Summary
Una mejor comprensión de la biología del cáncer de páncreas es una necesidad vital para permitir el desarrollo de mejores opciones terapéuticas para el tratamiento de cáncer de páncreas. Para hacer frente a esta necesidad, se demuestra un modelo ortotópico de cáncer de páncreas que permite la monitorización no invasiva de la progresión del cáncer utilizando
Abstract
Introduction
El cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer, con una tasa de supervivencia a 5 años del 4-6% 1,2. Sólo el 15% de los pacientes son diagnosticados a tiempo de la enfermedad para ser elegibles para la cirugía, y los tumores se repiten en> 80% de los pacientes 3,4. gemcitabina se utiliza para el tratamiento de adenocarcinomas de páncreas, sin embargo, quimio-resistencia es común y muchas veces la droga tiene poco impacto en la supervivencia global. 5 Nuevas estrategias farmacológicas para tratar el cáncer de páncreas son críticamente necesarios. Su desarrollo depende de mejorar significativamente la comprensión de los pasos clave de la progresión de la enfermedad que pueden ser sensibles a la intervención terapéutica.
Modelos ortotópico de cáncer de páncreas emulan aspectos clave de la enfermedad humana, haciéndolos herramientas ideales para el estudio de la biología del cáncer de páncreas. 6-9 En contraste con los ensayos in vitro basados en células de comportamiento de las células de un cáncer de páncreasd subcutánea en modelos in vivo de cáncer de páncreas, modelos ortotópico permitir la investigación de las interacciones de células tumorales con el microambiente de páncreas. La cinética de la progresión de la enfermedad son altamente reproducibles en los modelos ortotópico y se producen en un corto período de tiempo (semanas), lo que los hace muy adecuados para las pruebas de pre-clínico de nuevos tratamientos. Esto está en contraste con los modelos transgénicos donde inicio de la enfermedad se produce sobre un marco más largo y más variable de tiempo (meses a 1 año). 10 Cuando se utiliza con líneas de células más agresivas, modelos ortotópico de cáncer de páncreas tienen patrones de metástasis espontánea similares a las observadas en los pacientes. 8 Expresión de genes reporteros bioluminiscentes tales como la luciferasa de luciérnaga facilita el seguimiento longitudinal de crecimiento tumoral, diseminación metastásica, la recidiva y la respuesta a la terapéutica. 6,11
A continuación se describe un modelo ortotópico de cáncer de páncreas que utiliza MatrIgel para la entrega localizada de células e in vivo imágenes de bioluminiscencia para la monitorización no invasiva de la progresión del tumor. Este modelo ortotópico de cáncer de páncreas permite análisis no invasivos de progresión de la enfermedad y la respuesta a las intervenciones terapéuticas en modelos singénicos o xenoinjerto.
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Protocol
El protocolo que se está demostrado que se realiza bajo la supervisión y aprobación de cuidado de los animales de la institución del autor y el empleo. Todos los experimentos se realizan en cumplimiento de todas las directrices, reglamentos y las agencias reguladoras.
1. Transducción de páncreas líneas celulares de cáncer
- Transducir las células de cáncer de páncreas para expresar luciferasa como se ha descrito anteriormente. Capan-1 de páncreas líneas celulares de cáncer de 12,13 Panc-1 y transducidas con luciferasa de luciérnaga se utilizan aquí.
Nota: luciferasa de Renilla luciferasa bacteriana o también se pueden usar.
2. Preparación de las células del cáncer de páncreas
- Cultura transducidas células del cáncer pancreático hasta el 70% de confluencia.
- Levante las células pancreáticas y asegurar la viabilidad es superior al 90%.
- Volver a suspender en 2 x 10 7 células / ml en una mezcla 3:2 de Matrigel refrigeradas: tamponada con fosfato Saline (PBS).
- Mantener la suspensión de células Matrigel en hielo antes de la inyección en el páncreas.
Notas: Para garantizar una rápida solidificación de Matrigel, reducir el volumen de PBS para tener en cuenta el volumen del sedimento celular. Mango Matrigel usando instrumentos de hielo frío y jeringas en todo momento para evitar la solidificación antes de la inyección. El número de células que se sugiere es una guía y debe ser determinada empíricamente para cada línea celular.
