Summary
В данной статье подробно процедуры для оптического анализа изображений с опухолью целевой наночастицы, HerDox. В частности, подробную информацию об использовании многомодового изображения устройства для обнаружения нацеливания на опухоль и оценки опухоли проникновение описан здесь.
Abstract
HER2 + опухолей целевых наночастиц, HerDox, экспонаты опухоли преимущественному накоплению и росту опухоли абляции в животной модели HER2 + рак. HerDox формируется нековалентными самосборки белка-мишени опухоли клетки с проникновением к препаратам, доксорубицин, через небольшой нуклеиновых линкер. Сочетание электрофильного, интеркаляции и олигомеризации облегчения взаимодействия самосборке в круглых частиц 10-20 нм. HerDox демонстрирует стабильность в крови, а также при длительном хранении при различных температурах. Системной доставки HerDox в опухоли мышей приводит к опухоли гибель клеток без заметного негативного воздействия на неопухолевых тканей, в том числе сердца и печени (которые подвергаются заметным повреждения нецелевой доксорубицин). HER2 высоте облегчает нацеливание на клетки, экспрессирующие человеческий рецептор эпидермального фактора роста, следовательно опухолей отображения повышенные уровни HER2 демонстрируют большему накоплению HerDox по сравнению с клетками экспрессиюпеть более низких уровнях, как в пробирке и в естественных условиях. Интенсивность флуоресценции в сочетании с конфокальной на месте и спектрального анализа позволило нам проверить в условиях Опухоль адресности и проникновения в опухоль клетки HerDox после системной доставки. Здесь мы подробно наши методы оценки нацеливания на опухоль с помощью многомодового изображений после системной доставки.
Introduction
Опухоль-таргетинга химиотерапии имеет потенциал, чтобы устранить раковые клетки при снижении дозы препарата по сравнению с нецелевым наркотики, потому что больше поставляемого терапия может накапливаться на ее назначению, а не распространять без опухолевой ткани. В последнем случае ослабит из эффективности препарата и, следовательно, требуют более высоких доз чтобы быть эффективным, опухоли-таргетинга имеет как терапевтические и безопасность преимущества по сравнению со стандартными нецелевой лечения.
Таргетинг химиотерапии инкапсуляции в самоорганизующихся наночастиц позволяет наркотиков остается химически не модифицированной в отличие от лекарств, которые ковалентно связаны с ориентацией молекул. В такой связи имеет потенциал, чтобы изменить действие как лекарственное средство, и целевой молекулы; нековалентному сборки позволяет активности лекарственных средств должны быть сохранены.
Ранее нами было показано, что новый трехкомпонентный, самоорганизующиеся комплекс, HerDox, цели HER2 + опухолей
Наши предыдущие исследования показали, что системная доставка HerDox выходы преимущественному накоплению в опухоли по сравнению с не-опухолевой ткани и по сравнению с нецелевой Dox 1, и проникновение в опухолевые клетки в естественных условиях 7. Мы заметили, что HerDox релизы Dox после вступления клетки опухоли, что позволяет Dox накопления в ядро 1. Опухоль-видимому, накопление коррелирует с рецептором уровне, а относительно низкие HER2 опухолей, экспрессирующих HerDox накапливают меньше по сравнению с теми сравнительно высоким уровнем HER2 1. Кроме того, эффективная концентрация гибели клеток показывает обратную корреляцию с HER2 дисплей на опухолевые клеточные линии, экспрессирующие различные поверхности клетки HER2 уровня 1. HerDox обладает терапевтическими и безопасность преимущество перед нецелевой Dox, как опухолевые убийство происходит в более чем в 10 раз более низкой дозе по сравнению с распакуйтеgeted препарата и не дает обнаружить отрицательное воздействие на сердце (обнаружен с помощью эхокардиографии и гистологические пятна) или печени (обнаружен TUNEL пятно) ткани, в отличие от нецелевой доксорубицин 1. Несмотря на свое происхождение от вирусных белков капсида, HerPBK10 не проявляет иммуногенность обнаруживаемых на терапевтических уровнях 2. В то время как уже существующие антитела к целому аденовирус может распознать HerPBK10, они не в состоянии предотвратить связывание клеток 2.
