Summary
Forbedret forståelse af kræft i bugspytkirtlen biologi kritisk nødvendige for, at udviklingen af bedre terapeutiske muligheder for at behandle kræft i bugspytkirtlen. At imødekomme dette behov, viser vi en ortotopisk model af bugspytkirtelkræft, der tillader ikke-invasiv overvågning af udviklingen af kræft ved hjælp af
Abstract
Introduction
Kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald, med en 5-års overlevelse på 4-6%. 1,2 Kun 15% af patienterne er diagnosticeret tidligt nok i sygdommen for at være berettiget til operation og tumorer gentages i> 80% af de patienter. 3,4 Gemcitabin anvendes til behandling af pancreas-adenocarcinomer, dog kemoterapiresistens er almindelig og ofte lægemidlet har ringe indvirkning på den samlede overlevelse. 5 nye farmakologiske strategier til behandling bugspytkirtelkræft kritisk behov. Deres udvikling afhænger væsentligt forbedret forståelse af de vigtigste trin i sygdomsprogression, der kan være følsomme over for terapeutisk intervention.
Ortotopisk modeller af kræft i bugspytkirtlen efterligne centrale aspekter af den menneskelige sygdomme, hvilket gør dem ideelle værktøjer til at studere biologi af kræft i bugspytkirtlen. 6-9 I modsætning til in vitro cellebaserede analyser af kræft i bugspytkirtlen celle adfærd end subkutan in vivo modeller for kræft i bugspytkirtlen, ortotopisk modeller tillader efterforskning af tumor celle interaktioner med bugspytkirtlen mikromiljø. Kinetik sygdomsprogression er meget reproducerbar i ortotopisk modeller, og sker over en kort tidsramme (uger), hvilket gør dem velegnede til at pre-klinisk afprøvning af nye lægemidler. Dette er i modsætning til transgene modeller, hvor sygdomsstart sker over en længere og mere variabel tidsramme (måneder til 1 år). 10. Når det bruges med mere aggressive cellelinier, ortotopisk modeller af bugspytkirtelkræft har mønstre af spontan metastase svarende til dem set i patienter. 8. Angivelse af bioluminiscerende reportergener såsom ildflueluciferase letter langsgående overvågning af tumorvækst, metastatisk spredning, tilbagefald og respons på lægemidler. 6,11
Her beskriver vi en ortotopisk model af kræft i bugspytkirtlen, der udnytter MatrIgel for lokal celle levering og in vivo bioluminescens billeddannelse til ikke-invasiv overvågning af tumorprogression. Denne ortotopisk model af kræft i bugspytkirtlen giver ikke-invasive analyser af sygdommen og reaktion på terapeutiske interventioner i syngene eller xenograft modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen bliver demonstreret udføres under vejledning og godkendelse af forfatterens institutionens Dyrepleje og anvendelse udvalg. Alle forsøg udføres i overensstemmelse med alle relevante retningslinjer, regler og reguleringsorganer.
1.. Transduktion bugspytkirtelkræft Cell Lines
- Transducere bugspytkirtelkræftceller at udtrykke luciferase som tidligere beskrevet. 12,13 Panc-1 og Capan-1 bugspytkirtelkræft cellelinjer transduceret med ildflueluciferase anvendes her.
Bemærk: Renilla luciferase eller bakterielt luciferase kan også anvendes.
2.. Pancreas Cancer Cell Forberedelse
- Kultur transduced bugspytkirtelkræftceller indtil 70% sammenflydende.
- Løft pancreasceller og sikre levedygtighed er større end 90%.
- Resuspenderes ved 2 x 10 7 celler / ml i et 3:2-blanding af kølede Matrigel: Fosfatbufferet saline (PBS).
- Hold Matrigel-cellesuspensionen på is før injektion i bugspytkirtlen.
Bemærkninger: For at sikre en hurtig størkning af Matrigel, reducere PBS volumen til at redegøre for omfanget af cellepelleten. Håndtag Matrigel hjælp iskolde instrumenter og sprøjter på alle tidspunkter for at undgå størkning før injektion. Den foreslåede celle nummer er en guide og bør bestemmes empirisk for hver cellelinje.
3.. Mus Forberedelse
- Bedøver musen hjælp inhaleret 2-3% isofluran. Bestem anæstesidybden ved manglende pedal refleks til en blid tå knivspids.
- Påfør smøremiddel til øjnene for at forhindre udtørring.
- Anbring musen på ryggen på en 37 ° C varmepude og forsigtigt dreje musen for at hæve den venstre side af maven.
- Forbered maven med en 10% povidon-iod-opløsning.
Noter: Injectable anæstesi kan anvendes i stedet for inhaleret anæstesi. Pre-operative fasten er ikke nødvendig.
