Summary
Migliore comprensione della biologia del cancro pancreatico è criticamente necessaria per consentire lo sviluppo di migliori opzioni terapeutiche per il trattamento di cancro al pancreas. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo dimostrato un modello ortotopico di cancro al pancreas, che consente il monitoraggio non invasivo di progressione del cancro usando
Abstract
Introduction
Il tumore al pancreas è la quarta causa di morte per cancro, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni del 4-6%. 1,2 Solo il 15% dei pazienti sono diagnosticati abbastanza presto nel corso della malattia per poter beneficiare di un intervento chirurgico, e tumori ricorrono in> 80% dei pazienti. 3,4 La gemcitabina è usata per il trattamento di adenocarcinomi pancreatici, tuttavia, chemioresistenza è comune e spesso la droga ha poco impatto sulla sopravvivenza globale. 5 nuove strategie farmacologiche per curare il cancro al pancreas sono estremamente necessari. Il loro sviluppo dipende notevolmente migliorato la comprensione dei passaggi chiave della progressione di malattia che possono essere sensibili a un intervento terapeutico.
Modelli ortotopico di cancro al pancreas emulare gli aspetti chiave della malattia umana, che li rende strumenti ideali per lo studio della biologia del cancro al pancreas. 6-9 In contrasto in vitro basati su cellule di pancreas comportamento delle cellule di cancro di und sottocutaneo in modelli in vivo di cancro al pancreas, modelli ortotopici consentire indagini su interazioni delle cellule tumorali con il microambiente del pancreas. La cinetica di progressione della malattia sono altamente riproducibili in modelli ortotopici e si verificano nel corso di un breve lasso di tempo (settimane), che li rende adatti per test pre-clinici di nuove terapie. Questo è in contrasto con i modelli transgenici in cui l'esordio della malattia si verifica nel corso di un telaio più lungo e variabile tempo (mesi a 1 anno). Se utilizzato con 10 linee di cellule più aggressive, modelli ortotopico di cancro del pancreas hanno modelli di metastasi spontanee simili a quelle viste in pazienti. 8 Espressione di geni reporter bioluminescenti come la lucciola luciferasi facilita il monitoraggio longitudinale della crescita tumorale, la diffusione metastatica, la recidiva e la risposta alle terapie. 6,11
Qui si descrive un modello ortotopico di cancro al pancreas che utilizza Matrigel per la consegna cella localizzata e di imaging bioluminescenza in vivo per il monitoraggio non invasivo della progressione tumorale. Questo modello ortotopico di cancro al pancreas consente analisi non invasive di progressione della malattia e la risposta agli interventi terapeutici in modelli singenici o xenotrapianto.
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Protocol
Il protocollo viene mostrato è eseguita sotto la guida e l'approvazione di cura degli animali dell'istituzione dell'autore e comitato utilizzo. Tutti gli esperimenti sono eseguiti in conformità a tutte le direttive, i regolamenti e le agenzie di regolamentazione.
1. Trasduzione del pancreas Cancer Cell Lines
- Cellule tumorali pancreatiche transduce di esprimere luciferasi come precedentemente descritto. 12,13 Panc-1 e Capan-1 linee cellulari tumorali pancreatiche trasdotte con lucciola luciferasi sono usati qui.
Nota: Renilla luciferasi o luciferasi batterica possono anche essere utilizzati.
2. Pancreas Cancer Cell Preparazione
- Cultura trasdotte cellule del tumore pancreatico fino al 70% confluenti.
- Sollevare le cellule pancreatiche e garantire la redditività è superiore al 90%.
- Risospendere in 2 x 10 7 cellule / ml in una miscela 03:02 di Matrigel refrigerate: tampone fosfato saline (PBS).
- Mantenere la sospensione Matrigel cellule in ghiaccio prima di iniezione nel pancreas.
Note: Per assicurare la rapida solidificazione di Matrigel, ridurre il volume di PBS considerazione per il volume del pellet. Maneggiare Matrigel con strumenti di ghiaccio freddo e siringhe in ogni momento per evitare la solidificazione prima dell'iniezione. Il numero di cellule suggerito è una guida e dovrebbe essere determinata empiricamente per ciascuna linea cellulare.
3. Topo Preparazione
- Anestetizzare il mouse utilizzando inalato 2-3% isoflurano. Determinare la profondità dell'anestesia dalla mancanza di pedale riflesso di un dito del piede pizzico delicato.
- Applicare lubrificante per gli occhi per evitare l'essiccamento.
- Posizionare il mouse sul dorso su una 37 ° C rilievo di riscaldamento e ruotare leggermente il mouse per aumentare il lato sinistro dell'addome.
- Preparare l'addome con una soluzione di iodio povidone al 10%.
Note: InjectabLe anestesia può essere usato al posto di anestesia inalatoria. Digiuno pre-operatorio non è necessario.
4. Laparotomia
- Utilizzando strumenti chirurgici sterili fare una incisione 1,5 cm in pelle di circa 1 cm a sinistra laterale dalla linea mediana.
- Fare un cm incisione nel muscolo addominale sottostante 1.5.
- Individuare la milza usando la pinza e rimuovere delicatamente la milza dalla cavità addominale. Fissare la milza lungo un batuffolo di cotone sterile per esporre il pancreas sottostante.
- Individuare la coda del pancreas adiacente alla milza.
- Utilizzando un 29 G 0,3 ml siringa da insulina, iniettare 20 microlitri della sospensione Matrigel-cellula nel pancreas.
- Dopo l'iniezione, tenere la siringa nel pancreas per 30-60 secondi fino a quando il Matrigel è solidificato. Questo importante passo minimizza perdita cellulare.
- Ispezionare il sito di iniezione per garantire nessuna perdita si è verificata.
- Restituire la milza e pancreas alla cavità addominale.
Nota: Fare attenzione a non pungere la parte dorsale del pancreas che può essere sottile.
5. Addominale Chiusura muro
- Chiudere la muscolatura addominale del mouse con una sutura assorbibile intrecciata 4-0 con un ago rotondo con un punto continuo.
- Chiudere la pelle esterna con un monofilamento non assorbibile 6-0 sutura con ago di taglio con un punto continuo.
- Rimuovere il mouse dalla inalazione anestetico e iniettato 0,05-0,1 mg / kg per via sottocutanea buprenorfina.
- Lasciare il mouse per recuperare nella sua gabbia posta su un 37 ° C rilievo di riscaldamento con libero accesso a cibo e acqua. Se i topi mostrano segni di dolore, come incurvando o mobilità ridotta, la buprenorfina può essere somministrata ogni 12 ore per un periodo di 36 ore.
- Dopo la guarigione delle ferite (7-10 giorni), anestetizzare il mouse e rimuovere i punti di sutura esterni.
6. Monitoraggio bioluminescente di pancreas Cancer Progressione
- Anestetizzare il mouse utilizzando inalato isoflurano.
- Iniettare 150 mg / kg di D-luciferina via coda vena.
- Posizionare il mouse nel sistema di imaging bioluminescente e catturare immagini a luce bianca e bioluminescenza come descritto in precedenza. 14,15
- Rimuovere il mouse dalla inalazione anestetico e permettono di recuperare nella sua gabbia casa.
Nota: Bioluminescenti imaging è non invasiva e può essere condotta periodicamente per indagare cinetica di crescita del tumore. Per tumore immagine nella coda pancreatica è importante mettere il mouse sul lato sinistro, quindi i punti tumorali verso la telecamera. Noi imaged una volta a settimana con la frequenza aumenta fino a tre volte alla settimana prima del punto finale sperimentale utilizzando un sistema di imaging Lumina II (Perkin-Elmer, ex Caliper Life Sciences) in esecuzione Living software 4.3.1 Imaging con binning 4, FOV 12,5, F-stop 1, esposizione 1 - 60 sec (determinata dalla più alta exposure senza pixel di saturazione).
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Representative Results
Il metodo descrive un modello ortotopico di cancro al pancreas con intervento chirurgico, compresa l'induzione dell'anestesia, laparotomia, l'iniezione di cellule tumorali in chiusura Matrigel e addominale (Figura 1A). Le cellule iniettate formano una bolla nella superficie del pancreas (Figura 1B). La progressione del cancro del pancreas può essere non invasivo monitorati utilizzando l'imaging bioluminescenza in vivo per monitorare la proliferazione delle cellule del cancro e la diffusione (Figura 2). Metastasi epatiche fu indicato dall'osservazione della bioluminescenza nel fegato durante la resezione chirurgica (Figura 2) e confermato ex vivo da istologia (Figura 4B). Tumori primari sono stati resecati con la coda del pancreas e milza a 6 settimane dopo l'impianto. Dinamiche di crescita del tumore in questo modello ad iniezione ortotopico sono riproducibili e sono molto simili la cinetica di modelli di trapianto ortotopico di pa cancro ncreatic (Figura 3). Crescita del tumore nel pancreas è localmente invasivo e metastatizza a organi compresi fegato (Figura 4).
Figura 1. Un modello di topo ortotopico di progressione del cancro del pancreas. A) i. Il topo anestetizzato viene fissato in posizione con nastro adesivo e l'addome è disinfettata. ii. Dopo laparotomia longitudinale della milza e la coda del pancreas vengono delicatamente esteriorizzato e tenuti in posizione su un batuffolo di cotone sterile. iii. Cellule tumorali pancreatiche Matrigel incorporati vengono iniettati nella coda del pancreas. iv. L'addome è chiuso in due strati. Immagine B) ingrandita che mostra la milza esteriorizzato e il pancreas. Le cellule iniettate formano una bolla (punta di freccia). ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 2. L'imaging bioluminescente di tumore pancreatico ortotopico (A) dieci giorni dopo l'iniezione, (B), 31 giorni dopo l'iniezione, e (C), cinque giorni dopo la resezione del tumore.
Figura 3. In vivo crescita tumorale primario di Capan-1 linee cellulari Panc-1 ed è stata monitorata nel tempo (giorni dopo l'iniezione) da imaging bioluminescenza (n = 4). La cinetica di crescita del tumore dopo l'iniezione di cellule tumorali pancreatiche Matrigel incorporati sono simili ai modelli di trapianto ortotopico utilizzando pezzi tumorali pancreatiche.
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Figura 4. Ematossilina e eosina sezioni macchiati di (A) del tumore pancreatico Panc-1 primario, e (B), metastasi epatiche da Panc-1 tumore pancreatico primario. * Invasione locale delle cellule tumorali pancreatiche nell'organo circostante.
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Discussion
Qui si descrive un modello ortotopico per la valutazione longitudinale di sviluppo del tumore del pancreas e la progressione. Cinetica di crescita del tumore primario sono riproducibili (Figura 3) e possono essere non invasivo monitorato utilizzando bioluminescenza delle cellule luciferasi-tag, ad esempio, per le analisi di risposta del tumore alle nuove terapie anti-cancro del pancreas. Coerentemente con la malattia umana, il modello mostra invasione del pancreas locale (Figura 4A), che permette di indagine delle interazioni delle cellule tumorali con il microambiente del pancreas. L'utilizzo di linee cellulari luciferasi con tag consente analisi di frequenza, la posizione e la cinetica di diffusione metastatica. L'uso di linee cellulari luciferasi con tag facilita la rilevazione di metastasi prima di diventare visivamente evidenti e localizzazione dei tessuti di metastasi possono essere confermate con ex vivo imaging e l'istologia. Come nella situazione clinica, il modello mostra metastasi a organs compresi linfonodi mesenterici, fegato, tratto gastrointestinale e la cavità peritoneale (Figura 4). 8 di imaging bioluminescenza possono anche essere utilizzati per determinare la resezione di successo, e l'incidenza e la cinetica di recidiva del tumore primario (Figura 2C) 16.
Un'attenta preparazione e la manipolazione di cellule tumorali del pancreas è essenziale per la riproducibilità del modello. Il rapporto di Matrigel di PBS è stato ottimizzato per una rapida solidificazione del pellet dopo l'iniezione. Il volume delle cellule pellet (circa 35 microlitri per 10 7 cellule tumorali) deve essere sottratto dal volume di PBS per un rapporto 3:2 finale di Matrigel: cellule + PBS. Durante l'iniezione, perdite cella viene prevenuta mantenendo l'ago in situ per 30-60 secondi finché la Matrigel è solidificato (Figura 1). Se la perdita si verifica è facilmente rilevato come Matrigel è colorato e quei topi può essere escluso from ulteriori analisi. Prevenire la dispersione delle cellule tumorali assicura che le metastasi si verifica da disseminazione delle cellule tumorali e non come un artefatto della tecnica di iniezione.
La cinetica di sviluppo tumorale saranno influenzate dal numero cellulare iniettata e devono essere determinati empiricamente per ciascuna linea cellulare. Abbiamo trovato riproducibili modelli di crescita del tumore dopo l'iniezione di 4 x 10 5 Panc-1 o Capan-1 cellule (Figura 3). La soglia per il rilevamento di metastasi bioluminescente sarà influenzata dalle caratteristiche del costrutto di espressione utilizzato compresa la forza promotore e l'uso di luciferasi codone ottimizzato. Oltre ai modelli di xenotrapianto qui descritti, le tecniche possono essere utilizzate anche con linee cellulari pancreatiche singenici esaminare progressione pancreatica in un ambiente immunocompetente. Dinamiche tumorali simili sono stati osservati nei topi maschi o femmine (dati non riportati).
Il metodo descritto siri è stato modificato per un modello di trapianto ortotopico di cancro al pancreas. In questo modello, i tumori si sviluppano per via sottocutanea in topi donatori, poi un 3 mm 1 pezzo viene trapiantato in una piccola tasca nella coda del pancreas di un topo destinatario. 6-8,17 crescita del tumore primario può essere monitorato usando l'imaging bioluminescenza utilizzando i tumori donatori derivati da cellule tumorali luciferasi-tag. In contrasto con il modello ortotopico descritto qui, i modelli di trapianto richiedono più tempo (fino ad 1 mese) e topi aggiuntivi per la generazione di tumori donatori. Risultati che utilizzano modelli di trapianto possono essere influenzati da composizione eterogenea di pezzi tumorali trapiantate. Abbiamo dimostrato qui che la cinetica dopo l'iniezione di cellule Matrigel-embedded sono simili al modello trapiantato. Modelli di trapianto sono stati utilizzati per studiare e ampliare i campioni clinici. 18-21
I modelli ortotopici qui descritte si completano transgenico modelli di cancro al pancreas pre-invasive e invasive. 10,22,23 modelli transgenici ricapitolano aspetti chiave del cancro al pancreas umano tra cui mutazioni oncogene ma mostrano una significativa variabilità nella insorgenza della malattia (7 settimane per> 1 anno). 10,23 maggior parte dei modelli transgenici fanno non esprimono luciferasi e quindi non sono adatti a bioluminescenza in vivo di progressione della malattia. Al contrario, i modelli ortotopico di cancro pancreatico mostrano cinetiche riproducibili di progressione tumorale e permettono il monitoraggio non invasivo, rendendoli adatti per studi terapeutici pre-clinici.
Nuovi approcci terapeutici sono criticamente necessari per combattere i tassi eccezionalmente bassi di sopravvivenza per il cancro al pancreas. Permettendo la visualizzazione della malattia metastatica e ricorrenti, i modelli ortotopico di cancro al pancreas qui descritte sono rilevanti per l'ambiente clinico, dove la maggior parte delle attuali trattamenti sono palliativi. Inoltre, i modelli ortotopicisono molto preziosi per lo studio della biologia del tumore al pancreas e valutare nuove strategie terapeutiche in in ambiente vivo.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Health and Medical Research Council, Australia (1008865), l'Australian Research Council (LE110100125), il National Cancer Institute (CA138687-01), Erica Sloan è supportato da una carriera Fellowship precoce dal National Breast Cancer Fondazione, in Australia. Corina Kim-Fuchs è sostenuto da una borsa di studio della Lega Tumori svizzera e una borsa di studio HDR da Monash Institute di Scienze Farmaceutiche. Eliane Angst è supportata da una sovvenzione da parte di Berna Cancer League.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean Bench coat | |||
| Heating pad | Set to 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissecting scissors | |||
| Iris forceps (serrated) | |||
| Needle holder | |||
| 27 G 0.3 ml insulin syringe | Terumo | T35525M2913 |
References
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