Summary
Beter begrip van alvleesklierkanker biologie is kritisch nodig om de ontwikkeling van betere therapeutische opties om pancreaskanker te behandelen mogelijk te maken. Om aan deze behoefte te pakken, zien we een orthotopic model van pancreaskanker die niet-invasieve monitoring van de progressie van kanker maakt gebruik van
Abstract
Introduction
Alvleesklierkanker is de vierde belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte, met een 5-jaarsoverleving van 4-6%. 1,2 Slechts 15% van de patiënten wordt de diagnose vroeg genoeg in de ziekte in aanmerking te komen voor een operatie, en tumoren terugkeren in> 80% van die patiënten. 3,4 Gemcitabine wordt gebruikt voor de behandeling van pancreatische adenocarcinomen, echter chemoresistance is gebruikelijk en vaak de drug heeft weinig invloed op de totale overleving. 5 nieuwe farmacologische strategieën van alvleesklierkanker te behandelen zijn kritisch nodig. Hun ontwikkeling hangt af van aanzienlijk verbeterd begrip van de belangrijkste stappen van de progressie van de ziekte die gevoelig zijn voor therapeutische interventie kan zijn.
Orthotopische modellen van pancreaskanker emuleren belangrijke aspecten van de menselijke ziekte, waardoor ze ideaal tools om de biologie van alvleesklierkanker. 6-9 In tegenstelling tot in vitro cel-gebaseerde testen van pancreaskanker celgedrag eend subcutaan in vivo modellen van pancreaskanker, orthotopische modellen laten onderzoeken van tumorcel interacties met de alvleesklier micro-omgeving. De kinetiek van de progressie van de ziekte zijn zeer reproduceerbaar in orthotopic modellen en voordoen over een korte tijd (weken), waardoor ze zeer geschikt voor pre-klinische testen van nieuwe therapieën. Dit in tegenstelling tot transgene modellen waarbij ziektebegin optreedt over een langere en variabele tijd (maanden tot 1 jaar). 10 Bij gebruik met meer agressieve cellijnen orthotopische modellen van alvleesklierkanker patronen van spontane metastase gelijk aan die in patiënten. 8 Expressie van bioluminescentie reporter genen zoals vuurvliegluciferase vergemakkelijkt longitudinale controle van de tumorgroei, metastatische verspreiding, herhaling en de respons op therapie. 6,11
Hier beschrijven we een orthotopic model van pancreaskanker die Matr gebruikigel cellen voor gelokaliseerde aflevering en in vivo bioluminescentie voor niet-invasieve monitoring van tumorprogressie. Dit orthotopic model van pancreaskanker maakt niet-invasieve analyses van progressie van de ziekte en de reactie op therapeutische interventies in syngene of xenograftmodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol wordt gedemonstreerd wordt uitgevoerd onder de leiding en goedkeuring van de auteur instelling dierlijke zorg en gebruik commissie. Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende instanties.
1. Transducing pancreaskankercellijnen
- Transduceren pancreaskanker cellen luciferase expressie zoals eerder beschreven. 12,13 Panc-1 en Capan-1 pancreaskankercellijnen getransduceerd met vuurvlieg luciferase worden hier gebruikt.
Opmerking: Renilla luciferase of bacteriële luciferase kunnen ook worden gebruikt.
2. Pancreaskankercellijnen Voorbereiding
- Cultuur getransduceerde alvleesklierkankercellen tot 70% samenvloeiing.
- Til de alvleesklier cellen en zorgen voor levensvatbaarheid is groter dan 90%.
- Resuspendeer in 2 x 10 7 cellen / ml in een 3:2 mengsel van gekoeld Matrigel: Fosfaat gebufferde saline (PBS).
- Houd de Matrigel-celsuspensie op ijs voorafgaand aan injectie in de alvleesklier.