3. Ratón Preparación
- Anestesiar el ratón usando inhalado 2-3% isoflurano. Determine la profundidad de la anestesia por la falta de pedal reflejo de una pizca dedo del pie suave.
- Aplique lubricante a los ojos para evitar la desecación.
- Coloque el ratón en la espalda a un ° C almohadilla eléctrica 37 y gire suavemente el ratón para elevar el lado izquierdo del abdomen.
- Preparar el abdomen con una solución de povidona yodada 10%.
Notas: InjectabLe anestesia puede ser utilizado en lugar de la anestesia inhalada. El ayuno pre-operatorio no es necesario.
4. Laparotomía
- Utilizando instrumentos quirúrgicos estériles hacer una incisión de 1,5 cm en la piel de aproximadamente 1 cm lateral izquierda de la línea media.
- Hacer un cm de incisión en el músculo abdominal subyacente 1.5.
- Localice el bazo utilizando las pinzas y retire suavemente el bazo de la cavidad abdominal. Asegure el bazo por un bastoncillo de algodón estéril para exponer el páncreas subyacente.
- Busque la cola del páncreas adyacente al bazo.
- Uso de un G 0,3 ml jeringa de insulina 29, inyectar 20 l de la suspensión de células Matrigel en el páncreas.
- Después de la inyección, mantenga la jeringa en el páncreas durante 30-60 segundos hasta que el Matrigel se ha solidificado. Este paso importante minimiza las fugas celular.
- Inspeccionar el sitio de la inyección para asegurar que tuviera lugar ninguna fuga.
- Volver el bazo y el páncreas a la cavidad abdominal.
Nota: Tenga cuidado de no perforar el lado dorsal del páncreas que puede ser delgada.
5. Cierre de la pared abdominal
- Cierre la musculatura abdominal del ratón con una sutura trenzada absorbible 4-0 con una aguja redonda usando una puntada continua.
- Cierre de la piel externa con un monofilamento no absorbible 6-0 sutura con una aguja de corte con una puntada continua.
- Retire el ratón de la anestesia inhalada e inyectada 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea.
- Deje que el ratón se recupere en su jaula colocada sobre una almohadilla térmica ° C 37 con acceso libre a comida y agua. Si los ratones muestran signos de dolor, como encorvarse o con movilidad reducida, la buprenorfina puede administrarse cada 12 horas durante un período de 36 horas.
- Después de la cicatrización de heridas (7-10 días), anestesiar el ratón y retirar los puntos de sutura externos.
6. Seguimiento bioluminiscente de Canc páncreaser progresión
- Anestesiar el ratón con isoflurano inhalado.
- Inyectar 150 mg / kg de D-luciferina a través de la vena caudal.
- Coloque el ratón en el sistema de imágenes bioluminiscentes y capturar imágenes de luz blanca y bioluminiscencia como se ha descrito anteriormente 14,15.
- Retire el ratón de la anestesia inhalada y permite que se recupere en su jaula.
Nota: bioluminiscente de imágenes es no invasivo y puede llevarse a cabo periódicamente para investigar la cinética de crecimiento del tumor. Para tumor imágen en la cola del páncreas, es importante poner el ratón sobre el lado izquierdo, por lo que los puntos tumorales hacia la cámara. Nos Toma de imágenes de una vez por semana con la frecuencia aumentó hasta tres veces por semana antes del punto final experimental utilizando un sistema de imagen II Lumina (Perkin-Elmer, anteriormente Caliper Life Sciences) que ejecuta el software 4.3.1 Imagen de estar con binning 4, FOV 12.5, F-parada 1, la exposición 1-60 seg (determinada por la más alta exposure sin saturación de píxel).