4.. Laparotomi
- Brug sterile kirurgiske instrumenter gør en 1,5 cm snit i huden ca 1 cm tilbage lateral fra midterlinien.
- Lav en 1,5 cm snit i den underliggende mavemuskel.
- Find milten ved hjælp af pincet og fjern forsigtigt milten fra bughulen. Fastgør milten langs en steril vatpind til at afsløre den underliggende bugspytkirtlen.
- Find halen af bugspytkirtlen tilstødende til milten.
- Ved hjælp af en 29 G 0,3 ml insulinsprøjte, 20 ul Matrigel-cellesuspension injicere ind i bugspytkirtlen.
- Efter injektion sprøjten holde i bugspytkirtlen i 30-60 sekunder indtil Matrigel er størknet. Dette vigtige skridt minimerer celle lækage.
- Undersøg injektionsstedet for at sikre, at ingen lækage opstod.
- Returnere milt og bugspytkirtel til bughulen.
Bemærk: Vær omhyggelig med at undgå at punktere den dorsale side af bugspytkirtlen, som kan være tynd.
5.. Abdominal Wall Closure
- Luk abdominale muskulatur af musen med en absorberbar flettet 4-0 sutur med en rund nål anvendelse af en kontinuerlig søm.
- Luk ydre hud med en ikke-absorberbar monofilament 6-0 sutur med en skærende nål anvendelse af en kontinuerlig søm.
- Fjern musen fra den inhalerede bedøvelsesmiddel og injiceret 0,05-0,1 mg / kg buprenorphin subkutant.
- Lad musen at komme i sit bur placeret på en 37 ° C varmepude med fri adgang til foder og vand. Hvis mus demonstrere tegn på smerte, såsom hunching eller bevægelseshæmmede kan buprenorphin gives hver 12 timer over 36 hr periode.
- Efter sårheling (7-10 dage), bedøver musen og fjerne de eksterne suturer.
6.. Bioluminescerende Tracking af pancreas Cancis Progression
- Bedøver musen hjælp inhaleret isofluran.
- Injicere 150 mg / kg D-luciferin via halevenen.
- Placer musen i bioluminiscerende imaging system og fange hvidt lys og bioluminescence billeder som tidligere beskrevet. 14,15
- Fjern musen fra den inhalerede bedøvelsesmiddel og tillader den at komme i sit hjem bur.
Bemærk: Bioluminescent billeddannelse er non-invasiv og kan udføres periodisk for at undersøge tumorvækst kinetik. Til billedet tumor i bugspytkirtlen halen, er det vigtigt at sætte musen på dens venstre side, så tumor peger mod kameraet. Vi afbildes en gang om ugen med frekvensen øges op til tre gange om ugen forud for den eksperimentelle slutpunkt under anvendelse af en Lumina II billeddannende system (Perkin-Elmer, tidligere Caliper Life Sciences), der kører Living Imaging 4.3.1 software med arkivering 4, FOV 12,5, F-stop 1, eksponering 1-60 sekunder (bestemt af den højeste exposure uden pixel mætning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metode beskriver en ortotopisk model af bugspytkirtelkræft hjælp kirurgiske procedurer, herunder induktion af anæstesi, laparotomi injektion af cancerceller i Matrigel og abdominal lukning (fig. 1A). De injicerede celler danner en boble i overfladen af bugspytkirtlen (figur 1B). Bugspytkirtelkræft progression kan være ikke-invasivt overvåges ved hjælp af in vivo bioluminescens imaging at spore cancercelleproliferation og formidling (figur 2). Levermetastaser blev indikeret ved observation af bioluminescens i leveren under kirurgisk resektion (figur 2) og bekræftet ex vivo ved histologi (figur 4B). Primære tumorer blev resekteret med pancreas hale og milt ved 6 uger efter implantation. Tumorvækst dynamik i denne ortotopisk indsprøjtning model er reproducerbare, og ligner kinetik ortotopisk transplantation modeller af pa ncreatic kræft (figur 3). Tumorvækst i bugspytkirtlen er lokalt invasive og metastaserer til organer, herunder lever (figur 4).
Figur 1. En ortotopisk musemodel af kræft i bugspytkirtlen progression. A) I. Den bedøvede mus er fast på plads ved hjælp af tape og underlivet desinficeres. ii. Efter langsgående laparotomi milt og pancreas hale er blidt eksterioriseret og holdes på plads på en steril vatpind. iii. Matrigel-embedded pancreas tumorceller injiceres i bugspytkirtlen hale. iv. Underlivet er lukket i to lag. B) Forstørret billede, der viser blotlagt milt og bugspytkirtel. De injicerede celler danner en boble (pilespids). ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Figur 2. Bioluminescerende billeddannelse af ortotopisk pancreas tumor (A) Ti dage efter injektion, (B) 31 dage efter injektion, og (C) fem dage efter tumorresektion.
