية ونشرها (الشكل 2) غير جراحية. وأشير إلى ورم خبيث في الكبد عن طريق الملاحظة من تلألؤ بيولوجي في الكبد أثناء استئصال الجراحي (الشكل 2)، وأكد فيفو السابقين من قبل الأنسجة (الشكل 4B). تم مقطوعة الأورام الأولية مع ذيل البنكرياس والطحال في 6 أسابيع بعد الزرع. ديناميات نمو الورم في هذا النموذج حقن مثلي هي استنساخه وتشبه الى حد كبير حركية نماذج زرع مثلي من السلطة الفلسطينية سرطان ncreatic (الشكل 3). نمو الورم في البنكرياس هو الغازية محليا ومستطير إلى الأجهزة بما في ذلك الكبد (الشكل 4).
الشكل 1. نموذج الفأر مثلي من تطور سرطان البنكرياس. A) ط. يتم إصلاح الماوس تخدير في مكانها باستخدام الشريط ويتم تطهيرها البطن. الثاني. بعد فتح البطن الطولية والطحال والبنكرياس وذيل exteriorized بلطف والذي عقد في مكان على برعم القطن المعقم. ثالثا. يتم حقن الخلايا السرطانية البنكرياس على Matrigel جزءا لا يتجزأ في ذيل البنكرياس. رابعا. يتم إغلاق البطن في طبقتين. صورة B) تضخيم تظهر الطحال والبنكرياس exteriorized. حقن الخلايا تشكيل فقاعة (رأس السهم). ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
الشكل 2. التصوير إضاءة الحيوية من ورم البنكرياس مثلي بعد (A) عشرة أيام حقن، (B) بعد 31 يوما حقن، و (C) خمسة أيام بعد استئصال الورم.
الشكل (3). في الجسم الحي نمو الورم الرئيسي من بانكايك ه-1-1 وCapan خطوط الخلايا تم رصد أكثر من مرة (بعد أيام الحقن) عن طريق التصوير تلألؤ بيولوجي (ن = 4). وحركية نمو الورم بعد حقن على Matrigel جزءا لا يتجزأ من الخلايا السرطانية البنكرياس هي مماثلة لنماذج مثلي باستخدام زرع قطعة ورم البنكرياس.
_upload/50395/50395fig4.jpg "بديل =" الشكل 4 "/>
الشكل 4. الهيماتوكسيلين والمقاطع يوزين الملطخة من (A) ورم البنكرياس بانكايك ه-1 الأولية، و (B) الانبثاث الكبد من بانكايك ه-1 ورم البنكرياس الأولية. * غزو محلي من خلايا سرطان البنكرياس إلى الجهاز المحيطة بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا وصف نموذج مثلي لتقييم الطولي للتنمية ورم البنكرياس والتقدم. حركية نمو الورم الرئيسي هي استنساخه (الشكل 3) ويمكن رصد غير جراحية باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي من الخلايا وسيفيراز الموسومة، على سبيل المثال لتحليل استجابة الورم للرواية علاجات السرطان مكافحة البنكرياس. واتساقا مع هذا المرض الإنسان، ويظهر نموذج غزو البنكرياس المحلية (الشكل 4A) الذي يسمح التحقيق في التفاعلات الخلايا السرطانية مع المكروية البنكرياس. استخدام خطوط الخلايا وسيفيراز الموسومة يسمح تحليلات للتردد والموقع وحركية نشر النقيلي. استخدام خطوط الخلايا وسيفيراز الموسومة يسهل الكشف عن النقائل قبل أن تصبح واضحة بصريا، وربما يتم تأكيد توطين الأنسجة من الانبثاث بواسطة فيفو السابقين التصوير والأنسجة. كما في الحالة السريرية، ويظهر نموذج الانبثاث إلى ORGويمكن أيضا الجواب بما في ذلك العقد المساريقي الليمفاوية والكبد والجهاز الهضمي والتجويف البريتوني (الشكل 4). 8 التصوير تلألؤ بيولوجي استخدامها لتحديد استئصال ناجحة، ووقوعه وحركية تكرار الورم الرئيسي (الشكل 2C). 16
إعداد دقيق والتعامل مع خلايا سرطان البنكرياس هو ضروري لاستنساخ النموذج. وقد تم تحسين نسبة Matrigel إلى برنامج تلفزيوني لمدة التصلب السريع للخلية بيليه بعد الحقن. ينبغي طرح حجم الخلايا مكعبات (حوالي 35 ميكرولتر لمدة 10 7 الخلايا السرطانية) من حجم برنامج تلفزيوني لمدة نسبة 03:02 النهائية من Matrigel: الخلايا + PBS. خلال حقن، يتم منع تسرب الخلية من خلال الحفاظ على إبرة في الموقع لمدة 30-60 ثانية حتى وطدت Matrigel (الشكل 1). إذا لم يحدث تسرب فإنه يتم الكشف بسهولة كما هو Matrigel الملونة ويجوز استبعاد تلك الفئران جمعةتحليلات ROM أخرى. منع تسرب الخلايا السرطانية يضمن أن يحدث ورم خبيث من نشر الخلايا السرطانية بدلا من أن تكون قطعة أثرية من تقنية الحقن.
