Summary
Este artículo detalla los procedimientos para el análisis de imágenes ópticas de las nanopartículas de tumor específico, Herdox. En particular, se describe aquí el uso detallada del dispositivo de formación de imágenes multimodo para la detección de tumor de la orientación y la evaluación de la penetración del tumor.
Abstract
La nanopartícula HER2 + del tumor-específica, Herdox, exhibe acumulación tumoral-preferencial y la ablación de tumores de crecimiento en un modelo animal de cáncer de HER2 +. Herdox está formado por no covalente de auto-ensamblaje de una proteína de penetración celular específica del tumor con el agente de quimioterapia, doxorubicina, a través de un pequeño conector de ácido nucleico. Una combinación de electrofílico, intercalación y las interacciones oligomerización facilitar autoensamblaje en redondo 10-20 nm partículas. Herdox muestra una estabilidad en la sangre, así como en el almacenamiento prolongado a temperaturas diferentes. El suministro sistémico de Herdox en ratones portadores de tumores da como resultado la muerte de las células del tumor, sin efectos adversos detectables en el tejido no tumoral, incluyendo el corazón y el hígado (que se someten a daño marcado por la doxorubicina no dirigidos). HER2 elevación facilita orientación a las células que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano, por lo tanto, los tumores se presentan niveles elevados de HER2 presentan una mayor acumulación de Herdox en comparación con las células de expresióncantar niveles más bajos, tanto in vitro como in vivo. La intensidad de fluorescencia de imagen combinada con el análisis y confocal espectral situ nos ha permitido verificar en el tumor vivo focalización y la penetración de células tumorales de Herdox después de la administración sistémica. A continuación te detallamos los métodos de evaluación de tumor de la orientación a través de imágenes multimodo después de la administración sistémica.
Introduction
Tumor-targeting de la quimioterapia tiene el potencial de eliminar las células cancerosas en dosis más baja en comparación a las drogas no orientados, debido a que más de la terapia administrada se puede acumular en su destino previsto, en lugar de distribuir al tejido no tumoral. A medida que la última situación sería diluir la eficacia de la droga y por lo tanto requieren dosis más altas para ser eficaz, tumor-alcance tiene tanto ventajas terapéuticas y de seguridad más de un tratamiento no específico estándar.
Orientación de la quimioterapia mediante encapsulación en nanopartículas auto-ensambladas permite que el fármaco permanezca sin modificar químicamente en contraste con fármacos que se unen covalentemente a moléculas de direccionamiento. Como tal vinculación tiene el potencial de alterar la actividad de ambos el medicamento y la molécula diana; montaje no covalente permite que la potencia del fármaco a ser retenido.
Hemos demostrado anteriormente que la novela de tres componentes, complejos auto-ensamblado, Herdox, se dirige a los tumores HER2 +
Nuestros estudios previos han demostrado que la administración sistémica de los rendimientos Herdox acumulación preferencial en los tumores de más de tejido no tumoral y en comparación con untargeted Dox 1, y la penetración en las células tumorales in vivo 7. Hemos observado que las liberaciones Herdox Dox después de la entrada de células tumorales, lo que permite la acumulación de Dox en el núcleo 1. Tumor-acumulación parece que se correlaciona con el nivel del receptor, como tumores relativamente bajos que expresan HER2 se acumulan menos Herdox comparación con aquellos con niveles comparativamente más altos HER2 1. Por otra parte, la concentración eficaz la muerte celular presenta una correlación inversa con HER2 visualización en líneas de células tumorales que expresan HER2 superficie celular diferentes niveles 1. Herdox presenta una ventaja terapéutica y la seguridad sobre Dox no directo, como el asesinato del tumor se produce en más de la dosis 10 veces menor en comparación con el untardrogas geted y produce ningún efecto adverso detectable en el corazón (detectado por ecocardiografía y tinción histológica) o tejido del hígado (detectado por tinción de TUNEL), en contraste con Dox no directo 1. A pesar de su derivación de una proteína de la cápside viral, HerPBK10 no exhibe inmunogenicidad detectable a niveles terapéuticos 2. Mientras que los anticuerpos pre-existentes a adenovirus conjunto pueden reconocer HerPBK10, no son capaces de impedir la unión de células 2.
El volumen del tumor medido con el tiempo es un método estándar para evaluar la eficacia terapéutica de terapias dirigidas, y se ha empleado para evaluar la eficacia terapéutica de Herdox. Como complemento de este enfoque con in vivo y ex vivo de imágenes de fluorescencia de intensidad nos ha permitido evaluar mejor la eficiencia del objetivo 7. Hemos integrado específicamente en situ imagen confocal de los tumores extirpados con el análisis espectral de Dox fluorescencia para verificar que no Herdoxt sólo acumula en tumores in vivo, pero penetró en las células tumorales y Dox entregado en el citoplasma y el núcleo 7. El análisis espectral, además, nos ha permitido distinguir la fluorescencia Dox de autofluorescencia 7.
