Summary
अग्नाशय के कैंसर के जीव विज्ञान की समझ में सुधार गंभीर रूप से अग्नाशय के कैंसर के इलाज के लिए बेहतर उपचार के विकल्प के विकास को सक्षम करने की जरूरत है. इस जरूरत को संबोधित करने के लिए, हम प्रयोग कैंसर प्रगति की गैर इनवेसिव निगरानी परमिट कि अग्नाशय के कैंसर की एक orthotopic मॉडल का प्रदर्शन
Abstract
Introduction
अग्नाशय के कैंसर 4-6% की एक 5 साल की जीवित रहने की दर के साथ, कैंसर से संबंधित मौत का चौथा प्रमुख कारण है. रोगियों के 1,2 केवल 15% सर्जरी के लिए पात्र होने के लिए रोग में काफी पहले का निदान, और ट्यूमर पुनरावृत्ति कर रहे हैं > में उन रोगियों का 80%. 3,4 Gemcitabine अग्नाशय adenocarcinomas के उपचार के लिए प्रयोग किया जाता है, तथापि, chemoresistance आम है और अक्सर दवा समग्र अस्तित्व पर कम असर पड़ता है. अग्नाशय के कैंसर के इलाज के लिए 5 नई औषधीय रणनीतियों समीक्षकों की जरूरत है. उनके विकास चिकित्सकीय हस्तक्षेप के प्रति संवेदनशील हो सकता है कि रोग प्रगति के महत्वपूर्ण कदम की काफी सुधार समझ पर निर्भर करता है.
अग्नाशय के कैंसर के Orthotopic के मॉडल अग्नाशय के कैंसर के जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए उन्हें आदर्श उपकरण बनाने, मानव रोग के प्रमुख पहलुओं का अनुकरण. अग्नाशय के कैंसर कोशिका व्यवहार के इन विट्रो में सेल आधारित assays के विपरीत एक में 6-9अग्नाशय के कैंसर के vivo मॉडल में घ चमड़े के नीचे, orthotopic मॉडल अग्नाशय microenvironment के साथ ट्यूमर सेल बातचीत की जांच की अनुमति. रोग प्रगति के कैनेटीक्स orthotopic मॉडल में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और उन्हें अच्छी तरह से उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के पूर्व नैदानिक परीक्षण के लिए अनुकूल बनाता है जो एक छोटे समय सीमा (सप्ताह), से अधिक होते हैं. इस रोग शुरू होने के एक लंबे समय तक और अधिक परिवर्तनशील समय सीमा (महीने 1 वर्ष के लिए). 10 अधिक आक्रामक सेल लाइनों के साथ प्रयोग किया जाता है पर होता है जहां ट्रांसजेनिक मॉडल के विपरीत है, अग्नाशय के कैंसर के orthotopic मॉडल में देखा उन के समान सहज मेटास्टेसिस के पैटर्न है रोगियों. ऐसे जुगनू luciferase रूप bioluminescent रिपोर्टर जीन की 8 अभिव्यक्ति ट्यूमर के विकास के अनुदैर्ध्य निगरानी, मेटास्टेटिक प्रसार, पुनरावृत्ति और चिकित्सा विज्ञान के जवाब की सुविधा. 6,11
यहाँ हम Matr इस्तेमाल करता है कि अग्नाशय के कैंसर की एक orthotopic मॉडल का वर्णनट्यूमर प्रगति की गैर इनवेसिव निगरानी के लिए स्थानीय सेल वितरण और vivo bioluminescence इमेजिंग में लिए Igel. अग्नाशय के कैंसर के इस orthotopic मॉडल रोग प्रगति और syngenic या xenograft मॉडल में उपचारात्मक उपायों के जवाब की गैर इनवेसिव विश्लेषण की अनुमति देता है.
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Protocol
प्रदर्शन किया जा रहा प्रोटोकॉल लेखक की संस्था के जानवरों की देखभाल और उपयोग समिति के मार्गदर्शन और अनुमोदन के तहत किया जाता है. सभी प्रयोगों सभी प्रासंगिक दिशा निर्देशों, नियमों और नियामक एजेंसियों के साथ अनुपालन में क्रियान्वित कर रहे हैं.
1. अग्नाशय के कैंसर सेल लाइन्स transducing
- पहले से वर्णित के रूप में transduce अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं luciferase व्यक्त करने के लिए. 12,13 Panc-1 और Capan-1 अग्नाशय के कैंसर कोशिका लाइनों जुगनू luciferase साथ transduced यहां इस्तेमाल किया जाता है.