Объем опухоли измеренная в течение долгого времени является стандартным методом оценки терапевтической эффективности целевой терапии, и была использована для оценки терапевтической эффективности HerDox. Дополнение этот подход с в естественных условиях и бывших естественных условиях интенсивность флуоресценции изображение позволило нам лучше оценить эффективность адресности 7. Мы специально интегрирован на месте конфокальной микроскопии вырезали опухоль со спектральным анализом ДОХ флуоресценции, чтобы убедиться, что нет HerDoxT только накопленная при опухолях в естественных условиях, но проникли в опухолевые клетки и доставлен Dox в цитоплазме и ядре 7. Спектральный анализ того позволило нам отличить Dox флуоресценции аутофлюоресценция 7.
Здесь мы показываем, более подробно наш подход к оценке HerDox в естественных условиях после системной доставки, и, самое главное, для оценки ориентации через многомодовых методов визуализации и анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Системной доставки В естественных условиях
- Смешать достаточно HerDox стерильным физиологическим раствором приравнять 0,2 мл 0,004 мг / кг доза HerDox на инъекцию для возрасте 6-8 недель пи / пи мышь подшипника подкожной двусторонней опухоли ксенотрансплантата бок.
- Осторожно обратить HerDox смесь в 3/10 мл инсулина шприца, снабженного иглой 29G, избегая пузырьков.
- Анестезия индуцированный краткое изофлурана воздействия в индукционной камере, оборудованной газовой системы очистки (Oxygen Расход: 0,5-1 л / мин, изофлурана концентрация: 3-4% (или ниже).
- Введите всю смесь в хвостовую вену мышей анестезировали (0,2 мл на инъекцию). IV инъекций также может быть выполнена в сдержанном, наркозу мыши.
- Инъекции повторяют на той же мыши на шесть последовательных дней один раз в день.
2. Флуоресценции В естественных условиях
Накопление HerDox флуоресценции в опухоли могутих заметит последний день инъекций (День 7) с помощью многомодового томографа. Описанные ниже процедуры повлечь за собой использование индивидуальных макро-подсветкой и системой обнаружения (рис. 1) 8.
- Включите многомодового оптического В естественных изображений.
- Выберите выбросов полосовой фильтр (590 нм ± 30 нм) подходит для определения доксорубицина флуоресценции.
- Включите Криптон Аргон-лазерная и поместите полосовой фильтр возбуждения (488 нм ± 10 нм) на лазерный оптический путь.
- Включите анестезии системы, а затем поместите мышь в обезболивающих камеры (Oxygen Расход: 0,5-1 л / мин, изофлурана концентрация: 3-4% (или ниже) газовой системы очистки.
- Передача мышь от обезболивающих камеры изображения камеры многомодового оптического В естественных условиях Imager, когда мышь находится под наркозом.
- Наведите головная за нос мыши и открыть поток для управления непрерывными анестезииSIA во время получения изображения (Oxygen Расход: 0,5-1 л / мин, изофлурана концентрация: 2-3% (или ниже).
- Приобретать изображения с помощью флуоресценции время экспозиции 5-15 сек.
- Выполнить анализ и обработки изображений, включая коррекцию фона или настройки контрастности.
3. Флуоресценции Экс естественных
HerDox флуоресценции могут быть отображены в опухолях и конкретных органов (в том числе печень, почки, селезенку, сердце, скелетные мышцы) собирают из мышей умерщвляли через 24 часа после последнего (день 7) введение HerDox.
- Включите многомодового оптического В естественных изображений.
- Выберите выбросов полосовой фильтр (580 нм ± 20 нм) для доксорубицина флуоресценции.
- Включите Криптон Аргон-лазерная и поместите полосовой фильтр возбуждения (488 нм ± 10 нм) на лазерный оптический путь.
- Место опухолей и конкретных органов, расположенных на чашки Петри в изображения камеры OF многомодового оптического В естественных изображений.
- Приобретать флуоресцентные изображения тканей с использованием Выдержка 5-15 сек. Пример начальной флуоресценции захвата изображений показано на фиг.2а. Повторите то же самое, используя пустой чашки Петри, который будет служить в качестве фона (рис. 2б).
- Выполнить анализ и обработки изображений, включая коррекцию фона или настройки контрастности. Пример исправленное изображение показано на рисунке 2, в результате вычитания 2б из фиг.2а.
4. На месте конфокальной микроскопии опухоли
На месте конфокальной микроскопии позволяет обнаружения и анализа накопления в опухоли HerDox на клеточном уровне.
- Включите микроскоп Leica конфокальной SPE.
- Выберите 488 нм лазерный свет для возбуждения доксорубицина и длины волн излучения (560-620 нм) для доксорубицинафлуоресценции.
- Выберите 40X или 63X объективных и падение нефти погружения на линзу объектива.
- Извлечение свежей опухолей мышей умерщвляли, которые ранее получили HerDox и макет процедуры, как описано в процедуре 2.
