Analyse av målrettet Viral Protein Nanopartikler Levert til HER2 + Svulster

Summary

Denne artikkelen detaljer prosedyrer for optisk avbildning analyse av tumor-målrettet nanopartikler, HerDox. Spesielt er detaljert bruk av multimodus bildebehandlingsenhet for detektering av tumor målretting og vurdering av tumor penetrasjon beskrevet her.

Abstract

Den HER2 + tumor-rettet nanopartikler, HerDox, oppviser tumor-preferensiell akkumulering og tumor-vekst ablasjon i en dyremodell av HER2 + kreft. HerDox er dannet av ikke-kovalente egen sammensetning av en svulst målrettet celle penetrasjon protein med kjemoterapi agent, doksorubicin, via en liten nukleinsyre linkeren. En kombinasjon av elektrofil, interkalering, og oligomerisering interaksjoner lette selv-sammenstilling til rundt 10-20 nm partikler. HerDox utviser stabilitet i blod så vel som i utvidet lagring ved forskjellige temperaturer. Systemisk levering av HerDox i tumor-bærende mus resultater i tumor-celledød uten påvisbare negative effekter på ikke-tumor vev, inkludert hjertet og leveren (som gjennomgår merket skade ved vilkårlige doksorubicin). HER2 høyde forenkler rettet til celler som uttrykker human epidermal vekstfaktor reseptor, derav svulster som viser forhøyede HER2 nivåer viser større opphopning av HerDox sammenlignet med celler uttrykksynge lavere nivåer, både in vitro og in vivo. Fluorescensintensitet bildebehandling kombinert med in situ konfokal og spektralanalyse har tillatt oss å bekrefte in vivo tumor målretting og svulst celle penetrasjon av HerDox etter systemisk levering. Her har vi detalj våre metoder for å vurdere svulst målretting via multimode bildebehandling etter systemisk levering.

Introduction

Tumor-målretting av kjemoterapi har potensial til å eliminere kreftceller ved lavere dose i forhold til uønskede stoffer fordi mer av det leverte terapi kan samle på sitt mottakeren i stedet distribuere til ikke-svulstvev. Ettersom den sistnevnte situasjon vil fortynne ut effekten av medikamentet og således kreve høyere doser for å være effektive, har tumor-targeting både terapeutiske og sikkerhet fordeler fremfor standard ikke-målrettet behandling.

Målretting kjemoterapi ved innkapsling i selvkonfeksjonerte nanopartikler gjør at stoffet skal forbli kjemisk uendret i motsetning til legemidler som er kovalent knyttet til målretting molekyler. Som sådan kopling har potensial til å endre aktiviteten av både medikamentet og målretting molekyl, ikke-kovalente montering tillater medikament potens til å bli beholdt.

Vi har tidligere vist at romanen tre-komponent, selv-montert kompleks, HerDox, mål HER2 + tumorer en. HerDox er dannet gjennom ikke-kovalente interaksjoner mellom den reseptor-bindende celle-penetrasjon protein, HerPBK10, og det kjemoterapeutiske middel, doksorubicin (Dox), via en liten nukleinsyre linkeren. HerPBK10 binder human epidermal vekstfaktorreseptor (HER) og utløser reseptormediert endocytose ^2-4, mens endosomale membran penetrasjon oppnås ved hjelp av inkorporering av adenovirus-avledet Penton basen capsidproteinet ^4-6. Et positivt ladet domene på protein muliggjør nukleinsyre ^{4. binding, 5,} gjennom hvilke DNA-interkalerte Dox kan transporteres for målrettet levering. Electrophilic, interkalering, og muligens protein oligomerization interaksjoner rette for selvbygging til runde 10-20 nm partikler som er stabile i blodet og under utvidet lagring ved forskjellige temperaturer ^en. Fortrinnsrett rettet til HER2 + kreftceller er tilrettelagt av den forbedrede ligand affinitet når HER2 er forhøyet.