नोट: Renilla luciferase या बैक्टीरियल luciferase भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
2. अग्नाशय के कैंसर सेल तैयार
- संस्कृति 70% मिला हुआ जब तक अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं transduced.
- अग्नाशय कोशिकाओं लिफ्ट और व्यवहार्यता 90% से अधिक है, यह सुनिश्चित करें.
- ठंडा Matrigel के एक 3:2 मिश्रण में 2 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल Resuspend: फास्फेट साल बफरine (पीबीएस).
- पहले अग्न्याशय में इंजेक्शन के लिए बर्फ पर Matrigel सेल निलंबन रखें.
नोट: Matrigel के तेजी solidification सुनिश्चित करने के लिए, सेल गोली की मात्रा के लिए खाते में पीबीएस मात्रा कम हो. पहले इंजेक्शन के लिए ठोस बनना रोकने के लिए हर समय ठंडा उपकरणों और सीरिंज का उपयोग कर Matrigel संभाल लेना. सुझाव सेल नंबर एक गाइड है और प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए.
3. माउस तैयारी
- 2-3 isoflurane% साँस का उपयोग कर माउस anesthetize. एक कोमल पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए पेडल पलटा की कमी से संज्ञाहरण की गहराई का निर्धारण करते हैं.
- सुखाना को रोकने के लिए आंखों को चिकनाई लागू करें.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग पैड पर अपनी पीठ पर माउस स्थिति और धीरे पेट के बाईं ओर बढ़ाने के लिए माउस बारी.
- एक 10% povidone आयोडीन समाधान के साथ पेट की तैयारी.
नोट: INJECTABले संज्ञाहरण साँस संज्ञाहरण के बजाय प्रयोग किया जा सकता है. पूर्व ऑपरेटिव उपवास आवश्यक नहीं है.
4. उदर - भित्ति का कर्तन
- बाँझ सर्जिकल उपकरणों का उपयोग लगभग 1 सेमी midline से पार्श्व छोड़ा त्वचा में एक 1.5 सेमी चीरा बनाते हैं.
- अंतर्निहित पेट की मांसपेशियों में एक 1.5 सेमी चीरा.
- संदंश का उपयोग तिल्ली जानें और धीरे उदर गुहा से तिल्ली हटा दें. अंतर्निहित अग्न्याशय का पर्दाफाश करने के लिए एक बाँझ कपास कली के साथ तिल्ली सुरक्षित.
- तिल्ली से सटे अग्न्याशय की पूंछ का पता लगाएँ.
- एक 29 जी 0.3 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग, अग्न्याशय में Matrigel सेल निलंबन के 20 μl इंजेक्षन.
- Matrigel जम गया है जब तक इंजेक्शन के बाद, 30-60 सेकंड के लिए अग्न्याशय में सिरिंज पकड़. यह महत्वपूर्ण कदम सेल रिसाव को कम करता है.
- कोई रिसाव हुआ सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन के स्थल का निरीक्षण किया.
- उदर गुहा को प्लीहा और अग्न्याशय लौटें.
नोट: पतली हो सकता है जो अग्न्याशय के पृष्ठीय पक्ष puncturing से बचने के लिए ध्यान रखना.
5. पेट की दीवार बंद
- एक निरंतर सिलाई का उपयोग कर एक दौर सुई के साथ एक absorbable लट 4-0 सीवन के साथ माउस के पेट की मांसलता बंद करें.
- एक निरंतर सिलाई का उपयोग कर एक काटने सुई के साथ एक गैर absorbable monofilament 6-0 सीवन के साथ बाहरी त्वचा को बंद करें.
- साँस संवेदनाहारी और subcutaneously इंजेक्शन 0.05-0.1 मिलीग्राम / किलो buprenorphine से माउस निकालें.
- माउस भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग पैड पर रखा अपने पिंजरे में ठीक करने के लिए अनुमति दें. चूहों ऐसे hunching या कम गतिशीलता के रूप में दर्द के लक्षण प्रदर्शित करते हैं, buprenorphine एक 36 घंटे की अवधि में हर 12 घंटे दी जा सकती है.
- घाव भरने (7-10 दिन) के बाद, माउस anesthetize और बाहरी टांके हटा दें.
6. अग्नाशय CANC की bioluminescent ट्रैकिंगएर प्रगति
- Isoflurane साँस का उपयोग कर माउस anesthetize.