Opmerkingen: Om snelle stolling van Matrigel waarborgen, verminderen de volume PBS met het volume van de celpellet. Handvat Matrigel met ijskoude instrumenten en spuiten te allen tijde stollen vóór injectie te voorkomen. De voorgestelde aantal cellen is een leidraad en moet empirisch worden bepaald voor elke cellijn.
3. Muis Voorbereiding
- Verdoven van de muis met behulp van geïnhaleerd 2-3% isofluraan. Bepaal de diepte van de anesthesie door een gebrek aan pedaal reflex een zachte teen knijpen.
- Breng smeermiddel aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.
- Plaats de muis op zijn rug op een 37 ° C verwarming pad en zet de muis voorzichtig naar de linkerkant van de buik te verhogen.
- Bereid de buik met een 10% povidonjood-oplossing.
Opmerkingen: Injectable anesthesie worden gebruikt in plaats van geïnhaleerde anesthesie. Pre-operatieve vasten niet noodzakelijk.
4. Laparotomie
- Met behulp van steriele chirurgische instrumenten maken een 1,5 cm incisie in de huid ongeveer 1 cm links lateraal van de middellijn.
- Voeg een 1,5 cm incisie in de onderliggende buikspier.
- Zoek de milt met behulp van de tang en verwijder voorzichtig de milt uit de buikholte. Beveilig de milt langs een steriel wattenstaafje om de onderliggende alvleesklier bloot.
- Zoek de staart van de pancreas naast de milt.
- Met behulp van een 29 G 0,3 ml insulinespuit Injecteer 20 ul van het Matrigel-celsuspensie in de pancreas.
- Na injectie, houd de injectiespuit in de alvleesklier voor 30-60 seconden totdat de Matrigel is gestold. Deze belangrijke stap minimaliseert cel lekkage.
- Inspecteer de injectieplaats te verzekeren geen lekkage optrad.
- Stuur de milt en pancreas de buikholte.
Opmerking: Let er op dat aanprikken van de dorsale zijde van de alvleesklier, die dun kan zijn.
5. Buikwand Sluiting
- Sluit de buikspieren van de muis met een absorbeerbare gevlochten 4-0 hechtdraad met een ronde naald met behulp van een continue steek.
- Sluit de externe huid met een niet-absorbeerbare monofilament 6-0 hechtdraad met een cutting naald met behulp van een continue steek.
- Verwijder de muis uit de ingeademde verdoving ingespoten 0.05-0.1 mg / kg subcutaan buprenorfine.
- Laat de muis om te herstellen in zijn kooi geplaatst op een 37 ° C verwarmen pad met vrije toegang tot voedsel en water. Als muizen tonen tekenen van pijn, zoals hunching of beperkte mobiliteit, kan buprenorfine worden gegeven om de 12 uur over een 36 uurs periode.
- Na wondgenezing (7-10 dagen), verdoven de muis en verwijder de externe hechtingen.
6. Bioluminescent Tracking van Pancreatic CancER Progression
- Verdoven van de muis met behulp van geïnhaleerd isofluraan.
- Injecteren 150 mg / kg D-luciferine via staartader.
- Plaats de muis in de bioluminescentie imaging systeem en vastleggen wit-licht-en bioluminescentie beelden zoals eerder beschreven. 14,15
- Verwijder de muis uit de geïnhaleerde verdoving en laten herstellen in zijn kooi.