Våre tidligere undersøkelser har vist at systemisk levering av HerDox utbytter preferensiell akkumulering i tumorer enn ikke-tumorvev og i forhold til ^en ikke-målrettet Dox, og inntrengning i tumorceller in vivo ^7.. Vi har observert at HerDox utgivelser Dox etter svulst celle oppføring, slik at Dox opphopning inn i kjernen ^en. Tumor-opphopning synes å korrelere med receptor nivå, så relativt lave HER2-uttrykke svulster akkumulere mindre HerDox sammenlignet med de med relativt høyere HER2 nivå ^1. Videre viser den effektive celledød konsentrasjon en invers korrelasjon med HER2-skjerm på cellelinjer som uttrykker ulike celleoverflaten HER2 nivå ^1. HerDox viser en terapeutisk og sikkerhet fordel over vilkårlige Dox, som tumor drap skjer på over 10 ganger lavere dose i forhold til untargeted medikament og gir ingen påvisbar skadelig virkning på hjertet (påvist ved ekkokardiografi og histologiske flekk) eller leveren (påvist ved TUNEL flekk) vev, i motsetning til vilkårlige Dox ^1.. Til tross for sin avledning fra en viral capsidproteinet, viser HerPBK10 ingen påviselig immunogenicity ved terapeutiske nivåer ^to. Mens pre-eksisterende antistoffer mot hele adenovirus kan gjenkjenne HerPBK10, er de ikke i stand til å hindre celle binding ^to.

Tumor volum målt over tid er en standard metode for å vurdere terapeutiske effekten av målrettet terapi, og har vært ansatt for å vurdere den terapeutiske effekten av HerDox. Supplere denne tilnærmingen med in vivo og ex vivo fluorescens intensitet imaging har tillatt oss til bedre å vurdere målretting effektivitet ^7. Vi har spesielt integrert i situ confocal avbildning av utskårende svulster med spektral analyse av Dox fluorescens for å bekrefte at HerDox ingent bare akkumulert på svulster in vivo, men trengt inn i tumorceller og levert Dox inn i cytoplasma og cellekjernen ^7. Spektralanalyse dessuten gjort oss i stand til å skille Dox fluorescens fra autofluorescence ^7.

Her viser vi nærmere vår tilnærming for å vurdere HerDox in vivo etter systemisk levering, og viktigst, for å vurdere målretting gjennom multimode imaging metoder og analyser.

Protocol

En. Systemisk levering In vivo

1. Bland nok HerDox med sterilt saltvann for å likestille 0,2 ml av en 0,004 mg / kg dose av HerDox per injeksjon for en 6-8 uker gamle NU / NU mus bærende underhudssykdommer bilaterale flanke xenografttumorer.
2. Forsiktig trekke HerDox blandingen i en 3/10 cc insulin sprøyte med 29g nål, unngå bobler.
3. Anestesi ble indusert ved kort eksponering isofluran i induksjonsovn kammer utstyrt med en gass avsugsystem (oksygen strømningshastigheter: 0,5-1 l / min, isofluran konsentrasjon: 3-4% (eller lavere).
4. Injiser hele blandingen inn i halevenen i en bedøvet mus (0,2 ml pr injeksjon). IV injeksjon kan også utføres i en behersket, unanesthetized mus.
5. Gjentatte injeksjoner på samme mus i seks sekvensielle dager, en gang per dag.

2. Fluorescens Imaging In vivo

Oppbyggingen av HerDox fluorescens i svulster kanpåvises ved den siste dagen av injeksjon (Dag 7) med en multimode imager. Prosedyrene nedenfor medfører bruk av en tilpasset makro-belysning og deteksjon system (figur 1) ^8..