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Representative Results
Este método describe un modelo ortotópico de cáncer de páncreas usando procedimientos quirúrgicos, incluyendo la inducción de la anestesia, la laparotomía, la inyección de las células cancerosas en el cierre de Matrigel y abdominal (Figura 1A). Las células inyectadas forman una burbuja en la superficie del páncreas (Figura 1B). La progresión del cáncer de páncreas puede ser monitorizado de forma no invasiva en el uso de imágenes de bioluminiscencia in vivo para realizar un seguimiento proliferación de células cancerosas y la difusión (Figura 2). Metástasis hepática se indica mediante la observación de la bioluminiscencia en el hígado durante la resección quirúrgica (Figura 2) y se confirmó ex vivo mediante histología (Figura 4B). Los tumores primarios fueron resecados con la cola del páncreas y el bazo a las 6 semanas después de la implantación. Dinámica del crecimiento tumoral en este modelo de inyección ortotópica son reproducibles y se parecen mucho a la cinética de modelos de trasplante ortotópico de pa cáncer de ncreatic (Figura 3). El crecimiento del tumor en el páncreas es localmente invasivo y metástasis en órganos incluyendo el hígado (Figura 4).
Figura 1. Un modelo de ratón ortotópico de progresión del cáncer de páncreas. A) i. El ratón anestesiado se fija en su lugar con cinta adhesiva y el abdomen se desinfecta. ii. Después de la laparotomía longitudinal del bazo y la cola del páncreas se exteriorizan con suavidad y se mantienen en su lugar en un bastoncillo de algodón estéril. iii. Las células tumorales pancreáticas Matrigel embebidos se inyectan en la cola del páncreas. iv. El abdomen se cerró en dos capas. Imagen B) ampliada que muestra el bazo y el páncreas exteriorizado. Las células inyectadas forman una burbuja (punta de flecha). ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande la figura.
Figura 2. Bioluminiscente de imágenes de tumor de páncreas ortotópico (A) diez días después de la inyección, (B) 31 días después de la inyección, y (C) cinco días siguientes a la resección del tumor.
Figura 3. En el crecimiento del tumor primario in vivo de Panc-1 y Capan-1 líneas celulares se monitorizó con el tiempo (días después de la inyección) por imágenes de bioluminiscencia (n = 4). La cinética de crecimiento del tumor después de la inyección de las células tumorales pancreáticas Matrigel incrustados son similares a los modelos que utilizan el trasplante ortotópico de piezas tumorales pancreáticas.
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La Figura 4. Hematoxilina y eosina secciones teñidas de (A) del tumor de páncreas Panc-1 primaria, y (B) metástasis hepáticas de Panc-1 tumor pancreático principal. * La invasión local de las células de cáncer de páncreas en el órgano circundante.
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Discussion
Aquí se describe un modelo ortotópico para la evaluación longitudinal de desarrollo y la progresión del tumor de páncreas. La cinética de crecimiento del tumor primario son reproducibles (Figura 3) y pueden ser de forma no invasiva supervisado usando imágenes de bioluminiscencia de la luciferasa de las células marcadas con, por ejemplo, para el análisis de la respuesta del tumor a nuevas terapias contra el cáncer de páncreas. En consonancia con la enfermedad humana, el modelo muestra invasión local de páncreas (Figura 4A), que permite la investigación de las interacciones de células tumorales con el microambiente de páncreas. El uso de líneas celulares de luciferasa-etiquetados permite análisis de frecuencia, la ubicación y la cinética de la diseminación metastásica. El uso de líneas celulares de luciferasa-etiquetados facilita la detección de metástasis antes de que sean visualmente aparente y localización de tejido de la metástasis pueden ser confirmados por el ex vivo de imágenes y la histología. Al igual que en la situación clínica, el modelo muestra metástasis a organs incluyendo los ganglios linfáticos mesentéricos, hígado, tracto gastrointestinal y la cavidad peritoneal (Figura 4). 8 Imágenes de bioluminiscencia también se pueden usar para determinar la resección con éxito, y la incidencia y la cinética de la recurrencia del tumor primario (Figura 2C). 16
Preparación y la manipulación de las células de cáncer de páncreas cuidadoso es esencial para la reproducibilidad del modelo. La relación de Matrigel a PBS ha sido optimizado para una rápida solidificación del pellet de células después de la inyección. El volumen de células sedimentadas (aproximadamente 35 l para 10 7 células tumorales) debe sustraerse del volumen de PBS para una relación de 03:02 final del Matrigel: células + PBS. Durante la inyección, las fugas de células se evita mediante el mantenimiento de la aguja in situ durante 30-60 segundos hasta que el Matrigel se ha solidificado (Figura 1). Si la fuga ocurre que se detecta fácilmente como Matrigel es de color y los ratones pueden ser excluidos from análisis adicionales. La prevención de fugas de células tumorales se asegura de que la metástasis se produce a partir de difusión de células tumorales en lugar de como un artefacto de la técnica de inyección.