- Место опухоли на чашки Петри на льду, чтобы избежать деградации тканей, а затем передать опухоли в камеру Delta T для конфокальной микроскопии.
- Приобретать конфокальной изображения опухоли на последовательном Фокусное глубинах (шаг: 1 мкм, толщина: 20 мкм). Примером последовательного приобретенные изображения вдоль оси показано на рисунке 3, левой панели.
- Выполнение максимальной интенсивностью г-проекции изображений. Проекция максимальной интенсивности Z-стеки изображений показано на рисунке 3, правая панель.
- Рассчитать означает интенсивности флуоресценции от максимальной интенсивности Z -. Проекцию изображения Среднее интенсивности флуоресценции изображения через общий поле зрения были вычислитьD Использование ImageJ.
5. Логометрический спектральных изображений и анализа
Логометрический спектральных изображений и анализа позволяет дискриминации между Dox флуоресценции и флуоресценции.
- Включение лазерной сканирующей флуоресцентной конфокальной микроскопии.
- Получить 15 изображений HerDox-обработанных и необработанных опухолей на заданной глубине в спектральном диапазоне 510-650 нм с шагом 10 нм, возбуждение при 488 нм светом с помощью SPE Leica конфокальной микроскопии.
- Подготовьте 100 мкМ раствора доксорубицина.
- Выполнение спектральных изображений 100 мкМ раствор доксорубицина, чтобы получить чистый спектральными характеристиками Dox флуоресценции (спектральный диапазон 510-650 нм, размер шага: 10 нм). Типичные результаты получения изображения из спектральных изображений и в результате спектр флуоресценции построена в виде графика представлены на рисунке 4.
- Приобретать аутофлюоресценция спектральные подписи из образа CВБО (спектральный диапазон: 510-650 нм, размер шага: 10 нм), полученных спектральных изображений необработанных опухолей. Типичные результаты получения изображения из спектральных изображений и в результате спектр флуоресценции построена в виде графика представлены на рисунке 5.
- Генерирования четырех ссылкой спектральные характеристики (чистый аутофлюоресценция, 0.1.doxorubin 0,9. Аутофлюоресценция, 0,2. Доксорубицин 0,8. Аутофлюоресценция, 0.3.doxorubin 0,7. Аутофлюоресценция) с помощью программы мы разработали 9. Типичная кривая четыре ссылкой спектральные характеристики показан на рисунке 6.
- Выполнение спектральной классификации изображений, как это определено опорной спектральной сигнатуры через евклидова мера расстояния с использованием программы мы ранее разработанных 9.
- Выполните линейная спектральная расслоении эти изображения с помощью спектрального программы расслоении (плагин в ImageJ) мы разработали 7, 10, для сравнения с логометрических спектральных изображений и анализа. Электроннойнапр разделения HerDox флуоресценции аутофлюоресценция линейной спектральной несмешивания показано на рисунке 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана в естественных прототипов оптических изображений, который был построен с целью получения изображения под несколькими условиями, в том числе интенсивность флуоресценции, спектральных, жизни, 2-фотона, внутри-жизненно конфокальной и биолюминесценции изображений. Кроме того, охлажденный высокочувствительные камеры и высоковольтные линии мощности лазера включены в эту систему дает более высокую контрастность изображения флуоресценции по сравнению с коммерческими оптической системы визуализации 11, особенно в естественных условиях обнаружение флуоресценции доксорубицина. Следовательно, эта система имеет решающее значение для использования в настоящем исследовании приобрести несколько дополнительных точек данных в оценке HerDox в естественных условиях.
Высокая флуоресценции опухоли показано на рисунке 2 обычно происходит после системной доставки HerDox, и свидетельствует о его опухолью льготных таргетинга. Флуоресценции обнаружен в скелетных мышцах нетипична и может привести сюдам аномалии в процедуре инъекции (например, внутривенное слишком близко к телу). Качественно, изображение, показанное на рисунке 2а имеет низкий фон. Тем не менее, для выполнения количественного анализа относительных интенсивностей флуоресценции тканей, необходимо выполнить фоне коррекции с использованием пустую чашку, как показано на фиг.2b. Это может привести к "с поправкой на фон" изображение, показанное на рисунке 2, в который имеет более высокий фоновый сигнал на краю изображения по сравнению с исходной (рис. 2), так как фоновое изображение (Рис. 2b) имеет более низкую интенсивность на краю изображения. Таким образом, в то время как коррекция фона может дать увеличение сигнала на краю изображения, это является необходимым шагом для последующего количественного анализа.
