Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Bioluminescent orthotopic Modell av bukspyttkjertelkreft Progresjon

Published: June 28, 2013 doi: 10.3791/50395

Summary

Bedre forståelse av kreft i bukspyttkjertelen biologi er kritisk nødvendig for å muliggjøre utvikling av bedre behandlingsalternativer for å behandle kreft i bukspyttkjertelen. For å møte dette behovet, viser vi en orthotopic modell av kreft i bukspyttkjertelen som tillater ikke-invasiv monitorering av kreft progresjon ved hjelp

Abstract

Introduction

Kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft-dødsfall, med en 5-års overlevelse på 4-6%. 1,2 Kun 15% av pasientene er diagnostisert tidlig nok i sykdomsforløpet for å være kvalifisert for kirurgi, og svulster gjenoppstå i> 80% av de pasienter. 3,4 Gemcitabin er brukt for behandling av pankreas adenokarsinomer, er imidlertid chemoresistance vanlig og ofte medikamentet har liten innvirkning på total overlevelse. fem nye farmakologiske strategier for å behandle kreft i bukspyttkjertelen er kritisk nødvendig. Deres utvikling er avhengig av betydelig forbedret forståelse av de viktigste trinnene i sykdomsutvikling som kan være følsomme for terapeutisk intervensjon.

Orthotopic modeller av kreft i bukspyttkjertelen etterligne viktige aspekter av menneskelig sykdom, noe som gjør dem ideelle verktøy for å studere biologi for kreft i bukspyttkjertelen. 6-9 I motsetning til in vitro celle-baserte analyser av kreft i bukspyttkjertelen celle atferd end underhudsfett in vivo modeller for kreft i bukspyttkjertelen, orthotopic modeller tillater undersøkelse av tumor celle interaksjoner med bukspyttkjertelen microenvironment. Kinetikken av sykdomsutvikling er svært reproduserbare i orthotopic modeller og skje over et kort tidsrom (uker), som gjør dem godt egnet til pre-klinisk utprøving av nye behandlingsformer. Dette er i motsetning til transgene modeller der sykdomsutbruddet skjer over en lengre og mer variabel tidsramme (måneder til 1 år). 10. Når den brukes med mer aggressive cellelinjer, orthotopic modeller av kreft i bukspyttkjertelen har mønstre av spontan metastasering lik dem man ser i pasienter. 8 Expression of bioluminescent reporter gener som ildflue luciferase forenkler langsgående overvåking av tumorvekst, metastatisk formidling, tilbakefall og respons på legemiddelselskap. 6,11

Her beskriver vi en orthotopic modell av kreft i bukspyttkjertelen som benytter MatrIgel for lokaliserte celle levering og in vivo Bioluminescens bildebehandling for ikke-invasiv monitorering av tumor progresjon. Dette orthotopic modell av kreft i bukspyttkjertelen gjør at ikke-invasive analyser av sykdomsutvikling og respons til terapeutiske intervensjoner i syngenic eller xenograft modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen blir demonstrert utføres under veiledning og godkjenning av forfatterens institusjonens dyr omsorg og bruk komité. Alle eksperimentene er utført i samsvar med alle gjeldende retningslinjer, forskrifter og offentlige myndigheter.

En. Transducing bukspyttkjertelen kreft cellelinjer

  1. Transduce kreft i bukspyttkjertelen celler til å uttrykke luciferase som tidligere beskrevet. 12,13 Panc-1 og Capan-1 bukspyttkjertelkreft cellelinjer transdusert med ildflue luciferase er brukt her.

Merk: Renilla-luciferase eller bakteriell luciferase kan også anvendes.

2. Bukspyttkjertelkreft celleforberedelsen

  1. Kultur transduced kreft i bukspyttkjertelen celler inntil 70% konfluent.
  2. Løft pankreatiske celler og sikre levedyktighet er større enn 90%.
  3. Resuspender på 2 x 10 7 celler / ml i et 3:2-blanding av avkjølt Matrigel: fosfatbufret saline (PBS).
  4. Hold Matrigel-cellesuspensjonen på is før injeksjon inn i bukspyttkjertelen.