- पूंछ नस के माध्यम से 150 मिलीग्राम / किग्रा डी luciferin इंजेक्षन.
- Bioluminescent इमेजिंग प्रणाली में माउस प्लेस और पहले से वर्णित के रूप में सफेद रोशनी और bioluminescence छवियों पर कब्जा. 14,15
- साँस संवेदनाहारी से माउस निकालें और इसे अपने घर पिंजरे में ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं.
नोट: Bioluminescent इमेजिंग गैर इनवेसिव है और ट्यूमर के विकास कैनेटीक्स जांच करने के लिए समय समय पर आयोजित किया जा सकता है. अग्नाशय पूंछ में छवि ट्यूमर के लिए यह अपनी बाईं ओर माउस डाल करने के लिए महत्वपूर्ण है, कैमरे की दिशा में ट्यूमर अंक हैं. आवृत्ति पहले FOV 12.5 binning 4 के साथ रहने इमेजिंग 4.3.1 सॉफ्टवेयर चल रहे एक Lumina द्वितीय इमेजिंग प्रणाली (Perkin-एल्मर, पूर्व कैलिपर लाइफ साइंसेज), का उपयोग कर प्रयोगात्मक endpoint के लिए प्रति सप्ताह में तीन गुना तक वृद्धि हुई है साथ हम, प्रति सप्ताह एक बार imaged एफ स्टॉप 1, जोखिम 1-60 सेकंड (उच्चतम विस्तार के द्वारा निर्धारितपिक्सेल संतृप्ति बिना osure).
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Representative Results
इस विधि संज्ञाहरण की प्रेरण, laparotomy, Matrigel और पेट बंद (चित्रा 1 ए) में कैंसर कोशिकाओं के इंजेक्शन सहित शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का उपयोग कर, अग्नाशय के कैंसर की एक orthotopic मॉडल का वर्णन करता है. इंजेक्शन कोशिकाओं अग्न्याशय की सतह में एक बुलबुला (चित्रा 1 बी) के रूप में. अग्नाशय के कैंसर की प्रगति गैर invasively कैंसर सेल प्रसार और प्रसार (चित्रा 2) को ट्रैक करने के लिए vivo bioluminescence इमेजिंग में उपयोग पर नजर रखी जा सकती है. यकृत मेटास्टेसिस शल्य लकीर दौरान जिगर में bioluminescence के अवलोकन से संकेत (चित्रा 2) और ऊतक विज्ञान (चित्रा 4 बी) द्वारा पूर्व vivo पुष्टि की गई. प्राथमिक ट्यूमर आरोपण के बाद 6 सप्ताह में अग्नाशय पूंछ और तिल्ली के साथ resected गया. इस orthotopic इंजेक्शन मॉडल में ट्यूमर के विकास की गतिशीलता प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और बारीकी से देहात के orthotopic प्रत्यारोपण मॉडल के कैनेटीक्स सदृश ncreatic कैंसर (चित्रा 3). अग्न्याशय में ट्यूमर के विकास को स्थानीय रूप से आक्रामक है और जिगर (चित्रा 4) सहित अंगों को metastasizes.
चित्रा 1. अग्नाशय के कैंसर की प्रगति के Orthotopic माउस मॉडल. ए) मैं. anesthetized माउस टेप का उपयोग जगह में तय हो गई है और पेट कीटाणुरहित है. द्वितीय. एक बाँझ कपास कली पर अनुदैर्ध्य laparotomy के बाद प्लीहा और अग्नाशय पूंछ धीरे exteriorized कर रहे हैं और जगह में आयोजित किया. स. Matrigel एम्बेडेड अग्नाशय के ट्यूमर कोशिकाओं अग्न्याशय पूंछ में इंजेक्ट किया जाता है. iv. पेट दो परतों में बंद कर दिया है. बी) बढ़ाया छवि exteriorized प्लीहा और अग्न्याशय दिखा. इंजेक्शन कोशिकाओं एक बुलबुला (नोक) के रूप में. ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. Orthotopic अग्नाशय के ट्यूमर की bioluminescent इमेजिंग (ए) के दस दिनों के इंजेक्शन के बाद, (बी) के 31 दिनों के इंजेक्शन के बाद, और (सी) ट्यूमर लकीर पांच दिनों के बाद.