Aquí se demuestra en mayor detalle nuestro enfoque para evaluar Herdox in vivo después de la administración sistémica, y lo más importante, para la evaluación de orientación a través de métodos y análisis de imágenes multimodo.
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Protocol
1. Entrega Sistémica En vivo
- Mezclar suficiente Herdox con solución salina estéril para equiparar 0,2 ml de una mg / kg de dosis de Herdox por inyección de 0.004 para un 6-8 semanas ratón cojinete tumores de xenoinjertos subcutáneos de flanco bilaterales nu / nu viejos.
- Dibujar suavemente la mezcla Herdox en una jeringa de insulina 3/10 cc con una aguja 29G, evitando las burbujas.
- La anestesia se indujo mediante una breve exposición isoflurano en una cámara de inducción equipado con un sistema de barrido de gas (velocidades de flujo de oxígeno: 0,5-1 L / min, la concentración de isoflurano: 3-4% (o inferior).
- Inyectar la mezcla entera en la vena de la cola de un ratón anestesiado (0,2 ml por inyección). Inyección IV también se puede realizar en un restringido, ratón sin anestesiar.
- Repetir las inyecciones en el mismo ratón durante seis días más secuenciales, una vez por día.
2. Fluorescencia de imágenes en vivo
La acumulación de Herdox fluorescencia en los tumores puedeser detectable por el último día de la inyección (Día 7) utilizando un generador de imágenes multimodo. Los siguientes procedimientos implican el uso de un sistema de macro-iluminación y detección personalizada (Figura 1) 8.
- Encienda el Multimodo En vivo Imager óptico.
- Seleccione un filtro de paso de banda de emisión (590 nm ± 30 nm) adecuado para la detección de fluorescencia de la doxorubicina.
- Encienda el láser de Argón Kriptón y coloque un filtro de paso de banda de excitación (488 nm ± 10 nm) en el camino óptico del láser.
- Encienda el sistema de anestesia y luego se coloca un ratón en la cámara anestesiante (caudales de oxígeno: 0,5 a 1 L / min, la concentración de isoflurano: 3-4% (o menos) equipada con un sistema de recogida de gases.
- Transferir el ratón desde la cámara de anestesiar a la cámara de imágenes del Multimodo En vivo Imager óptico cuando el ratón está anestesiado.
- Coloque una ojiva sobre la nariz del ratón y abrir el flujo de administrar anestesia continuasia durante la adquisición de la imagen (caudales de oxígeno: 0,5-1 L / min, la concentración de isoflurano: 2-3% (o inferior).
- Adquirir imágenes de fluorescencia utilizando un tiempo de exposición de 5 a 15 segundos.
- Realizar el análisis y tratamiento de imágenes incluida la corrección de fondo o el ajuste de contraste.
3. Fluorescencia de imágenes ex vivo
Herdox fluorescencia se pueden obtener imágenes de los tumores y los órganos específicos (incluyendo el hígado, riñón, bazo, corazón y músculo esquelético) cosechadas de los ratones sacrificados a las 24 horas después de la inyección final (Día 7) de Herdox.
- Encienda el Multimodo En vivo Imager óptico.
- Seleccione un filtro de paso de banda de emisión (580 nm ± 20 nm) para la detección de fluorescencia doxorrubicina.
- Encienda el láser de Argón Kriptón y coloque un filtro de paso de banda de excitación (488 nm ± 10 nm) en el camino óptico del láser.
- Coloque los tumores y órganos específicos dispuestos en una placa de Petri en la cámara de imágenes of En el Imager óptica multimodo vivo.
- Adquirir imágenes de fluorescencia de los tejidos utilizando un tiempo de exposición de 5 a 15 segundos. Un ejemplo de adquisición de imágenes de fluorescencia inicial se muestra en la Figura 2a. Repita el mismo mediante un placa Petri vacía, lo que servirá de fondo (Figura 2b).
- Realizar el análisis y tratamiento de imágenes incluida la corrección de fondo o el ajuste de contraste. Un ejemplo de una imagen corregida se muestra en la Figura 2c, que resulta de la resta de la figura 2b de la Figura 2a.
4. In situ Imagen confocal de Tumores
En la imagen confocal in situ permite la detección y el análisis de la acumulación tumor Herdox a nivel celular.
- Encienda una SPE microscopio confocal Leica.