Merknader: For å sikre hurtig størkning av Matrigel, reduser volumet PBS å ta hensyn til volumet av den celle-pellet. Håndtak Matrigel hjelp iskalde instrumenter og sprøyter til enhver tid for å unngå størkning før injeksjon. Den foreslåtte celle nummer er en guide og bør bestemmes empirisk for hver cellelinje.

3. Mus Forberedelse

  1. Anesthetize musen med inhalert 2-3% isofluran. Bestem anestesidybden av mangel på pedal refleks til en mild tå klype.
  2. Smøres med øynene for å hindre uttørking.
  3. Plasser musen på ryggen på en 37 ° C oppvarming pad og forsiktig slå musen til å heve venstre side av magen.
  4. Forbered magen med en 10% povidonjodid løsning.

Merknader: Injectable anestesi kan benyttes i stedet for inhalert anestesi. Preoperativ faste er ikke nødvendig.

4. Laparotomi

  1. Ved hjelp av sterile kirurgiske instrumenter lage en 1,5 cm innsnitt i huden omtrent 1 cm venstre lateral fra midtlinjen.
  2. Lag en 1,5 cm snitt i den underliggende abdominal muskler.
  3. Finn milt ved hjelp av pinsett og forsiktig fjerne milten fra bukhulen. Fest milt langs en steril bomullspinne til å avsløre underliggende bukspyttkjertelen.
  4. Lokaliser halen i bukspyttkjertel ved siden av milten.
  5. Ved hjelp av en 29 g 0,3 ml insulin sprøyte, injisere 20 pl av Matrigel-celle-suspensjonen i bukspyttkjertelen.
  6. Etter injeksjon, hold sprøyten i bukspyttkjertelen i 30-60 sek før Matrigel har stivnet. Dette er viktig og reduserer celle lekkasje.
  7. Inspisere injeksjonsstedet for å sikre at ingen lekkasje oppstått.
  8. Returner milt og bukspyttkjertelen til bukhulen.

Merk: Pass på å unngå punktering av dorsal side av bukspyttkjertelen som kan være tynn.

5. Bukveggen Closure

  1. Lukk abdominalmusku av musen med en absorberbare flettet 4-0 sutur med en rund nål ved hjelp av en kontinuerlig sting.
  2. Nær den ytre huden med en ikke-absorberbare monofilament 6-0 sutur med en nål skjæring ved hjelp av en kontinuerlig søm.
  3. Ta musen fra inhalert bedøvelse og injisert 0,05-0,1 mg / kg buprenorfin subkutant.
  4. Tillate musen til å komme seg i buret sitt plassert på en 37 ° C oppvarming pad med fri tilgang til mat og vann. Hvis musene viser tegn på smerte slik som hunching eller redusert mobilitet, kan buprenorfin bli gitt hver 12. time i løpet av en 36 timers periode.
  5. Etter sårtilheling (7-10 dager), anesthetize musen og fjerne eksterne sting.

6. Bioluminescent Tracking av bukspyttkjertelen Canceh Progresjon

  1. Anesthetize musen med inhalert isofluran.
  2. Injiser 150 mg / kg D-luciferin via halevenen.
  3. Plasser musen i bioluminescent imaging system og fange hvitt lys og Bioluminescens bilder som tidligere beskrevet. 14,15
  4. Ta musen fra inhalert bedøvelse og la den komme seg i sitt hjem buret.