1. Slå på Multimode In vivo optisk Imager.
2. Velg en emisjon båndpassfilter (590 nm ± 30 nm) egnet for doxorubicin fluorescensdeteksjon.
3. Slå på Argon-Krypton laser og plassere en eksitasjon båndpassfilter (488 nm ± 10 nm) ved laser optiske banen.
4. Slå på anestesi-systemet og deretter plassere en mus inn i bedøvelse kammer (Oksygenstrømmen priser: 0,5-1 L / min, isofluran konsentrasjon: 3-4% (eller lavere) er utstyrt med en gass avsugsystem.
5. Overfør musen fra bedøvelse kammer til bildebehandling kammer av Multimode In vivo optisk Imager når musen er bedøvet.
6. Plasser en nosecone over nesen av musen og åpne flyten å administrere kontinuerlig anesthesia under bildeopptak (Oksygenstrømmen priser: 0,5-1 L / min, isofluran konsentrasjon: 2-3% (eller lavere).
7. Erverve fluorescens bilder med en eksponeringstid på 5-15 sek.
8. Utfør bildeanalyse og foredling herunder bakgrunn retting eller kontrast justering.

3. Fluorescens Imaging Ex vivo

HerDox fluorescens kan avbildes i svulster og spesifikke organer (inkludert lever, nyre, milt, hjerte og skjelettmuskulatur) høstet fra euthanized mus på 24 timer etter siste (Dag 7) injeksjon av HerDox.

1. Slå på Multimode In vivo optisk Imager.
2. Velg en emisjon båndpassfilter (580 nm ± 20 nm) for Doxorubicin fluorescensdeteksjon.
3. Slå på Argon-Krypton laser og plassere en eksitasjon båndpassfilter (488 nm ± 10 nm) ved laser optiske banen.
4. Plasser svulster og spesifikke organer ordnet på en Petri-tallerken til bildebehandling kammeret of Multimode In vivo optisk Imager.
5. Erverve fluorescens bilder av vev ved hjelp av en eksponeringstid på 5-15 sek. Et eksempel på en innledende fluorescens bildeopptak er vist i figur 2a. Gjenta det samme med en tom Petri-fatet, som vil tjene som bakgrunn (Figur 2b).
6. Utfør bildeanalyse og foredling herunder bakgrunn retting eller kontrast justering. Et eksempel på et korrigert bilde er vist i figur 2c, noe som resulterer fra subtraksjon av figur 2b fra figur 2a.

4. In situ Confocal Imaging av Svulster

In situ confocal avbildning gjør deteksjon og analyse av HerDox svulst opphopning på cellenivå.

1. Slå på en Leica SPE konfokalmikroskop.
2. Velg 488 nm laserlys for eksitasjon av doksorubicin og emisjon bølgelengder (560-620 nm) for doksorubicinfluorescensdeteksjon.
3. Velg en 40X eller 63X objektiv og slipp immersjonsolje på objektiv.
4. Utdrag ferske svulster fra euthanized mus som tidligere har fått HerDox og mock behandlinger som beskrevet i prosedyren ^to.
5. Plasser svulster på en Petri-tallerken på is for å unngå vevsnedbrytning, og deretter overføre svulstene til en Delta T kammer for confocal bildebehandling.
6. Erverve confocal bilder av svulster på sekvensielle fokale dyp (trinn størrelse: 1 mikrometer, tykkelse: 20 mikrometer). Et eksempel på sekvensmessig-ervervede bilder langs z-aksen er vist i figur 3, venstre panel.
7. Utfør maksimal intensitet z-projeksjon av bildene. En maksimal intensitet projeksjon av z sammensatte bilder som er vist i figur 3, høyre panel.
8. Beregn bety fluorescensintensiteter om den maksimale intensitet Å -. Projeksjonsbilder Midlere fluorescensintensiteter til bilder over det samlede synsfelt ble beregned hjelp ImageJ.

5. Ratiometrisk Spectral Imaging and Analysis

Ratiometrisk spektral avbildning og analyse tillater diskriminering mellom Dox fluorescens og autofluorescence.