चित्रा 3. Panc-1 और Capan-1 सेल लाइनों के vivo प्राथमिक ट्यूमर के विकास में bioluminescence इमेजिंग (एन = 4) द्वारा समय (दिनों इंजेक्शन के बाद) पर नजर रखी थी. ट्यूमर के विकास के कैनेटीक्स Matrigel एम्बेडेड अग्नाशय के ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद अग्नाशय के ट्यूमर के टुकड़े के प्रत्यारोपण का उपयोग कर orthotopic मॉडल के समान हैं.
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4 चित्रा. Hematoxylin और (ए) Panc-1 प्राथमिक अग्नाशय के ट्यूमर, और Panc-1 प्राथमिक अग्नाशय के ट्यूमर से (बी) यकृत मेटास्टेसिस के eosin दाग वर्गों. आसपास के अंग में अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं के * स्थानीय आक्रमण.
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Discussion
यहाँ हम अग्नाशय के ट्यूमर के विकास और प्रगति के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन के लिए एक orthotopic मॉडल का वर्णन है. प्राथमिक ट्यूमर के विकास कैनेटीक्स प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं (चित्रा 3) और उपन्यास विरोधी अग्नाशय के कैंसर चिकित्सा के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए जैसे luciferase टैग कोशिकाओं के bioluminescence इमेजिंग, का उपयोग करते हुए गैर invasively नजर रखी जा सकती है. मानव रोग के अनुरूप, मॉडल अग्नाशय microenvironment के साथ ट्यूमर सेल बातचीत की जांच की अनुमति देता है जो स्थानीय अग्नाशय आक्रमण (चित्रा -4 ए) से पता चलता है. luciferase टैग सेल लाइनों का उपयोग मेटास्टेटिक प्रसार की आवृत्ति, स्थान और कैनेटीक्स का विश्लेषण की अनुमति देता है. वे नेत्रहीन स्पष्ट हो और मेटास्टेसिस के ऊतक स्थानीयकरण पूर्व vivo इमेजिंग और ऊतक विज्ञान से इसकी पुष्टि की जा सकती है इससे पहले luciferase टैग सेल लाइनों का प्रयोग मेटास्टेसिस का पता लगाने की सुविधा है. नैदानिक स्थिति के रूप में, मॉडल ऑर्ग को मेटास्टेसिस से पता चलता हैmesenteric लिम्फ नोड्स, जिगर, जठरांत्र संबंधी मार्ग और peritoneal गुहा (चित्रा 4). 8 bioluminescence इमेजिंग सहित ans भी सफल लकीर, और घटनाओं और प्राथमिक ट्यूमर पुनरावृत्ति के कैनेटीक्स (चित्रा -2) निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 16
सावधान तैयारी और अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं की हैंडलिंग मॉडल के reproducibility के लिए आवश्यक है. पीबीएस को Matrigel के अनुपात इंजेक्शन के बाद सेल गोली की तेजी solidification के लिए अनुकूलित किया गया है. pelleted कोशिकाओं (10 7 ट्यूमर कोशिकाओं के लिए लगभग 35 μl) की मात्रा Matrigel के एक अंतिम 03:02 अनुपात के लिए पीबीएस की मात्रा से घटा दिया जाना चाहिए: कोशिकाओं + पीबीएस. इंजेक्शन के दौरान सेल रिसाव Matrigel (चित्रा 1) जम गया है जब तक 30-60 सेकंड के लिए बगल में सुई बनाए रखने से रोका है. रिसाव होती है तो Matrigel रंग का है के रूप में यह आसानी से पता लगाया जाता है और उन चूहों च बाहर रखा जा सकतारॉम आगे का विश्लेषण करती है. ट्यूमर सेल रिसाव की रोकथाम मेटास्टेसिस बल्कि इंजेक्शन तकनीक की एक विरूपण साक्ष्य के रूप में की तुलना में ट्यूमर सेल प्रसार से उत्पन्न होती है कि यह सुनिश्चित करता है.
ट्यूमर के विकास के कैनेटीक्स सेल नंबर इंजेक्शन और प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए से प्रभावित हो जाएगा. हम 4 एक्स 5 10 Panc-1 या Capan-1 कोशिकाओं (चित्रा 3) के इंजेक्शन के बाद प्रतिलिपि प्रस्तुत करने ट्यूमर के विकास पैटर्न पाया. मेटास्टेसिस के bioluminescent का पता लगाने के लिए सीमा का निर्माण प्रमोटर ताकत और कोडोन अनुकूलित luciferase के उपयोग सहित इस्तेमाल अभिव्यक्ति की विशेषताओं से प्रभावित हो जाएगा. यहाँ वर्णित xenograft मॉडल के अलावा, तकनीक भी एक असुरक्षित सेटिंग में अग्नाशय के प्रगति की जांच के लिए syngenic अग्नाशय सेल लाइनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. इसी तरह के ट्यूमर गतिशीलता नर या मादा चूहों (नहीं दिखाया डेटा) में मनाया गया.