Merk: Bioluminescent avbildning er non-invasiv og kan gjennomføres med jevne mellomrom for å undersøke tumorvekst kinetikk. Til image svulst i bukspyttkjertelen halen er det viktig å sette musen på sin venstre side, slik at svulsten peker mot kameraet. Vi fotografert en gang per uke med frekvensen økes opp til tre ganger per uke før den eksperimentelle endepunktet ved hjelp av en Lumina II imaging system (Perkin-Elmer, tidligere Caliper Life Sciences) kjører Bo Imaging 4.3.1 programvare med binning 4, FOV 12,5, F-stop en, eksponering 1-60 sek (bestemmes av det høyest exposure uten pixel metning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metoden beskriver en orthotopic modell av bukspyttkjertelkreft ved hjelp av kirurgiske prosedyrer, inkludert induksjon av anestesi, laparotomi, injeksjon av kreftceller i Matrigel og abdominal lukking (figur 1A). Den injiserte cellene danner en boble i overflaten av bukspyttkjertelen (figur 1B). Bukspyttkjertelkreft progresjon kan være ikke-invasiv overvåket ved hjelp av in vivo Bioluminescens bildebehandling for å spore kreftcelle spredning og formidling (figur 2). Levermetastaser ble indikert ved observasjon av bioluminescens i leveren i løpet av kirurgisk reseksjon (figur 2) og bekreftet ved histologi ex vivo (figur 4B). Primære svulster ble resected med bukspyttkjertelen halen og milt på seks uker etter implantasjon. Tumorvekst dynamikk i dette orthotopic injeksjon modellen er reproduserbare og likne kinetikken av orthotopic transplantasjon modeller av pa ncreatic kreft (figur 3). Tumor vekst i bukspyttkjertelen er lokalt invasive og metastasizes til organer, inkludert lever (figur 4).

Figur 1
Figur 1. En orthotopic mus modell av bukspyttkjertelkreft progresjon. A) jeg. Bedøvet mus er festet på plass med tape og magen er desinfisert. ii. Etter langsgående laparotomi milt og bukspyttkjertelen halen forsiktig exteriorized og holdes på plass på en steril bomullspinne. iii. Matrigel-embedded pankreatisk tumor celler blir injisert inn i bukspyttkjertelen halen. iv. Buken er stengt i to lag. B) Forstørret bilde som viser exteriorized milt og bukspyttkjertel. De injiserte cellene danner en boble (pilspiss). ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

Figur 2
Figur 2. Bioluminescent avbildning av orthotopic pankreatisk tumor (A) ti dager etter injeksjon, (B) 31 dager etter injeksjonen, og (c) fem dager etter tumor-reseksjon.

Figur 3
Figur 3. In vivo primær tumorvekst av Panc-1 og Capan-1 cellelinjer ble overvåket over tid (dager etter injeksjon) av bioluminescens avbildning (n = 4). Kinetikken av tumorvekst etter injeksjon av Matrigel-innvevde bukspyttkjertelen tumorceller er lik orthotopic modeller ved hjelp av transplantasjon av pankreas tumor stykker.

_upload/50395/50395fig4.jpg "alt =" Figur 4 "/>
Figur 4. Hematoxylin og eosin-farget deler av (A) Panc-en primær bukspyttkjertelen svulsten, og (B) levermetastaser fra Panc-en primær bukspyttkjertelen svulst. * Local invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler i det omkringliggende organ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en orthotopic modell for langsgående vurdering av bukspyttkjertelen svulst utvikling og progresjon. Primære tumorvekst kinetikken er reproduserbare (figur 3) og kan være en ikke-invasiv overvåket ved hjelp av bioluminescens avbildning av luciferase-merkede celler, for eksempel for analyse av tumorrespons beskrives nye anti-kreft i bukspyttkjertelen terapeutika. Forenlig med sykdom hos mennesker, viser modellen lokale bukspyttkjertelen invasjon (Figur 4A) som gjør at etterforskningen av svulst celle interaksjoner med bukspyttkjertelen microenvironment. Bruken av luciferase-merket cellelinjer tillater analyse av frekvens, plassering og kinetikk av metastatisk spredning. Bruk av luciferase-merket cellelinjer forenkler påvisning av metastaser før de blir visuelt tydelig og vev lokalisering av metastaser kan bekreftes ved ex vivo avbildning og histologi. Som i den kliniske situasjonen, viser modellen metastaser til organs inkludert mesenteriske lymfeknuter, lever, mage-tarmkanalen og peritoneale hulrom (figur 4). åtte Bioluminescence avbildning kan også brukes for å bestemme vellykket reseksjon, og forekomsten og kinetikken for primærtumor tilbakefall (figur 2C). 16.