1. Strøm på en laserskanning fluorescens konfokalmikroskop.
2. Skaffe 15 bilder av HerDox-behandlede og ubehandlede tumorer ved en bestemt dybde i det spektrale området fra 510-650 nm, med en trinn-størrelse på 10 nm og eksitasjon ved 488 nm lys ved hjelp av et Leica SPE konfokalmikroskop.
3. Forbered en 100 mikrometer løsning av doksorubicin.
4. Utføre spektral avbildning av 100 uM doksorubicin løsning for å oppnå den rene spektrale signatur av Dox fluorescens (spektralområdet: 510-650 nm, et skritt størrelse: 10 nm). Typiske resultater av bildeopptak fra spektral avbildning og resulterende fluorescensspektre plottet som en graf er vist i figur 4..
5. Erverve autofluorescence spektral signatur fra et bilde cube (spektralområdet: 510-650 nm, et skritt størrelse: 10 nm) fås ved spektral avbildning av ubehandlet svulster. Typiske resultater av bildeopptak fra spektral avbildning og resulterende fluorescensspektre plottet som en graf er vist i figur 5..
6. Generere fire referanse spektrale signaturer (ren autofluorescence, 0,9 0.1.doxorubin. Autofluorescence, 0.2. Doksorubicin 0,8. Autofluorescence, 0,7 0.3.doxorubin. Autofluorescence) ved hjelp av programmet vi utviklet ^ni. En typisk kurve som viser fire referanse spektrale signaturer er vist i figur 6..
7. Utfør spektral klassifisering av bildene som er definert av referansen spektrale signaturer gjennom Euklidsk avstand tiltaket ved hjelp av programmet vi tidligere utviklet ^ni.
8. Utfør lineær spektral unmixing av disse bildene ved hjelp av en spektral unmixing program (plug-in i ImageJ) vi utviklet ^{7, 10,} for sammenligning mot proporsjonal spektral avbildning og analyse. En example å skille HerDox fluorescens fra autofluorescence ved lineær spektral unmixing er vist i Figur 7.

Representative Results

Figur 1 viser in vivo optisk imager prototype, som ble bygget for formålet med bildet oppkjøpet under flere modaliteter, inkludert fluorescensintensitet, spektral, levetid, to-foton, intra-vital konfokal, og Bioluminescens bildebehandling. I tillegg gir den avkjølte høy følsom kamera og High Power Laser linjer innlemmet i dette system med høyere kontrast fluorescens bilder sammenlignet med kommersielle optiske avbildningssystemer ^11, spesielt for in vivo deteksjon av doksorubicin fluorescens. Derfor ble dette system kritisk for bruk i foreliggende studie for å skaffe flere komplementære datapunkter ved vurdering av HerDox in vivo.

Den høye tumor fluorescens vist i figur 2 er typisk etter systemisk levering av HerDox, og en indikasjon på dens tumor-preferensiell målretting. Den fluorescens detektert i skjelettmuskel er atypisk og kan resultere from uregelmessigheter i Injeksjonsprosedyren (dvs. injisere for nær kroppen). Kvalitativt, har bildet vist i figur 2a lav bakgrunn. Men for å utføre en kvantitativ analyse av de relative vev fluorescensintensiteter, er det nødvendig å utføre en korreksjon bakgrunn ved hjelp av en tom tallerken, som vist i figur 2b. Dette kan resultere i en "bakgrunn rettet" image vist i figur 2c som har en høyere bakgrunnssignal ved kanten av bildet i forhold til den opprinnelige (figur 2a) fordi bakgrunnsbildet (figur 2b) har lavere intensiteter ved kanten av image. Således, mens bakgrunnskorrigering kan gi et signal som øker ved kanten av bildet, er dette et nødvendig trinn for etterfølgende kvantitativ analyse.

For å få en kvantitativ vurdering av HerDox akkumulering i tumorer, ble confocal fluorescens bilder fås ved forskjellige brennviddedybder in situ fulgt av maksimal intensitet z-projeksjon av bildene (figur 3), og anskaffelse av det midlere fluorescensintensitet av det projiserte bilde. Den resulterende bildet inneholder HerDox opphopning informasjon over de angitte z-dybder på hver piksel, og dermed gjennomsnittet av de fluorescensintensiteter gjenspeiler generelle HerDox ansamlinger i svulster på forskjellige dybder kvantitativt.

For å skille HerDox fluorescens fra autofluorescence i svulster og kvantitativt diskriminere de to med høy spesifisitet, proporsjonal spektral avbildning og analyse ble utført. De rene spektrale signaturer for doksorubicin og autofluorescens oppnådd ved spektral avbildning er illustrert i figurene 4 og 5, respektivt. Referanse spektrale signaturer (figur 6) ble også laget ved å blande forskjellige forhold mellom den rene spektrale signaturer ved hjelp av programmet vi utviklet ^9.. Hver refereNCE spektral signatur her representerer relativ fluorescens av HerDox akkumulert i svulster med hensyn til autofluorescence. De spektrale klassifisering bilder (data ikke ble vist i denne artikkelen) viste bedre kvantitative HerDox ansamlinger ⁷ i forhold til den spektrale ublandet bilde oppnås ved bruk av de rene referanse spektrale signaturer (figur 7). Tallene 4-7 representerer typiske funn ved utføring proporsjonal spektral avbildning og analyse.

Figur 1. In vivo optisk imager. En optisk imaging system med fluorescens intensitet, spektral, fluorescens levetid og intravital confocal imaging evner må brukes. Den multimode optiske imaging system som brukes her er vist, og har vært described tidligere ^åtte. Bildet gitt med tillatelse fra Springer Science & Business Media BV: Hwang, JY, et al, Mol.. Imaging Biol., 14, 431-42 (2012).

Figur 2. Representative fluorescensintensiteten bilder av indre organer og svulster hentet fra en mus motta HerDox. Vev og svulster ble høstet fra mus avlives ved 24 timer etter den siste (dag 7) injeksjon av HerDox fluorescensintensitet bildene før og etter bakgrunnskorrigering (b) er representert ved (a) og (c), henholdsvis. klikk her for å vise større regne .

Figur 3. Maksimal intensitet z-projeksjon av bildene innhentet ved sekvensielle z-dybder. De stablet bildene som vises til venstre er representativ for de konfokale skanninger av svulstvev oppnådd ved sekvensiell 1 mikrometer dybder. Bildet til høyre viser sammenstillingen av de stablet bildene til venstre.

Figur 4. Erverv av en ren spektral signatur for doksorubicin. Etter at bildene av doksorubicin løsning ble oppnådd ved sekvensielle bølgelengder innenfor 510-650 nm, med en steg-størrelse på 10 nm (til venstre), den rene spektral signatur for doksorubicin ble innhentet bruke programmet vi utviklet. Klikk her for å se større figur .

Figur 5. Erverv av en ren spektral signatur for autofluorescence. Etter at bildene av ubehandlet tumor ble oppnådd ved sekvensielle bølgelengder innenfor 510-650 nm, med en steg-størrelse på 10 nm (til venstre), den rene spektral signatur for autofluorescence ble innhentet ved hjelp av programmet vi utviklet. Klikk her for å se større figur .

load/50396/50396fig6.jpg "/>
Figur 6. Fire referanse spektrale signaturer for proporsjonal spektral avbildning og analyse. Referansegruppene spektrale signaturer ble skapt ved å blande de rene spektrale signaturer ved hjelp av programmet vi utviklet. Den grønne-farget solid linje representerer ren autofluorescence, representerer den rød-farget heltrukket linje 0.1.doxorubin 0,9. Autofluorescence, representerer blå-farget heltrukket linje 0.2. doksorubicin 0,8. autofluorescence, og cyan-farget heltrukket linje 0.3.doxorubin 0,7. autofluorescence, henholdsvis. Figuren er gjengitt fra forfatternes tidligere arbeider: Hwang, JY, et al, PLoS One 7 (4), (2012)...

Figur 7. HerDox fluorescens i vevet før og etter spektral un-blanding. Etter innhenting av spektrale signaturer av Dox og autofluorescence, the Dox signaler blir separert ved hjelp av lineær spektral un-blanding ^12,13. Figuren viser autofluorescence og HerDox blandet bilde før spektral un-blanding og den separerte HerDox bildet etter spektral un-blanding.

Discussion

Dox fluorescens kan påvises in vivo med multimode imager når svulster er underhudsfett. Imidlertid er den terapeutisk effektive dose av HerDox (0,004 mg / kg) under deteksjonsgrensen etter en enkelt dose. I kontrast, etter 7 daglige injeksjoner (1x/day i 7 dager), er svulsten akkumulering og retensjon av partikkelen er tilstrekkelig til å muliggjøre visualisering av Dox fluorescens.

Det er kritisk når man arbeider med Dox eller andre fluoroforen for in vivo avbildning som rene teknikken brukes. Drypper på utsiden av musen bør unngås, da den imager vil detektere fluorescensen på utsiden av huden uten diskriminering hvorvidt Dox er ekstern eller intern. Likeledes kan Dox forurensning på hansker forlate fluorescerende merker på utsiden av musen under håndtering dyr, og dermed forårsaker feilaktige fluorescens deteksjon.

I det multimodus optisk system, enlaserstråle benyttes til magnetisering av HerDox. Laserstrålen har typisk en gaussisk profil. Derfor, for uniform eksitasjon av eksemplarer av interesse, er optiske diffusorer utnyttet. Likevel bevarer diffust laserlys noe gaussisk stråle profil. Således, for ideelle kvantitativ analyse, må bakgrunn korreksjon utføres. Den før-korrigerte og bakgrunnsbilder vanligvis har en dybde på 16 bits. Derfor, før bakgrunnen korreksjon utføres, bør bildet dybde bli konvertert til 32 biter for å unngå uønskede feil fra bildedybde uoverensstemmelse mellom inngang og resulterende bilder.

I oppkjøpet av et bakgrunnsbilde, ble en svart papir (Artagain) tidligere satt på en avbildning plate for å hindre belysning refleksjoner før du utfører fluorescens bildebehandling. Imidlertid, siden kameraet er svært følsom, var lav bakgrunns-signaler fra den svarte papir registreres av kameraet. Derfor bakgrunnensignaler som vises i figur 2 kom fra svart papir i stedet for fra en tom Petri-fatet.

En høy konsentrasjon av doksorubicin-løsning ble benyttet til å oppnå rene spektrale signaturer med høy nøyaktighet. Vi videre undersøkt spektral oppløsning på som systemet er i stand til å oppdage nok fluorescens fra prøven å produsere pålitelige spektrale signaturer. Som et resultat, ble den spektrale oppløsningen innstilt til 10 nm. Her fant vi at mikroskopet under innstilling av høyere spektral oppløsning (<10 nm) ikke kunne påvise tilstrekkelig fluorescens å gi pålitelige spektrale signaturer. Med de rene spektrale signaturer, kan vi generere flere Ratiometrisk spektrale signaturer (figur 6). Spesielt kan vi kvantitativt skille HerDox fluorescens signaler fra autofluorescence av de respektive Ratiometrisk spektrale signaturer ^7. Den spektrale ublandet image oppnådd med ren spektral signaturs (figur 7) var lik den graderte bilde av de to referanse spektrale signaturer (blå:. 0.2.Dox 0,8 Autofl og Grønn:.. Autofl). Til sammen ga proporsjonal konfokal / spektral avbildning mer kvantitativ informasjon om HerDox akkumulering i tumorceller in situ med høy oppløsning, og dermed verifisere dens nytte i analysen av nanopartikler levert til HER2 + svulster.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope	Leica	SPE
In Vivo Optical Imager	Spectral Molecular Imaging	Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl	Sigma-Aldrich	D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week	Charles River	Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells	NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository	0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle	BD	309301
Delta T chamber	Bioptechs	04200417B