Figur 3.. In vivo primær tumorvækst af Panc-1 og Capan-1 cellelinier blev overvåget over tid (dage efter injektion) ved bioluminescens imaging (n = 4). Kinetikken af tumorvækst efter injektion af Matrigel-indlejrede pancreas tumorceller ligner ortotopisk modeller med transplantation af pancreas tumor stykker.
_upload/50395/50395fig4.jpg "alt =" Figur 4 "/>
Figur 4.. Hematoxylin og eosin-farvede sektioner af (A) Panc-1 primær pancreas tumor, og (B) levermetastaser fra Panc-1 primær pancreas tumor. * Lokal invasion af bugspytkirtelkræftceller i det omgivende orgel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en ortotopisk model til langsgående vurdering af pancreas tumor udvikling og progression. Primær tumor vækstkinetik er reproducerbare (figur 3) og kan være non-invasivt overvåges ved hjælp af bioluminescens billeddannelse af luciferase-mærkede celler, fx til analyser af tumor respons på nye anti-bugspytkirtlen kræftmedicin. I overensstemmelse med den humane sygdom, viser modellen lokale pancreas invasion (figur 4A), som muliggør undersøgelse af tumor celle interaktioner med pancreas mikromiljø. Brugen af luciferase-mærkede cellelinjer giver analyser af frekvens, placering og kinetik af metastatisk spredning. Anvendelse af luciferase-mærkede cellelinjer letter påvisning af metastaser, før de bliver umiddelbart synlige og vævslokalisering af metastaser kan bekræftes ved ex vivo billeddannelse og histologi. Som i den kliniske situation, viser modellen metastaser til organs herunder mesenteriske lymfeknuder, lever, mave-tarmkanalen og bughulen (Figur 4). 8. bioluminescens billeddannelse kan også anvendes til at bestemme vellykket resektion, og forekomst og kinetik for primær tumor recidiv (figur 2C). 16.
Omhyggelig forberedelse og håndtering af bugspytkirtelkræftceller er afgørende for reproducerbarhed af modellen. Forholdet mellem Matrigel til PBS er blevet optimeret til hurtig størkning af cellepelleten efter injektion. Mængden af pelleterede celler (ca. 35 pi til 10 7 tumorceller) bør fratrækkes den mængde af PBS i en endelig 3:2 Matrigel: celler + PBS. Under injektion, er celle lækage forhindres ved at bibeholde kanylen in situ i 30-60 sekunder indtil Matrigel er størknet (figur 1). Hvis lækage forekommer det let afsløres som Matrigel er farvet og de mus kan udelukkes from yderligere analyser. Forebyggelse tumorcelle lækage sikrer, at metastase sker fra tumorcelle formidling snarere end som en artefakt af den injektionsteknik.
Kinetikken for tumorudvikling, vil blive påvirket af celletallet injiceres og bør bestemmes empirisk for hver cellelinje. Vi fandt reproducerbare tumor vækstmønstre efter injektion af 4 x 10 5 Panc-1 eller Capan-1-celler (figur 3). Tærsklen for bioluminescerende påvisning af metastaser vil blive påvirket af egenskaber ekspressionskonstruktionen anvendes, herunder promotoren styrke og anvendelsen af codon-optimeret luciferase. Ud over de xenograftmodeller beskrevet her, kan de teknikker også anvendes med syngene pancreas cellelinier til at undersøge bugspytkirtlen progression i en immunkompetent omgivelser. Lignende tumor dynamik blev observeret hos mandlige eller kvindelige mus (data ikke vist).
Den beskrevne fremgangsmåde hanre er blevet modificeret til en ortotopisk transplantation model af kræft i bugspytkirtlen. I denne model er tumorer dyrkes subkutant i donormus, så en 1 mm 3 piece transplanteres ind i en lille lomme i bugspytkirtlen halen af en modtager mus. 6-8,17 Primær tumorvækst kan overvåges ved hjælp af bioluminescens imaging ved hjælp donor tumorer afledt fra luciferase-mærkede tumorceller. I modsætning til den ortotopisk her beskrevne model kræver transplantation modeller ekstra tid (op til 1 måned) og yderligere mus til generering af donor tumorer. Resultater ved hjælp af transplantation modeller kan være påvirket af uensartede sammensætning af transplanterede tumor stykker. Vi viste her, at kinetikken efter injektion af Matrigel-indlejrede celler ligner den transplanterede model. Transplantation modeller er blevet brugt til at studere og udvide kliniske patientprøver. 18-21
De ortotopisk modeller beskrives her supplere transgene models af præ-invasive og invasive kræft i bugspytkirtlen. 10,22,23 Transgene modeller rekapitulere de vigtigste aspekter af den menneskelige bugspytkirtelkræft herunder onkogene mutationer, men viser signifikant variation i sygdomsdebut (7 uger til> 1 år). 10,23 Most transgene modeller gør ikke udtrykke luciferase og er således ikke egnet til in vivo bioluminescens billeddannelse af sygdomsprogression. I modsætning hertil viser ortotopisk modeller af bugspytkirtelkræft reproducerbare kinetik for tumorprogression og tillade ikke-invasiv overvågning, hvilket gør dem velegnede til prækliniske terapeutiske undersøgelser.
Nye terapeutiske tilgange kritisk behov for at bekæmpe de usædvanligt lave overlevelseschancerne for kræft i bugspytkirtlen. Ved at tillade visualisering af metastatisk og tilbagevendende sygdom, beskrev ortotopisk modeller af kræft i bugspytkirtlen her er relevante for det kliniske miljø, hvor de fleste nuværende behandlinger er palliative. Desuden, ortotopisk modellerer meget værdifulde til undersøgelse pancreas tumor biologi og evaluere nye terapeutiske strategier i in vivo omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Sundhed og Medical Research Council, Australien (1008865), den australske forskningsråd (LE110100125), National Cancer Institute (CA138687-01), Erica Sloan er understøttet af en tidlige karriere Fellowship fra National Breast Cancer Foundation, Australien. Corina Kim-Fuchs er understøttet af et stipendium fra den schweiziske Cancer League og et HDR stipendium fra Monash Institute of Pharmaceutical Sciences. Eliane Angst er støttet af en bevilling fra Bern Cancer League.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean Bench coat | |||
| Heating pad | Set to 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissecting scissors | |||
| Iris forceps (serrated) | |||
| Needle holder | |||
| 27 G 0.3 ml insulin syringe | Terumo | T35525M2913 |
References
- American Cancer Society. Facts and Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Hariharan, D., Saied, A., Kocher, H. M. Analysis of mortality rates for pancreatic cancer across the world. HPB (Oxford). 10, 58-62 (2008).
- Li, D., Xie, K., Wolff, R., Abbruzzese, J. L. Pancreatic cancer. Lancet. 363, 1049-1057 (2004).
- Oettle, H., et al. Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observation in patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer: a randomized controlled trial. JAMA. 297, 267-277 (2007).
- Andersson, R., et al. Gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer: molecular mechanisms and potential solutions. Scand. J. Gastroenterol. 44, 782-786 (2009).
- Angst, E., et al. Bioluminescence imaging of angiogenesis in a murine orthotopic pancreatic cancer model. Mol. Imaging Biol. 12, 570-575 (2010).
- Angst, E., et al. N-myc downstream regulated gene-1 expression correlates with reduced pancreatic cancer growth and increased apoptosis in vitro and in vivo. Surgery. 149, 614-624 (2011).
- Hotz, H. G., et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer. Pancreas. 26, 89-98 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the Panc02 and 6606PDA cell lines. Eur. Surg. Res. 47, 98-107 (2011).
- Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell. 4, 437-450 (2003).
- Sloan, E. K., et al. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Res. 70, 7042-7052 (2010).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Morizono, K., et al. Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection. Nat. Med. 11, 346-352 (2005).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. J. Vis. Exp. (56), e3175 (2011).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. J. Vis. Exp. (52), e2775 (2011).
- Burton, J. B., et al. Adenovirus-mediated gene expression imaging to directly detect sentinel lymph node metastasis of prostate cancer. Nat Med. 14, 882-888 (2008).
- Vezeridis, M. P., Doremus, C. M., Tibbetts, L. M., Tzanakakis, G., Jackson, B. T. Invasion and metastasis following orthotopic transplantation of human pancreatic cancer in the nude mouse. J. Surg. Oncol. 40, 261-265 (1989).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5645-5649 (1992).
- Reyes, G., et al. Orthotopic xenografts of human pancreatic carcinomas acquire genetic aberrations during dissemination in nude mice. Cancer Res. 56, 5713-5719 (1996).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Furukawa, T., Kubota, T., Watanabe, M., Kitajima, M., Hoffman, R. M. A novel "patient-like" treatment model of human pancreatic cancer constructed using orthotopic transplantation of histologically intact human tumor tissue in nude mice. Cancer Res. 53, 3070-3072 (1993).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Brembeck, F. H., et al. The mutant K-ras oncogene causes pancreatic periductal lymphocytic infiltration and gastric mucous neck cell hyperplasia in transgenic mice. Cancer Res. 63, 2005-2009 (2003).