Forsiktig tilberedning og håndtering av kreft i bukspyttkjertelen celler er viktig for reproduserbarheten av modellen. Forholdet av Matrigel i PBS er blitt optimalisert for rask størkning av cellepelleten etter injeksjon. Volumet av pelleterte celler (ca. 35 pl i 10 7 tumorceller) skal trekkes fra volumet av PBS til en endelig 3:2-forhold av Matrigel: celler + PBS. Under injeksjon, blir celle lekkasje forebygges ved å opprettholde nål in situ i 30-60 sekunder, til de har størknet Matrigel (figur 1). Hvis lekkasjen oppstår det lett oppdages som Matrigel er farget og de musene kan utelukkes fROM videre analyser. Forebygging av svulst celle lekkasje sikrer at metastaser oppstår fra svulst celle spredning snarere enn som en gjenstand av injeksjonsteknikk.

Kinetikken for tumorutvikling vil bli påvirket av det cellenummer injisert og må bestemmes empirisk for hver cellelinje. Vi har funnet reproduserbare tumorvekst mønstre etter injeksjon av 4 x 10 5 Panc-1 eller Capan-1-celler (figur 3). Terskelen for Bioluminescenspåvisning av metastaser vil bli påvirket av egenskapene til uttrykk konstruere brukt blant annet promotoren styrke, og bruk av kodonoptimalisert luciferase. I tillegg til de xenograft-modeller som er beskrevet her, kan de teknikker også benyttes sammen med syngenic pankreas cellelinjer for å undersøke pankreatisk progresjon i en immunkompetente innstilling. Lignende tumor dynamikk ble observert i hann-eller hunn-mus (data ikke vist).

Metoden som beskrives hanre har blitt modifisert for en orthotopic transplantasjon modell av kreft i bukspyttkjertelen. I denne modellen, er svulster vokst subkutant i donor mus, deretter en 1 mm 3 stykke er transplantert inn i en liten lomme i bukspyttkjertelen halen av en mottaker mus. 6-8,17 Primær tumorvekst kan overvåkes ved hjelp Bioluminescens avbildning ved hjelp av donor svulster avledet fra luciferase-merket tumorceller. I motsetning til orthotopic modellen beskrevet her, transplantasjon modeller krever ekstra tid (opptil en måned) og flere mus for generering av donor svulster. Resultater ved hjelp av transplantasjon modeller kan bli påvirket av heterogene sammensetningen av transplanterte tumor stykker. Vi viser her at kinetikken etter injeksjon av Matrigel-lagret celler er lik den transplanterte modellen. Transplantasjon modeller har blitt brukt til å studere og utvide kliniske pasientprøver. 18-21

De orthotopic modellene som er beskrevet her utfylle transgene models av pre-invasiv og invasiv kreft i bukspyttkjertelen. 10,22,23 transgene modeller rekapitulere viktige aspekter ved menneskelig kreft i bukspyttkjertelen, inkludert onkogen mutasjoner, men viser betydelig variasjon i sykdomsutbruddet (7 uker til> 1 år). 10,23 fleste transgene modellene gjør ikke uttrykke luciferase og så er ikke egnet for in vivo Bioluminescens avbildning av sykdomsutvikling. I kontrast, orthotopic modeller av kreft i bukspyttkjertelen viser reproduserbare kinetikk tumor progresjon og tillate ikke-invasiv monitorering, noe som gjør dem godt egnet til pre-kliniske terapeutiske studier.

Nye terapeutiske tilnærminger er kritisk nødvendig for å bekjempe de eksepsjonelt lave overlevelse for kreft i bukspyttkjertelen. Ved å tillate visualisering av metastatisk og tilbakevendende sykdom, beskrev orthotopic modeller av kreft i bukspyttkjertelen her er relevante for klinisk setting, der de fleste aktuelle behandlinger er palliativ. I tillegg, orthotopic modellerer svært verdifull for å undersøke bukspyttkjertelen tumorbiologi og evaluere nye terapeutiske strategier i in vivo setting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Health and Medical Research Council, Australia (1008865), den australske Forskningsrådet (LE110100125), National Cancer Institute (CA138687-01), Erica Sloan er støttet av en Early Career Fellowship fra National Breast Cancer Foundation, Australia. Corina Kim-Fuchs er støttet av et fellesskap fra den sveitsiske Cancer League og et HDR-stipend fra Monash Institute of Pharmaceutical Sciences. Eliane Angst er støttet av et stipend fra Bern Cancer League.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clean Bench coat
Heating pad Set to 37 °C
Ivis Lumina ll Bioluminescent imager Caliper Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab)
Dissecting scissors
Iris forceps (serrated)
Needle holder
27 G 0.3 ml insulin syringe Terumo T35525M2913