Для того чтобы получить количественную оценку HerDox накопления в опухоли, конфокальной флуоресцентной изображения были получены при различных фокусныхглубинах в местах последующей максимальной интенсивности Z-проекции изображения (рис. 3), а также приобретение средней интенсивности флуоресценции проецируемого изображения. Полученное изображение содержит HerDox накопления информации на указанном г-глубины на каждом пикселе, и, таким образом среднее значение интенсивности флуоресценции отражает общий HerDox накопления в опухоли на различных глубинах количественно.
Чтобы отличить HerDox флуоресценции от флуоресценции в опухоли и количественно различать два с высокой специфичностью, радиометрический спектральных изображений и анализ. Чистых спектральных подписей для доксорубицина и флуоресценции получены спектральных изображений показаны на рисунках 4 и 5, соответственно. Ссылка спектральные характеристики (рис. 6) также были созданы путем смешивания различных соотношениях чистых спектральных сигнатур с помощью программы мы разработали 9. Каждый ссылки на веб-сть спектральные подписи здесь представляет относительную флуоресценцию HerDox накапливается в опухоли по отношению к флуоресценции. Спектральных изображений классификации (данные не показали в этой статье) показали лучшие количественные накопления HerDox 7 по сравнению с спектральной несмешанными изображение, полученное с помощью чистого ссылкой спектральные характеристики (рис. 7). Цифры 4-7 представляют собой типичные результаты при выполнении логометрических спектральных изображений и анализа.
Рисунок 1. В естественных условиях оптического томографа. Оптической системы с интенсивностью флуоресценции, спектральных, флуоресценции и прижизненной конфокальной возможности визуализации должны быть использованы. Многомодовые оптические системы формирования изображения, используемые здесь показано, и была описывающиеЭд ранее 8. Изображение предоставлена с любезного разрешения от Springer Science & Business Media BV: Хван, JY и др., Mol.. Изображениями Biol., 14, 431-42 (2012).
Рисунок 2. Представитель интенсивность флуоресценции изображения внутренних органов и опухоли извлекают из мыши получают HerDox. Тканей и опухолей собирали из эвтаназии мышей на 24 часа после последнего (День 7) инъекции HerDox Флуоресцентные изображения интенсивностью до и после коррекции фона (б) представлены (а) и (с) соответственно. Нажмите здесь, чтобы увеличить выяснить .
Рисунок 3. Максимальная интенсивность г-проекцию изображения, полученные при последовательном г-глубины. Сложены изображения показанные слева являются репрезентативными для сканирования конфокальной опухолевой ткани, полученных при последовательном глубине 1 мкм. Изображение справа показывает составление сложены изображения слева.
Рисунок 4. Приобретение чистые спектральные подписи для доксорубицина. После того, как изображения доксорубицина раствор были получены при последовательном длинах волн в пределах 510-650 нм с шагом размером 10 нм (слева), чистые спектральные подписи для доксорубицина был получен с помощью программы мы разработали. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 5. Приобретение чистые спектральные подписи для флуоресценции. После того, как изображения необработанного опухоли были получены при последовательном длинах волн в пределах 510-650 нм, с шагом-размер 10 нм (слева), чистые спектральные подписи для аутофлюоресценция был получен с помощью программы мы разработали. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
load/50396/50396fig6.jpg "/>
Рисунок 6. Четыре ссылкой спектральных подписей за логометрических спектральных изображений и анализа. Опорной спектральной подписи были созданы путем смешивания чистых спектральных подписей, используя программу мы разработали. Зеленая сплошная линия представляет собой чистый аутофлюоресценция, красная сплошная линия 0.1.doxorubin 0,9. Аутофлюоресценция, окрашенный в синий цвет сплошной линией 0.2. доксорубицин 0,8. аутофлюоресценция, и голубая цветная сплошная линия 0.3.doxorubin 0,7. аутофлюоресценция соответственно. Рисунок воспроизведен из авторов предыдущей работы: Хван, JY и др., PLoS One 7 (4), (2012)...
Рисунок 7. HerDox флуоресценцию в ткани до и после спектрального ООН-перемешивания. После получения спектральных подписей Dox и флуоресценции, тыс.электронной Dox сигналы разделяются с использованием линейных спектральных не-смешивания 12,13. На рисунке показана аутофлюоресценция и HerDox смешанные изображения перед ООН-спектрального смешивания и отделенный HerDox изображения после спектрального ООН-перемешивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dox флуоресценция может быть обнаружена в естественных условиях использования многомодового Imager, когда подкожные опухоли. Тем не менее, терапевтически эффективной дозы HerDox (0,004 мг / кг) ниже порога обнаружения после однократной дозы. В противоположность этому, после 7 ежедневных инъекций (1 раз в день в течение 7 дней), опухоли накопление и удержание частиц достаточным, чтобы позволить визуализации флуоресценции доксорубицин.