وسوف يتأثر حركية التنمية الورم عن طريق عدد الخلايا حقن ويجب أن تحدد تجريبيا لكل خط الخلية. وجدنا أنماط نمو الورم استنساخه بعد الحقن من 4 × 10 5 بانكايك ه-1-1 أو Capan الخلايا (الشكل 3). وسوف يتأثر عتبة للكشف عن إضاءة الحيوية من الانبثاث بواسطة خصائص التعبير المستخدمة بما في ذلك بناء قوة المروج واستخدام وسيفيراز كودون الأمثل. بالإضافة إلى نماذج طعم أجنبي وصفها هنا، يمكن أيضا أن تستخدم التقنيات مع syngenic خطوط الخلايا البنكرياسية لدراسة تطور البنكرياس في بيئة مناعيا. وقد لوحظت ديناميكية مماثلة الورم في الفئران الذكور أو الإناث (لا تظهر البيانات).
طريقة وصفهاوقد تم إعادة تعديل لنموذج زرع مثلي من سرطان البنكرياس. في هذا النموذج، وتزرع تحت الجلد في الفئران أورام المانحة، ثم يتم زرعها في 1 مم 3 قطعة في جيب صغير في ذيل البنكرياس على فأرة الحاسوب المستلم. 6-8،17 نمو الورم الرئيسي يمكن رصدها باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي باستخدام الأورام المانحة المستمدة من الخلايا السرطانية وسيفيراز الموسومة. وعلى النقيض من نموذج مثلي وصفها هنا، نماذج زرع تتطلب وقتا إضافيا (تصل إلى 1 في الشهر) والفئران إضافية لتوليد أورام المانحة. النتائج باستخدام نماذج زرع قد تتأثر تركيبة غير متجانسة من القطع السرطانية المزروعة. أظهرنا هنا أن حركية بعد حقن الخلايا على Matrigel جزءا لا يتجزأ من تشبه النموذج المزروع. وقد استخدمت نماذج زرع لدراسة وتوسيع عينات المريض السريرية. 18-21
نماذج مثلي الموصوفة هنا تكمل المعدلة وراثيا مodels من سرطان البنكرياس قبل الغازية والغازية. 10،22،23 النماذج المعدلة وراثيا ألخص جوانب رئيسية من سرطان البنكرياس الإنسان بما في ذلك الطفرات الجين الورمي ولكن تبين تقلب كبير في بداية المرض (7 أسابيع ل> 1 ريال). 10،23 أغلب النماذج المعدلة وراثيا تفعل تعبر عن وسيفيراز وكذلك لا تصلح للفي مجال التصوير تلألؤ بيولوجي المجراة من تطور المرض. في المقابل، نماذج مثلي من سرطان البنكرياس تظهر حركية استنساخه من تطور الورم والسماح للرصد غير الغازية، مما يجعلها مناسبة تماما لدراسات ما قبل السريرية العلاجية.