La cinética de desarrollo del tumor se verán influenciadas por el número de células inyectadas y debe ser determinada empíricamente para cada línea celular. Encontramos patrones de crecimiento del tumor después de la inyección reproducible de 10 x 5 Panc-1 o células Capan-1 4 (Figura 3). El umbral para la detección bioluminiscente de metástasis se verá influenciada por las características de la construcción de expresión utilizadas, incluyendo la fuerza del promotor y el uso de la luciferasa con codones optimizados. Además de los modelos de xenoinjertos descritos aquí, las técnicas también se pueden utilizar con líneas de células pancreáticas singénicos para examinar la progresión de páncreas en un entorno inmunocompetente. Se observaron dinámica tumorales similares en ratones machos o hembras (datos no mostrados).
El método que se describere se ha modificado para un modelo de trasplante ortotópico de cáncer de páncreas. En este modelo, los tumores se cultivaron subcutáneamente en ratones donantes, a continuación, una pieza de 1 mm 3 se trasplanta en un pequeño bolsillo en la cola del páncreas de un ratón receptor. 6-8,17 el crecimiento del tumor primario puede ser monitoreado usando imágenes de bioluminiscencia usando tumores donantes derivado de las células tumorales luciferasa-etiquetados. En contraste con el modelo ortotópico se describe aquí, modelos de trasplante requieren tiempo adicional (hasta 1 mes) y ratones adicionales para la generación de tumores donantes. Los resultados basados en modelos de trasplante pueden ser influenciados por la composición heterogénea de piezas tumorales trasplantadas. Hemos demostrado aquí que la cinética después de la inyección de células Matrigel embebidos son similares al modelo trasplantado. Modelos de trasplante se han utilizado para estudiar y ampliar las muestras de pacientes clínicos. 18-21
Los modelos ortotópico aquí descritos se complementan transgénico modelos de cáncer de páncreas pre-invasiva e invasiva. 10,22,23 modelos transgénicos recapitulan los aspectos clave del cáncer de páncreas humano, incluyendo las mutaciones oncogénicas, pero muestran una variabilidad significativa en la aparición de la enfermedad (7 semanas a> 1 año). 10,23 mayoría de los modelos transgénicos hacen no expresar luciferasa y por lo tanto no son adecuados para la formación de imágenes de bioluminiscencia in vivo de progresión de la enfermedad. En contraste, los modelos ortotópico de cáncer de páncreas muestran la cinética reproducibles de la progresión del tumor y permiten la monitorización no invasiva, haciéndolos adecuados para estudios terapéuticos pre-clínicos.
Nuevos enfoques terapéuticos son imprescindibles para combatir las tasas excepcionalmente bajas de supervivencia en el cáncer de páncreas. Al permitir la visualización de la enfermedad metastásica y recurrente, los modelos ortotópico de cáncer de páncreas se describen aquí son relevantes para el entorno clínico, donde la mayoría de los tratamientos actuales son paliativos. Además, los modelos ortotópicoson altamente valiosas para la investigación de la biología del tumor de páncreas y evaluación de nuevas estrategias terapéuticas en el establecimiento in vivo.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica, Australia (1008865), el Consejo de Investigación Australiano (LE110100125), el Instituto Nacional del Cáncer (CA138687-01), Erica Sloan con el apoyo de una beca de Carrera Temprana del Cáncer National Breast Fundación, Australia. Corina Kim-Fuchs es apoyado por una beca de la Liga Suiza contra el Cáncer y una beca de HDR de Monash Instituto de Ciencias Farmacéuticas. Eliane Angst es apoyado por una beca de la Sociedad del Cáncer de Berna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean Bench coat | |||
| Heating pad | Set to 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissecting scissors | |||
| Iris forceps (serrated) | |||
| Needle holder | |||
| 27 G 0.3 ml insulin syringe | Terumo | T35525M2913 |
References
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