Очень важно при работе с Dox или любой другой для флуорофором в естественных изображений, что чистая технология. Капли на внешней мыши следует избегать, так как томографа обнаружит флуоресценции на внешней стороне кожи без различения, является ли доксорубицин является внешним или внутренним. Аналогично, доксорубицин загрязнения на перчатки можно оставить флуоресцентный знаков на внешней мыши во время обращения с животными, тем самым вызывая ошибочных флуоресценции.
В многомодовом оптическом системылазерный луч используется для возбуждения HerDox. Лазерный луч, как правило, имеет гауссово профиль. Таким образом, для равномерного возбуждения образцов интересов, оптические диффузоры используются. Тем не менее, рассеянный свет лазерных несколько сохраняет гауссов профиль пучка. Таким образом, для идеального количественного анализа, коррекция фона должны быть выполнены. Перед коррекцией и фоновые изображения обычно имеют глубину 16 бит. Поэтому перед фоном коррекция выполняется, глубины изображения должны быть преобразованы в 32 бита для того, чтобы избежать нежелательных ошибок несоответствие глубины изображения между результирующий и входные изображения.
В приобретении фоновое изображение, черная бумага (Artagain) ранее надеть изображений пластины для предотвращения отражения освещения перед выполнением флуоресценции. Тем не менее, так как камера очень чувствительна, сигналов низкого фона из черной бумаги был обнаружен с помощью камеры. Таким образом, фоновыйсигналов, показанных на рисунке 2 пришел из черной бумаги, а не из пустой чашки Петри.
Высокой концентрации доксорубицина раствор использовали для получения чистого спектральные характеристики с высокой точностью. Кроме того, мы рассмотрели спектральное разрешение, при котором система способна обнаруживать достаточно флуоресценции от образца для получения надежных спектральных подписей. В результате спектральное разрешение было настроено на 10 нм. Здесь мы обнаружили, что под микроскопом установление более высоких спектральное разрешение (<10 нм) не смогли обнаружить достаточное флуоресценции для обеспечения надежных спектральных подписей. С чистых спектральных подписей, мы могли бы создать несколько логометрических спектральные характеристики (рис. 6). В частности, можно количественно различать HerDox флуоресцентных сигналов от флуоресценции соответствующими логометрических спектральные характеристики 7. Спектральные несмешанные изображение, полученное с чистым спектральными характеристикамиS (рис. 7) был похож на классифицированного изображения на двух опорных спектральных подписей (синий:. 0.2.Dox 0,8 Autofl и зеленым:.. Autofl). В целом, логометрических конфокальной / спектральных изображений предоставили более количественную информацию о HerDox накопления в опухолевых клетках в местах с высоким разрешением, таким образом, проверке ее полезности в анализе наночастиц доставлены опухоли HER2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор, Даниэль Фаркаш, является председателем Спектральный молекулярной визуализации. Остальные авторы не имеют конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась грантами для ЛКМ-K от Национального института здоровья / Национальный Институт Рака (R01CA129822 и R01CA140995). Доктор Медина-Kauwe спасибо C. Rey, М. М-Kauwe и Д. Revetto за постоянную поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence laser scanning confocal microscope | Leica | SPE | |
| In Vivo Optical Imager | Spectral Molecular Imaging | Multimode In Vivo Optical Imager | |
| Doxorubicin-HCl | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week | Charles River | Strain code 088 | |
| MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells | NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository | 0507292 | |
| 3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle | BD | 309301 | |
| Delta T chamber | Bioptechs | 04200417B |
References
- Agadjanian, H., Chu, D., et al. Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles. Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).
- Agadjanian, H., Ma, J., et al. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).
- Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins. Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).
- Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).
- Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. 3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).
- Rentsendorj, A., Xie, J., et al. Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer. Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).
- Hwang, J. Y., Park, J., et al. Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles. PLoS ONE. 7 (4), e34463 (2012).
- Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007 (2011).
- Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. Biomedical Optical Imaging. , Oxford University Press. New York. (2009).
- Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. Multimode optical imaging of small animals: development and applications. Proc. of SPIE. 6411, (2007).
- Ducros, M., Moreaux, L., et al. Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo. PLoS One. 4 (2), e4418 (2009).
- Zimmermann, T. Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).