هناك حاجة ماسة مناهج علاجية جديدة لمكافحة معدلات البقاء على قيد الحياة منخفضة بشكل استثنائي لسرطان البنكرياس. من خلال السماح التصور من المرض المنتشر والمتكررة، ونماذج مثلي من سرطان البنكرياس الموصوفة هنا هي ذات الصلة إلى إعداد سريرية، حيث ان معظم العلاجات الحالية هي الملطفة. وبالإضافة إلى ذلك، ونماذج مثليهي قيمة للغاية للتحقيق في البنكرياس بيولوجيا الورم وتقييم استراتيجيات علاجية جديدة في الإعداد في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية، أستراليا (1008865)، ومجلس الأبحاث الأسترالي (LE110100125)، والمعهد الوطني للسرطان (CA138687-01)، ويدعم إيريكا سلون من قبل الزمالة المهنية في وقت مبكر من سرطان الثدي الوطنية مؤسسة، أستراليا. ويدعم كورينا كيم فوكس من قبل زمالة من جامعة الدول السرطان السويسرية ومنحة دراسية من معهد موناش HDR العلوم الصيدلية. ويدعم إليان أنغست من خلال منحة من جامعة برن السرطان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean Bench coat | |||
| Heating pad | Set to 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissecting scissors | |||
| Iris forceps (serrated) | |||
| Needle holder | |||
| 27 G 0.3 ml insulin syringe | Terumo | T35525M2913 |
References
- American Cancer Society. Facts and Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Hariharan, D., Saied, A., Kocher, H. M. Analysis of mortality rates for pancreatic cancer across the world. HPB (Oxford). 10, 58-62 (2008).
- Li, D., Xie, K., Wolff, R., Abbruzzese, J. L. Pancreatic cancer. Lancet. 363, 1049-1057 (2004).
- Oettle, H., et al. Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observation in patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer: a randomized controlled trial. JAMA. 297, 267-277 (2007).
- Andersson, R., et al. Gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer: molecular mechanisms and potential solutions. Scand. J. Gastroenterol. 44, 782-786 (2009).
- Angst, E., et al. Bioluminescence imaging of angiogenesis in a murine orthotopic pancreatic cancer model. Mol. Imaging Biol. 12, 570-575 (2010).
- Angst, E., et al. N-myc downstream regulated gene-1 expression correlates with reduced pancreatic cancer growth and increased apoptosis in vitro and in vivo. Surgery. 149, 614-624 (2011).
- Hotz, H. G., et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer. Pancreas. 26, 89-98 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the Panc02 and 6606PDA cell lines. Eur. Surg. Res. 47, 98-107 (2011).
- Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell. 4, 437-450 (2003).
- Sloan, E. K., et al. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Res. 70, 7042-7052 (2010).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Morizono, K., et al. Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection. Nat. Med. 11, 346-352 (2005).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. J. Vis. Exp. (56), e3175 (2011).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. J. Vis. Exp. (52), e2775 (2011).
- Burton, J. B., et al. Adenovirus-mediated gene expression imaging to directly detect sentinel lymph node metastasis of prostate cancer. Nat Med. 14, 882-888 (2008).
- Vezeridis, M. P., Doremus, C. M., Tibbetts, L. M., Tzanakakis, G., Jackson, B. T. Invasion and metastasis following orthotopic transplantation of human pancreatic cancer in the nude mouse. J. Surg. Oncol. 40, 261-265 (1989).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5645-5649 (1992).
- Reyes, G., et al. Orthotopic xenografts of human pancreatic carcinomas acquire genetic aberrations during dissemination in nude mice. Cancer Res. 56, 5713-5719 (1996).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Furukawa, T., Kubota, T., Watanabe, M., Kitajima, M., Hoffman, R. M. A novel "patient-like" treatment model of human pancreatic cancer constructed using orthotopic transplantation of histologically intact human tumor tissue in nude mice. Cancer Res. 53, 3070-3072 (1993).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Brembeck, F. H., et al. The mutant K-ras oncogene causes pancreatic periductal lymphocytic infiltration and gastric mucous neck cell hyperplasia in transgenic mice. Cancer Res. 63, 2005-2009 (2003).