Opmerking: Bioluminescent beeldvorming is niet-invasief en kan periodiek worden uitgevoerd om tumorgroei kinetiek onderzoeken. Om afbeelding tumor in de pancreas staart is het belangrijk om de muis te zetten aan de linkerkant, zodat de tumor wijst naar de camera. We afgebeeld eenmaal per week met de frequentie verhoogd tot drie keer per week voor de experimentele eindpunt met een Lumina II beeldvormingssysteem (Perkin-Elmer, voorheen Caliper Life Sciences) actief Living Imaging 4.3.1 software met binning 4, FOV 12,5, F-stop 1, blootstelling 1-60 sec (bepaald door de hoogste expComposure zonder pixel verzadiging).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methode beschrijft een orthotopic model van pancreaskanker behulp van chirurgische procedures, inclusief inductie van anesthesie, laparotomie, injectie van kankercellen in Matrigel en abdominale sluiting (Figuur 1A). De geïnjecteerde cellen vormen een luchtbel in het oppervlak van de alvleesklier (Figuur 1B). Alvleesklier kanker progressie kan niet-invasief bewaakt met in vivo bioluminescentie van kankercel proliferatie en verspreiding (Figuur 2) te vinden zijn. Levermetastasen werd aangegeven door observatie van bioluminescentie in de lever tijdens chirurgische resectie (figuur 2) en ex vivo bevestigd door histologie (Figuur 4B). Primaire tumoren werden gereseceerd met de pancreas staart en milt op 6 weken na implantatie. Tumorgroei dynamiek in deze orthotopic injectie model reproduceerbaar zijn en sterk lijken op de kinetiek van orthotope transplantatie modellen van pa ncreatic kanker (figuur 3). Tumorgroei in de pancreas is lokaal invasief en uitzaaiing organen zoals lever (Figuur 4).
Figuur 1. Een orthotope muismodel van pancreaskanker progressie. A) i. De verdoofde muis wordt vastgezet met tape en de buik wordt gedesinfecteerd. ii. Na longitudinale laparotomie de milt en pancreas staart voorzichtig zijn buiten gebracht en op zijn plaats gehouden op een steriele wattenstaafje. iii. Matrigel-ingebedde alvleesklier tumorcellen worden geïnjecteerd in de pancreas staart. iv. De buik wordt B) Vergrote afbeelding in twee lagen gesloten. Tonen exteriorized milt en alvleesklier. De geïnjecteerde cellen vormen een bel (pijlpunt). ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Bioluminescente beeldvorming van orthotope pancreastumor (A) tien dagen na de injectie (B) 31 dagen na injectie, en (C) vijf dagen na resectie.
Figuur 3. In vivo primaire tumorgroei van Panc-1 en Capan-1 cellijnen werd gevolgd in de tijd (dagen na injectie) door bioluminescentie (n = 4). De kinetiek van tumorgroei na injectie van Matrigel ingebedde pancreastumorcellen zijn vergelijkbaar met orthotope-modellen met transplantatie van alvleesklier tumorstukken.
_upload/50395/50395fig4.jpg "alt =" Figuur 4 "/>
Figuur 4. Hematoxyline en eosine gekleurde secties van (A) Panc-1 primaire alvleesklier tumor, en (B) levermetastasen van Panc-1 primaire alvleesklier tumor. * Lokale invasie van alvleesklierkanker cellen in de omringende organen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een orthotopic model voor longitudinale beoordeling van pancreastumor ontwikkeling en progressie. Primaire tumorgroei kinetiek reproduceerbaar zijn (figuur 3) en kan niet-invasief bewaakt worden gebruikt bioluminescentie van luciferase-gemerkte cellen, bijvoorbeeld voor de analyse van tumorrespons om nieuwe anti-alvleesklierkanker therapeutica. In overeenstemming met de menselijke ziekte, het model toont lokale alvleesklier invasie (figuur 4A), die onderzoek naar de tumorcel interacties met de alvleesklier micro-omgeving mogelijk maakt. Het gebruik van luciferase-gelabeld cellijnen maakt analyses van de frequentie, de locatie en de kinetiek van metastatische verspreiding. Gebruik van luciferase-gelabeld cellijnen maakt detectie van metastasen voordat ze duidelijk zichtbaar en weefsellokalisatie van metastasen kan worden bevestigd door ex vivo beeldvorming en histologie. Zoals in de klinische situatie, het model toont metastase organs waaronder mesenteriale lymfeknopen, lever, maagdarmkanaal en de peritoneale holte (figuur 4). 8 Bioluminescentie beeldvorming kan ook worden gebruikt om succesvolle resectie en incidentie en kinetiek van de primaire tumor recidief (figuur 2C) te bepalen. 16
Zorgvuldige voorbereiding en behandeling van alvleesklierkanker cellen is essentieel voor de reproduceerbaarheid van het model. De verhouding van Matrigel aan PBS is geoptimaliseerd voor snelle stolling van de celpellet na injectie. Het volume van gepelleteerde cellen (ongeveer 35 ui 10 7 tumorcellen) worden afgetrokken van het volume van PBS voor een laatste 3:2 Matrigel: cellen + PBS. Bij injectie wordt cel lekkage voorkomen door het handhaven van de naald in situ gedurende 30-60 seconden totdat de Matrigel gestold (figuur 1). Als lekkage optreedt het is gemakkelijk gedetecteerd als Matrigel is gekleurd en die muizen kan worden uitgesloten from verdere analyses. Voorkomen tumorcel lekkage zodat metastase optreedt verspreiding van tumorcellen en niet als een artefact van de injectietechniek.