- Seleccione 488 luz láser nm para la excitación de la doxorrubicina y la emisión de longitudes de onda (560-620 nm) para la doxorrubicinadetección de fluorescencia.
- Seleccionar un objetivo de 40X o 63X y aceite de inmersión gota en la lente del objetivo.
- Extraer los tumores de los ratones recién sacrificados que hayan recibido previamente tratamientos Herdox y se burlan como se describe en el procedimiento 2.
- Tumores Colocar en una placa de Petri en hielo para evitar la degradación del tejido y, a continuación, transferir los tumores a una cámara de T Delta de imagen confocal.
- Adquirir confocal de imágenes de los tumores a profundidades focales secuenciales (tamaño de paso: 1 m, grueso: 20 micras). Un ejemplo de imágenes secuencialmente-adquiridos a lo largo del eje z se muestra en la Figura 3, panel izquierdo.
- Realizar máxima intensidad z-proyección de las imágenes. Una proyección de intensidad máxima de z-apiladas imágenes se muestra en la Figura 3, panel derecho.
- Cálculo de las intensidades medias de fluorescencia de la intensidad máxima Z -. Imágenes de proyección media de intensidades de fluorescencia de las imágenes sobre el campo de vista global fueron calculard utilizando ImageJ.
5. Spectral Imaging radiométrico y Análisis
Imágenes espectrales y análisis radiométrico permite la discriminación entre Dox fluorescencia y autofluorescencia.
- De alimentación en un microscopio confocal de barrido de fluorescencia láser.
- Adquirir 15 imágenes de los tumores Herdox tratadas y sin tratar a una profundidad especificada en el rango espectral de 510 a 650 nm, con un paso de 10 nm y excitación a 488 nm de luz usando un microscopio confocal Leica SPE.
- Prepare una solución 100 mM de doxorrubicina.
- Realice imagen espectral de la solución de doxorubicina 100 mM para obtener la firma espectral puro Dox fluorescencia (rango espectral: 510 a 650 nm, un tamaño de paso: 10 nm). Los resultados típicos de adquisición de la imagen de formación de imágenes espectrales y espectro de fluorescencia resultante representan como un gráfico se muestra en la Figura 4.
- Adquirir la firma espectral autofluorescencia desde una imagen cube (rango espectral: 510 a 650 nm, un tamaño de paso: 10 nm) obtenida por imágenes espectrales de los tumores no tratados. Los resultados típicos de adquisición de la imagen de formación de imágenes espectrales y espectro de fluorescencia resultante representan como un gráfico se muestra en la Figura 5.
- Generar cuatro firmas espectrales de referencia (autofluorescencia puro, 0.1.doxorubin 0.9. Autofluorescencia, 0.2. Doxorrubicina 0.8. Autofluorescencia, 0.3.doxorubin 0.7. Autofluorescencia) utilizando el programa que desarrollamos 9. Una curva típica que muestra cuatro firmas espectrales de referencia se muestra en la Figura 6.
- Realizar la clasificación espectral de las imágenes tal como se define por las firmas espectrales de referencia a través de medida de la distancia euclidiana utilizando el programa que previamente desarrollado 9.
- Realizar desmezcla espectral lineal de las imágenes mediante el uso de un programa de desmezcla espectral (plug-in en ImageJ) hemos desarrollado 7, 10, para la comparación con la imagen espectral y radiométrica análisis. Un ejemplo de separar fluorescencia Herdox de autofluorescencia por desmezcla espectral lineal se muestra en la Figura 7.
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Representative Results
La Figura 1 muestra el prototipo de imágenes in vivo óptica, que fue construido para el propósito de la adquisición de imágenes bajo múltiples modalidades, incluyendo la intensidad de fluorescencia, espectral, curso de la vida, 2-fotón confocal, intra-vitales, y en imágenes de bioluminiscencia. Además, la alta cámara sensible enfriada y líneas de láser de alta potencia incorporado en este sistema los rendimientos de imágenes de fluorescencia de mayor contraste en comparación con los sistemas de imágenes ópticos comerciales 11, especialmente para la detección in vivo de la fluorescencia de la doxorubicina. Por lo tanto, este sistema era crítico para su uso en el presente estudio para adquirir múltiples puntos de datos complementarios en la evaluación de Herdox in vivo.