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. Facts and Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
  2. Hariharan, D., Saied, A., Kocher, H. M. Analysis of mortality rates for pancreatic cancer across the world. HPB (Oxford). 10, 58-62 (2008).
  3. Li, D., Xie, K., Wolff, R., Abbruzzese, J. L. Pancreatic cancer. Lancet. 363, 1049-1057 (2004).
  4. Oettle, H., et al. Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observation in patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer: a randomized controlled trial. JAMA. 297, 267-277 (2007).
  5. Andersson, R., et al. Gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer: molecular mechanisms and potential solutions. Scand. J. Gastroenterol. 44, 782-786 (2009).
  6. Angst, E., et al. Bioluminescence imaging of angiogenesis in a murine orthotopic pancreatic cancer model. Mol. Imaging Biol. 12, 570-575 (2010).
  7. Angst, E., et al. N-myc downstream regulated gene-1 expression correlates with reduced pancreatic cancer growth and increased apoptosis in vitro and in vivo. Surgery. 149, 614-624 (2011).
  8. Hotz, H. G., et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer. Pancreas. 26, 89-98 (2003).
  9. Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the Panc02 and 6606PDA cell lines. Eur. Surg. Res. 47, 98-107 (2011).
  10. Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell. 4, 437-450 (2003).
  11. Sloan, E. K., et al. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Res. 70, 7042-7052 (2010).
  12. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
  13. Morizono, K., et al. Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection. Nat. Med. 11, 346-352 (2005).
  14. Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. J. Vis. Exp. (56), e3175 (2011).
  15. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. J. Vis. Exp. (52), e2775 (2011).
  16. Burton, J. B., et al. Adenovirus-mediated gene expression imaging to directly detect sentinel lymph node metastasis of prostate cancer. Nat Med. 14, 882-888 (2008).
  17. Vezeridis, M. P., Doremus, C. M., Tibbetts, L. M., Tzanakakis, G., Jackson, B. T. Invasion and metastasis following orthotopic transplantation of human pancreatic cancer in the nude mouse. J. Surg. Oncol. 40, 261-265 (1989).
  18. Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5645-5649 (1992).
  19. Reyes, G., et al. Orthotopic xenografts of human pancreatic carcinomas acquire genetic aberrations during dissemination in nude mice. Cancer Res. 56, 5713-5719 (1996).
  20. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
  21. Furukawa, T., Kubota, T., Watanabe, M., Kitajima, M., Hoffman, R. M. A novel "patient-like" treatment model of human pancreatic cancer constructed using orthotopic transplantation of histologically intact human tumor tissue in nude mice. Cancer Res. 53, 3070-3072 (1993).
  22. Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
  23. Brembeck, F. H., et al. The mutant K-ras oncogene causes pancreatic periductal lymphocytic infiltration and gastric mucous neck cell hyperplasia in transgenic mice. Cancer Res. 63, 2005-2009 (2003).

Tags

Cancer Biology medisin molekylærbiologi cellebiologi genetikk Biomedical Engineering kirurgi svulster kreft i bukspyttkjertelen Krepsen orthotopic Model Bioluminescence, Matrigel Metastasering bukspyttkjertel svulst kreft cellekultur laparotomi dyremodell bildebehandling
Bioluminescent orthotopic Modell av bukspyttkjertelkreft Progresjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chai, M. G., Kim-Fuchs, C., Angst,More

Chai, M. G., Kim-Fuchs, C., Angst, E., Sloan, E. K. Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression. J. Vis. Exp. (76), e50395, doi:10.3791/50395 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter