Summary
Pankreas kanseri biyoloji Geliştirilmiş anlayış eleştirel pankreas kanseri tedavisi için daha iyi tedavi seçeneklerinin gelişimi için gereklidir. Bu ihtiyacı karşılamak için, bizim kullandığımız kanser ilerlemesi non-invazif izleme izin pankreas kanseri ortotopik modeli göstermek
Abstract
Introduction
Pankreas kanseri% 4-6 bir 5-yıllık sağkalım oranı ile, kansere bağlı ölüm dördüncü önde gelen nedenidir. Hastaların 1,2 sadece 15% cerrahi için uygun olduğu hastalığı zamanında teşhis ve tümörler tekrarlayabilir edilir > bu hastaların% 80'inde. 3,4 Gemsitabin pankreas adenokanserlerinin tedavisinde kullanılan, ancak, kemoterapi yaygındır ve genellikle ilaç genel sağkalım üzerinde çok az etkisi vardır. pankreas kanseri tedavisi için 5 Yeni farmakolojik stratejiler kritik ihtiyaç vardır. Onların gelişimi terapötik müdahale duyarlı olabilir hastalığın ilerlemesi en önemli adımlardan önemli ölçüde geliştirilmiş anlayış bağlıdır.
Pankreas kanseri ortotopik modelleri pankreas kanseri biyoloji eğitim için ideal alet yapımında, insan hastalığın temel yönlerini taklit. Pankreas kanseri hücre davranış in vitro hücre tabanlı deneyleri aksine bir olarak 6-9pankreas kanseri in vivo modellerde d deri altı, ortotopik modelleri pankreas mikro ile tümör hücre etkileşimlerinin incelenmesi sağlar. Hastalığın ilerlemesi kinetik ortotopik modelleri son derece tekrarlanabilir ve onları da yeni tedavi öncesi klinik test için uygun hale getirir kısa bir süre (hafta), üzerinde meydana gelir. Bu hastalık başlangıcı daha uzun ve daha değişken bir zaman dilimi (ay 1 yıl). 10 daha agresif hücre hatları ile kullanılan gerçekleşir transgenik modelleri aksine olan, pankreas kanseri ortotopik modellerinde görülen benzer spontan metastaz desenler var hasta. gibi ateşböceği lusiferaz gibi bioluminescent muhabiri genlerin 8 İfade tümör büyümesinin boyuna izlenmesi, metastatik yayılması, nüks ve tedavi yanıt kolaylaştırır. 6,11
Burada Matr kullanır pankreas kanseri ortotopik modeli tariftümör progresyonu non-invazif izleme için lokalize hücre teslimat ve in vivo biyoparlaklık görüntüleme için igel. Pankreas kanseri Bu ortotopik modeli hastalığın ilerlemesi ve syngenic veya xenograft modellerinde tedavi girişimlerine yanıt non-invaziv analiz sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gösterdi olan Protokol yazarın kurumun hayvan bakımı ve kullanımı komitesi rehberlik ve onay altında yapılır. Tüm deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak yürütülür.
1. Pankreas Kanseri Hücre Hatları iletici
- Daha önce tarif edildiği gibi transdüksiyonu pankreas kanseri hücrelerinin lusiferaz ifade etmek. 12,13 Panc-1 ve Capan-1 pankreas kanseri hücre hatlarının ateşböceği lusiferaz ile transduse burada da kullanılmıştır.
Not: Renilla lusiferaz ve bakteriyel lusiferaz da kullanılabilir.
2. Pankreas Kanseri Hücre Hazırlık
- Kültür% 70 konfluent kadar pankreas kanseri hücrelerinin transduse.
- Pankreas hücreleri kaldırın ve canlılığı% 90 daha büyük olduğundan emin olun.
- Matrigel soğutulmuş, 3:2 karışımı içinde 2 x 10 7 hücre / ml 'de yeniden süspanse: Fosfat tamponlu tuzine (PBS).
- Önce pankreas içine enjeksiyon için buz üzerinde Matrigel-hücre süspansiyonu tutun.
Notlar: Matrigel hızlı katılaşma sağlamak için, hücre pelet hacmi hesaba PBS hacmini azaltmak. Enjeksiyondan önce katılaşma önlemek için her zaman buz gibi araçlar ve şırınga kullanarak Matrigel tutun. Önerilen hücre sayısı bir kılavuzdur ve her bir hücre hattı için ampirik olarak belirlenmelidir.
3. Fare Hazırlık
- % 2-3 izofluran teneffüs kullanarak fare anestezisi. Hafif bir ayak tutam için pedal refleks eksikliğinden anestezi derinliği belirler.
- Kuruma önlemek için gözleri bir miktar gres sürülmesi.
- 37 ° C ısıtma yastığı sırtında fare yerleştirin ve yavaşça karın sol tarafında yükseltmek için fareyi açın.
- % 10 povidon iyot çözeltisi ile karın hazırlayın.
Notlar: Injectable anestezi inhale anestezi yerine kullanılabilir. Ameliyat öncesi açlık gerekli değildir.
4. Laparotomi
- Steril cerrahi aletler kullanarak yaklaşık 1 cm orta hat yanal sol deride 1.5 cm kesi yapmak.
- Temel karın kas bir 1.5 cm kesi olun.
- Forseps kullanarak dalak bulun ve yavaşça karın boşluğundan dalak çıkarın. Altta yatan pankreas ortaya çıkarmak için steril bir pamuklu çubuk boyunca dalak sabitleyin.
- Dalak bitişik pankreas kuyruk bulun.
- Bir 29 g, 0.3 ml insülin şırınga kullanarak, pankreas içine Matrigel hücre süspansiyonu, 20 ul enjekte edilir.
- Matrigel katılaşmış kadar enjeksiyonu takiben, 30-60 saniye pankreas şırınga tutun. Bu önemli bir adım hücre kaçağı en aza indirir.
- Herhangi bir sızıntı meydana sağlamak için enjeksiyon yerinde kontrol edin.
- Karın boşluğuna dalak ve pankreas dönün.
Not: ince olabilir pankreas sırt tarafında delinmesiyle önlemek için dikkat edin.
5. Karın Duvarı Kapatma
- Sürekli bir dikiş kullanarak bir yuvarlak iğne ile emilebilir örgülü 4-0 sütür ile fare karın kas kapatın.
- Sürekli bir dikiş kullanarak bir kesici iğne ile bir emilmeyen monofilament 6-0 sütür ile dış deri kapatın.
- Inhale anestezik ve deri altına enjekte 0.05-0.1 mg / kg buprenorfin gelen fareyi çıkarın.
- Fare yiyecek ve su ücretsiz erişim ile 37 ° C ısıtma yastığı yerleştirilir kafesine kurtarmak için izin verin. Farenin bu hunching veya azalan hareketlilik gibi ağrı belirtileri gösteriyorsa, buprenorfin, bir 36 saat süre boyunca her 12 saat verilebilir.
- Yara iyileşmesi (7-10 gün) sonra, fare uyutmak ve dış dikişler çıkarın.
6. Pankreas Canc bir Bioluminescent İzlemeer ilerleme
- Izofluran teneffüs kullanarak fare anestezisi.
- Kuyruk ven yoluyla 150 mg / kg D-luciferase enjekte edilir.
- Bioluminescent görüntüleme sisteminde fare yerleştirin ve daha önce açıklandığı gibi beyaz ışık ve biyolüminesans görüntüleri yakalayabilir. 14,15
- Inhale anestezik gelen fareyi çıkarın ve onun evde kafes içinde kurtarmak için izin verir.
Not: Bioluminescent görüntüleme non-invaziv ve tümör büyüme kinetiği araştırmak için periyodik olarak yapılabilir. Pankreas kuyruk görüntü tümör için onun sol tarafında fare koymak önemlidir, kameraya doğru tümör noktaları çok. Frekans önce FOV 12.5 binning 4 Oturma Görüntüleme 4.3.1 yazılımı çalıştıran bir Lumina II görüntüleme sistemi (Perkin-Elmer, eski Kaliper Yaşam Bilimleri), kullanarak deneysel nokta için haftada üç katına kadar artırılabilir ile Biz, haftada bir kez görüntülendi F-stop 1, pozlama 1 - 60 saniye (en yüksek exp tarafından belirlenirpiksel doygunluk olmadan osure).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem, anestezi indüksiyonu, laparotomi, Matrigel ve karın kapatılması (Şekil 1A) kanser hücrelerinin enjeksiyonu da dahil olmak üzere cerrahi işlemler, kullanarak pankreas kanseri ortotopik model tanımlamaktadır. Enjekte edilen hücreler, pankreas yüzeyinde bir balon (Şekil 1B) oluşturur. Pankreas kanseri ilerleme non-invaziv kanser hücre çoğalması ve yayılması (Şekil 2) izlemek için in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanılarak izlenir olabilir. Karaciğer metastazı cerrahi rezeksiyon sırasında karaciğerde biyolüminesans gözlem ile gösterilir (Şekil 2) ve histoloji (Şekil 4B) ile ex vivo doğrulandı. Primer tümör implantasyonu sonrası 6 hafta pankreas kuyruk ve dalak ile rezeke edildi. Bu ortotopik enjeksiyon modelinde tümör büyümesini dinamikleri tekrarlanabilir ve yakından pa ortotopik transplantasyon modellerinin benzer kinetik ncreatic kanseri (Şekil 3). Pankreasta tümör büyümesini yerel invaziv ve karaciğer (Şekil 4) dahil olmak üzere organlara metastaz.
Şekil 1. Pankreas kanseri ilerleme ortotopik fare modeli. A) i. Anestezi fare bant kullanılarak yerinde sabittir ve karın dezenfekte edilir. ii. Steril bir pamuklu çubuk üzerinde uzunlamasına laparotomi sonra dalak ve pankreas kuyruk hafifçe eksterioze edildi ve yerinde tutulur. iii. Matrigel gömülü pankreas tümörü hücreleri, pankreas kuyruğu içine enjekte edilir. iv. Karın iki kat kapalı. B) Büyütülmüş görüntü ucu dışarıya dalak ve pankreas gösteren. Enjekte edilen hücreler bir balon (ok başı) oluşturur. ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "target =" _blank "> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Ortotopik pankreas tümör Bioluminescent görüntüleme (A) on gün enjeksiyondan sonra, (B) 31 gün enjeksiyon sonrası, ve (C) tümör rezeksiyonu beş gün sonra.
Şekil 3,. Panc-1 ve Capan-1 hücre hatlarının in vivo birincil tümör büyümesini biyolüminesans görüntüleme (n = 4), zaman (gün sonra enjeksiyon) üzerinde izlenmiştir. Tümör büyümesinin kinetikleri Matrigel gömülü bir pankreatik tümör hücre enjeksiyonundan sonra pankreas tümörü adet nakli kullanarak ortotopik modellerine benzer.
_upload/50395/50395fig4.jpg "alt =" Şekil 4 "/>
Şekil 4. Hematoksilen ve (A) Panc-1 primer pankreas tümörü ve Panc-1 primer pankreatik tümörden (B) karaciğer metastazı eozin lekeli bölümleri. Çevreleyen organ haline pankreas kanseri hücrelerinin * Yerel işgali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada pankreas tümör gelişimi ve ilerlemesi boyuna değerlendirilmesi için ortotopik modeli tarif. Primer tümör büyüme kinetiği tekrarlanabilir (Şekil 3) ve yeni anti-pankreas kanseri tedavi tümör yanıtı analizleri için örneğin lusiferaz-etiketli hücreleri biyoparlaklık görüntüleme kullanarak non-invaziv takip olabilir. , Insan hastalığı ile uyumlu olarak, model pankreas mikro tümör hücre etkileşimleri inceleme sağlayan yerel pankreas invazyonu (Şekil 4A) gösterir. Lusiferaz-etiketli hücre hatları kullanımı metastatik yayılması sıklığı, yeri ve kinetik analizleri sağlar. Görsel olarak belirgin hale gelir ve metastaz bir doku lokalizasyonu ex vivo görüntüleme ve histoloji ile teyit edilebilir önce lusiferaz etiketli hücre hatlarının kullanımı, metastaz taraması kolaylaştırır. Klinik durumda olduğu gibi, model org metastazı gösterirmezenterik lenf düğümleri, karaciğer, gastrointestinal sistem ve periton boşluğuna (Şekil 4). 8 Biyoparlaklık görüntüleme dahil olmak üzere ans de başarılı rezeksiyon ve insidansı ve primer tümörün nüks kinetiği (Şekil 2C) belirlemek için kullanılabilir. 16
Dikkatli bir hazırlık ve pankreas kanseri hücrelerinin işleme modeli tekrarlanabilirlik için gereklidir. PBS Matrigel oranı enjeksiyonundan sonra hücre peleti hızlı katılaşma için optimize edilmiştir. Tanelenmiş hücreler (10 7 tümör hücreleri için yaklaşık 35 ul) hacmi Matrigel son bir 3:2 oranında PBS hacmi çıkarılır edilmelidir: hücreler PBS +. Enjeksiyon sırasında, hücre sızıntısı, Matrigel (Şekil 1) katılaşana kadar 30-60 saniye boyunca in situ iğne muhafaza tarafından önlenir. Sızıntı oluşursa Matrigel renkli olduğu gibi kolayca tespit edilir ve bu fareler f iptal edilebilirrom daha analizleri. Tümör hücre kaçak önleme metastaz yerine enjeksiyon tekniği bir eser olarak daha tümör hücre yayılması meydana gelir sağlar.
Tümör gelişiminin kinetiği hücre sayısı enjekte edildi ve her bir hücre hattı için ampirik olarak belirlenmelidir tarafından etkilenecektir. Biz, 4 x 10 5 Panc-1 veya Capan-1 hücrelerinde (Şekil 3) enjeksiyonundan sonra tekrarlanabilir tümör büyümesini desenler bulunabilir. Metastazların biyolüminesans tespiti için eşik yapı destekleyici kuvveti ve kodon-optimize edilmiş lusiferaz kullanımı dahil olmak üzere, kullanılan ifade özellikleri tarafından etkilenecektir. Burada açıklanan ksenograft modelleri ek olarak, teknikler aynı zamanda bir bağışıklık ortamda pankreas ilerleme incelemek için syngenic pankreatik hücre hatları ile birlikte kullanılabilir. Benzer tümör dinamikleri erkek ya da dişi farenin (veriler gösterilmemiştir) gözlendi.
Gibi bir yöntem tarif diyeyeniden pankreas kanseri ortotopik nakli modeli için modifiye edilmiştir. Bu modelde, tümörler daha sonra 1 mm 3 adet bir alıcı fare pankreas kuyruk küçük cebine nakledilen, donör farelerde deri altına yetiştirilmektedir. 6-8,17 Primer tümör büyümesi donör tümörlerin kullanarak biyoparlaklık görüntüleme kullanılarak izlenebilir lusiferaz etiketli tümör hücreleri elde. Burada açıklanan ortotopik modeli aksine, transplantasyon modelleri ek süre (en fazla 1 ay) ve donör tümörlerin nesil için ek fareler gerektirir. Nakli modelleri kullanarak sonuçları nakledilen tümör adet heterojen bileşimi etkilenebilir. Biz Matrigel-gömülü hücrelerinin enjeksiyonundan sonra kinetik nakledilen modeline benzer olduğunu burada gösterdi. Transplantasyon modelleri klinik hasta numuneleri incelemek ve genişletmek için kullanılmıştır. 18-21
Burada açıklanan ortotopik modelleri transgenik m tamamlayacakpre-invaziv ve invaziv pankreas kanseri odels. 10,22,23 Transgenik modelleri onkogen mutasyonları dahil olmak üzere insan pankreas kanseri temel yönlerini özetlemek ancak hastalığın başlangıcı (> 1 yıl 7 hafta) önemli değişkenlik göstermektedir. 10,23 En transgenik modelleri yapmak Lusiferaz ifade etmez ve bu nedenle hastalığın ilerlemesi in vivo biyolüminesans görüntüleme için uygun değildir. Buna karşılık, pankreas kanseri ortotopik modelleri tümör progresyonu tekrarlanabilir kinetik göstermek ve onları iyi klinik öncesi tedavi çalışmalara uygun hale, non-invazif izleme sağlar.