विधि वर्णित वहफिर से अग्नाशय के कैंसर की एक orthotopic प्रत्यारोपण मॉडल के लिए संशोधित किया गया है. उस मॉडल में, ट्यूमर तो एक 1 3 मिमी टुकड़ा एक प्राप्तकर्ता माउस के अग्न्याशय पूंछ में एक छोटी सी जेब में प्रत्यारोपित किया जाता है, दाता चूहों में subcutaneously बड़े हो रहे हैं. 6-8,17 प्राथमिक ट्यूमर के विकास को दाता ट्यूमर का उपयोग कर bioluminescence इमेजिंग उपयोग पर नजर रखी जा सकती है luciferase टैग ट्यूमर कोशिकाओं से व्युत्पन्न. यहाँ वर्णित orthotopic मॉडल के विपरीत, प्रत्यारोपण मॉडल अतिरिक्त समय (1 माह) और दाता ट्यूमर की पीढ़ी के लिए अतिरिक्त चूहों की आवश्यकता होती है. प्रत्यारोपण के मॉडल का उपयोग कर परिणाम प्रत्यारोपित ट्यूमर टुकड़े की विषम रचना से प्रभावित हो सकता है. हम Matrigel एम्बेडेड कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद कैनेटीक्स प्रतिरोपित मॉडल के समान हैं कि यहाँ दिखाया. ट्रांसप्लांटेशन मॉडल नैदानिक मरीज के नमूनों का अध्ययन करने और विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. 18-21
यहाँ वर्णित orthotopic मॉडल ट्रांसजेनिक मीटर पूरकपूर्व आक्रामक और आक्रामक अग्नाशय के कैंसर के odels. 10,22,23 ट्रांसजेनिक मॉडल ओंकोजीन म्यूटेशनों सहित मानव अग्नाशय के कैंसर के प्रमुख पहलुओं पुनरावृत्ति लेकिन रोग शुरुआत (> 1 वर्ष के लिए 7 सप्ताह) में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता दिखा. 10,23 हाल ट्रांसजेनिक मॉडल करना luciferase व्यक्त नहीं और इसलिए रोग प्रगति के vivo bioluminescence इमेजिंग में के लिए उपयुक्त नहीं हैं. इसके विपरीत, अग्नाशय के कैंसर के orthotopic मॉडल ट्यूमर प्रगति की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कैनेटीक्स दिखाने और उन्हें अच्छी तरह से पूर्व नैदानिक चिकित्सकीय अध्ययनों के लिए अनुकूल है, जिससे गैर इनवेसिव निगरानी की अनुमति.
नई चिकित्सकीय दृष्टिकोण गंभीर रूप से अग्नाशय के कैंसर के लिए असाधारण कम जीवित रहने की दरों निपटने की जरूरत है. मेटास्टेटिक और आवर्तक रोग के दृश्य की अनुमति से, अग्नाशय के कैंसर के orthotopic मॉडल सबसे वर्तमान उपचार उपशामक हैं जहां नैदानिक सेटिंग, के लिए प्रासंगिक हैं यहाँ वर्णित है. इसके अलावा, orthotopic मॉडल मेंअग्नाशय के ट्यूमर जीव विज्ञान की जांच कर रही है और इन विवो सेटिंग में में उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों का मूल्यांकन करने के लिए अत्यधिक मूल्यवान हैं.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद, ऑस्ट्रेलिया (1008865), ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (LE110100125), राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (CA138687-01), एरिका स्लोअन राष्ट्रीय स्तन कैंसर से एक जल्दी कैरियर फैलोशिप द्वारा समर्थित है के द्वारा समर्थित किया गया फाउंडेशन, ऑस्ट्रेलिया. कोरिना किम फुच्स स्विस कैंसर लीग और औषधि विज्ञान के मोनाश इंस्टीट्यूट से एक hdr छात्रवृत्ति से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है. Eliane आक्रोश बर्न कैंसर लीग से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean Bench coat | |||
| Heating pad | Set to 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissecting scissors | |||
| Iris forceps (serrated) | |||
| Needle holder | |||
| 27 G 0.3 ml insulin syringe | Terumo | T35525M2913 |
References
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