De kinetiek van tumorontwikkeling wordt beïnvloed door het aantal cellen ingespoten moet empirisch worden bepaald voor elke cellijn. Hebben we reproduceerbare tumorgroei patronen na injectie van 4 x 10 5 Panc-1 en Capan-1 cellen (Figuur 3). De drempel voor bioluminescente detectie van metastasen wordt beïnvloed door kenmerken van de gebruikte expressieconstruct zoals de promoter sterkte en het gebruik van codon-geoptimaliseerde luciferase. Naast de xenograft modellen beschreven, kan de techniek ook gebruikt worden met syngene pancreas cellijnen alvleesklier progressie onderzoeken een immunocompetente omgeving. Soortgelijke tumor dynamiek waargenomen in mannelijke of vrouwelijke muizen (gegevens niet getoond).
De methode beschreef hijre is aangepast voor een orthotope transplantatie model van pancreaskanker. In dat model worden tumoren subcutaan gekweekt in donormuizen, dan is een 1 mm 3 stuk wordt getransplanteerd in een klein zakje in de alvleesklier staart van een ontvanger muis. 6-8,17 primaire tumorgroei kan worden gevolgd bioluminescentie beeldvorming met behulp van donor tumoren afgeleid van luciferase-gelabeld tumorcellen. In tegenstelling tot de hier beschreven orthotope model, transplantatie modellen vereisen extra tijd (maximaal 1 maand) en aanvullende muizen voor het genereren van donor tumoren. Resultaten middels transplantatiemodellen kan worden beïnvloed door heterogene samenstelling van getransplanteerde tumorstukken. We zien hier dat de kinetiek na injectie van Matrigel-ingebedde cellen zijn vergelijkbaar met de getransplanteerde model. Transplantatiemodellen zijn gebruikt te bestuderen en vergroten klinische patiënt monsters. 18-21
De orthotopische modellen hier beschreven aanvulling transgene modellen van pre-invasieve en invasieve pancreaskanker. 10,22,23 transgene modellen recapituleren belangrijke aspecten van de menselijke alvleesklierkanker waaronder oncogene mutaties, maar tonen een aanzienlijke variatie in begin van de ziekte (7 weken tot> 1 jaar). 10,23 meeste transgene modellen doen express luciferase en zijn dus niet geschikt om in vivo bioluminescentie van ziekteprogressie. In tegenstelling, orthotopische modellen van alvleesklierkanker blijkt reproduceerbare kinetiek van tumorprogressie en toestaan dat niet-invasieve monitoring, waardoor ze uitermate geschikt voor pre-klinische therapeutische studies.
Nieuwe therapeutische benaderingen zijn kritisch nodig voor de bestrijding van de uitzonderlijk lage overlevingskansen voor alvleesklierkanker. Door toe te staan visualisatie van metastatische en terugkerende ziekte, de orthotopische modellen van pancreaskanker hier beschreven om de klinische setting, waar de meeste huidige behandelingen zijn palliatieve relevant zijn. Bovendien orthotopische modellenzijn zeer waardevol voor het onderzoeken alvleesklier tumor biologie en evalueren nieuwe therapeutische strategieën in de in vivo omgeving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Health en Medical Research Council, Australië (1008865), de Australische Research Council (LE110100125), het National Cancer Institute (CA138687-01), Erica Sloan wordt ondersteund door een Early Career Fellowship van de National Breast Cancer stichting, Australië. Corina Kim-Fuchs wordt ondersteund door een beurs van de Zwitserse Liga tegen Kanker en een HDR-beurs van Monash Instituut voor Farmaceutische Wetenschappen. Eliane Angst wordt ondersteund door een subsidie van de Bern Liga tegen Kanker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean Bench coat | |||
| Heating pad | Set to 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissecting scissors | |||
| Iris forceps (serrated) | |||
| Needle holder | |||
| 27 G 0.3 ml insulin syringe | Terumo | T35525M2913 |
References
- American Cancer Society. Facts and Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Hariharan, D., Saied, A., Kocher, H. M. Analysis of mortality rates for pancreatic cancer across the world. HPB (Oxford). 10, 58-62 (2008).
- Li, D., Xie, K., Wolff, R., Abbruzzese, J. L. Pancreatic cancer. Lancet. 363, 1049-1057 (2004).
- Oettle, H., et al. Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observation in patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer: a randomized controlled trial. JAMA. 297, 267-277 (2007).
- Andersson, R., et al. Gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer: molecular mechanisms and potential solutions. Scand. J. Gastroenterol. 44, 782-786 (2009).
- Angst, E., et al. Bioluminescence imaging of angiogenesis in a murine orthotopic pancreatic cancer model. Mol. Imaging Biol. 12, 570-575 (2010).
- Angst, E., et al. N-myc downstream regulated gene-1 expression correlates with reduced pancreatic cancer growth and increased apoptosis in vitro and in vivo. Surgery. 149, 614-624 (2011).
- Hotz, H. G., et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer. Pancreas. 26, 89-98 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the Panc02 and 6606PDA cell lines. Eur. Surg. Res. 47, 98-107 (2011).
- Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell. 4, 437-450 (2003).
- Sloan, E. K., et al. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Res. 70, 7042-7052 (2010).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Morizono, K., et al. Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection. Nat. Med. 11, 346-352 (2005).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. J. Vis. Exp. (56), e3175 (2011).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. J. Vis. Exp. (52), e2775 (2011).
- Burton, J. B., et al. Adenovirus-mediated gene expression imaging to directly detect sentinel lymph node metastasis of prostate cancer. Nat Med. 14, 882-888 (2008).
- Vezeridis, M. P., Doremus, C. M., Tibbetts, L. M., Tzanakakis, G., Jackson, B. T. Invasion and metastasis following orthotopic transplantation of human pancreatic cancer in the nude mouse. J. Surg. Oncol. 40, 261-265 (1989).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5645-5649 (1992).
- Reyes, G., et al. Orthotopic xenografts of human pancreatic carcinomas acquire genetic aberrations during dissemination in nude mice. Cancer Res. 56, 5713-5719 (1996).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Furukawa, T., Kubota, T., Watanabe, M., Kitajima, M., Hoffman, R. M. A novel "patient-like" treatment model of human pancreatic cancer constructed using orthotopic transplantation of histologically intact human tumor tissue in nude mice. Cancer Res. 53, 3070-3072 (1993).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Brembeck, F. H., et al. The mutant K-ras oncogene causes pancreatic periductal lymphocytic infiltration and gastric mucous neck cell hyperplasia in transgenic mice. Cancer Res. 63, 2005-2009 (2003).