Yeni tedavi yaklaşımları eleştirel pankreas kanseri için son derece düşük sağkalım oranları ile mücadele için gereklidir. Metastatik ve nüks görselleştirme izin vererek, pankreas kanseri ortotopik modelleri en güncel tedaviler palyatif olan klinik ortamda, ilgili burada açıklanan. Ayrıca, ortotopik modellerindepankreas tümör biyolojisi soruşturma ve in vivo ortamda yeni tedavi stratejileri değerlendirmek için son derece değerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya (1008865), Avustralya Araştırma Konseyi (LE110100125), Ulusal Kanser Enstitüsü (CA138687-01), Erica Sloan Ulusal Meme Kanseri bir Erken Kariyer Bursu tarafından desteklenen tarafından desteklenmiştir Vakfı, Avustralya. Corina Kim-Fuchs İsviçre Kanser Ligi ve İlaç Bilimleri Enstitüsü Monash bir HDR burs bir burs ile desteklenmektedir. Eliane Angst Bern Kanser Ligi bir hibe ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean Bench coat | |||
| Heating pad | Set to 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissecting scissors | |||
| Iris forceps (serrated) | |||
| Needle holder | |||
| 27 G 0.3 ml insulin syringe | Terumo | T35525M2913 |
References
- American Cancer Society. Facts and Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Hariharan, D., Saied, A., Kocher, H. M. Analysis of mortality rates for pancreatic cancer across the world. HPB (Oxford). 10, 58-62 (2008).
- Li, D., Xie, K., Wolff, R., Abbruzzese, J. L. Pancreatic cancer. Lancet. 363, 1049-1057 (2004).
- Oettle, H., et al. Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observation in patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer: a randomized controlled trial. JAMA. 297, 267-277 (2007).
- Andersson, R., et al. Gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer: molecular mechanisms and potential solutions. Scand. J. Gastroenterol. 44, 782-786 (2009).
- Angst, E., et al. Bioluminescence imaging of angiogenesis in a murine orthotopic pancreatic cancer model. Mol. Imaging Biol. 12, 570-575 (2010).
- Angst, E., et al. N-myc downstream regulated gene-1 expression correlates with reduced pancreatic cancer growth and increased apoptosis in vitro and in vivo. Surgery. 149, 614-624 (2011).
- Hotz, H. G., et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer. Pancreas. 26, 89-98 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the Panc02 and 6606PDA cell lines. Eur. Surg. Res. 47, 98-107 (2011).
- Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell. 4, 437-450 (2003).
- Sloan, E. K., et al. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Res. 70, 7042-7052 (2010).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Morizono, K., et al. Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection. Nat. Med. 11, 346-352 (2005).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. J. Vis. Exp. (56), e3175 (2011).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. J. Vis. Exp. (52), e2775 (2011).
- Burton, J. B., et al. Adenovirus-mediated gene expression imaging to directly detect sentinel lymph node metastasis of prostate cancer. Nat Med. 14, 882-888 (2008).
- Vezeridis, M. P., Doremus, C. M., Tibbetts, L. M., Tzanakakis, G., Jackson, B. T. Invasion and metastasis following orthotopic transplantation of human pancreatic cancer in the nude mouse. J. Surg. Oncol. 40, 261-265 (1989).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5645-5649 (1992).
- Reyes, G., et al. Orthotopic xenografts of human pancreatic carcinomas acquire genetic aberrations during dissemination in nude mice. Cancer Res. 56, 5713-5719 (1996).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Furukawa, T., Kubota, T., Watanabe, M., Kitajima, M., Hoffman, R. M. A novel "patient-like" treatment model of human pancreatic cancer constructed using orthotopic transplantation of histologically intact human tumor tissue in nude mice. Cancer Res. 53, 3070-3072 (1993).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Brembeck, F. H., et al. The mutant K-ras oncogene causes pancreatic periductal lymphocytic infiltration and gastric mucous neck cell hyperplasia in transgenic mice. Cancer Res. 63, 2005-2009 (2003).