La fluorescencia alta del tumor se muestra en la Figura 2 es típico después de la administración sistémica de Herdox, e indicativa de su focalización del tumor-preferencial. La fluorescencia detectada en el músculo esquelético es atípico y puede resultar lado a otrom anomalías en el procedimiento de inyección (es decir, inyectar demasiado cerca del cuerpo). Cualitativamente, la imagen se muestra en la Figura 2a tiene un bajo fondo. Sin embargo, para llevar a cabo un análisis cuantitativo de las intensidades relativas de fluorescencia de tejidos, es necesario realizar una corrección de fondo utilizando un plato de vacío, como se muestra en la Figura 2b. Esto puede resultar en una "corrección de fondo" imagen que se muestra en la Figura 2c que tiene una señal de fondo más alta en el borde de la imagen en comparación con el original (Figura 2a), porque la imagen de fondo (Figura 2b) tiene intensidades más bajas en el borde de la imagen. Por lo tanto, mientras que la corrección de fondo puede producir un aumento de la señal en el borde de la imagen, este es un paso necesario para el análisis cuantitativo posterior.
Con el fin de obtener una evaluación cuantitativa de la acumulación de Herdox en los tumores, imágenes de fluorescencia confocal se obtuvieron en diferentes focalprofundidades in situ seguido de máxima intensidad z-proyección de las imágenes (Figura 3), y la adquisición de la intensidad media de fluorescencia de la imagen proyectada. La imagen resultante contiene la información de acumulación Herdox lo largo de los indicados z profundidades en cada píxel, y por lo tanto el promedio de las intensidades de fluorescencia refleja acumulaciones generales Herdox en los tumores a diferentes profundidades cuantitativamente.
Para distinguir la fluorescencia Herdox de autofluorescencia en los tumores y cuantitativamente discriminar los dos con una alta especificidad, imagen espectral y radiométrica análisis se llevó a cabo. Las firmas espectrales puros para la doxorrubicina y la autofluorescencia obtenida por formación de imágenes espectrales se ilustran en las Figuras 4 y 5, respectivamente. Firmas espectrales de referencia (Figura 6) también fueron creados mediante la mezcla de diferentes proporciones de las firmas espectrales puros utilizando el programa que desarrollamos 9. Cada reference firma espectral aquí representa la fluorescencia relativa de Herdox acumulado en los tumores con respecto a la autofluorescencia. Las imágenes de clasificación espectrales (los datos no se muestran en este documento) mostraron mejores acumulaciones Herdox cuantitativos 7 en comparación con la imagen sin mezclar espectral obtenida mediante el uso de las firmas espectrales puros de referencia (Figura 7). Figuras 4-7 representan resultados típicos cuando se realiza formación de imágenes espectrales radiométrica y el análisis.
Figura 1. En óptico formador de imágenes in vivo. Debe utilizarse un sistema de imagen óptica con la intensidad de fluorescencia, espectral, vida de la fluorescencia y capacidades de imagen confocal intravitales. El sistema de imagen óptica multimodo se utiliza aquí se muestra, y ha estado describiendoed previamente 8. Imagen provista con el permiso de Springer Science & Business Media BV: Hwang, JY, et al, Mol.. Imágenes Biol.., 14, 431-42 (2012).
Figura 2. Imágenes representativas de intensidad de fluorescencia de los órganos internos y los tumores extraídos de un ratón que recibió Herdox. Los tejidos y los tumores fueron cosechadas de los ratones sacrificados a las 24 horas después de la última inyección (día 7) de imágenes de intensidad de fluorescencia Herdox antes y después de la corrección de fondo (b) se representa por (a) y (c), respectivamente. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 3. Intensidad máxima z-proyección de las imágenes obtenidas en Z-profundidades secuenciales. Las imágenes apiladas muestran a la izquierda son representativos de las exploraciones confocal de tejido tumoral obtenido en secuenciales 1 profundidades m. La imagen de la derecha muestra la compilación de las imágenes apiladas en la parte izquierda.
La Figura 4. Adquisición de una firma espectral puro para la doxorrubicina. Después de que las imágenes de la solución de doxorrubicina se obtuvieron en longitudes de onda secuenciales dentro de 510 a 650 nm, con un paso de tamaño de 10 nm (a la izquierda), la firma espectral puro se obtuvo por doxorrubicina utilizando el programa que hemos desarrollado. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 5. Adquisición de una firma espectral puro por autofluorescencia. Después de que las imágenes del tumor sin tratar se obtuvieron en longitudes de onda secuenciales dentro de 510 a 650 nm, con un tamaño de paso de 10 nm (a la izquierda), la firma espectral puro por autofluorescencia se obtuvo usando el programa que desarrollamos. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
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La Figura 6. Cuatro firmas espectrales de referencia para la formación de imágenes espectrales y análisis radiométrico. Las firmas espectrales de referencia fueron creados mediante la mezcla de las firmas espectrales puros utilizando el programa que desarrollamos. La línea continua de color verde representa la autofluorescencia puro, la línea continua de color rojo representa 0.1.doxorubin 0.9. Autofluorescencia, la línea continua de color azul representa 0.2. doxorrubicina 0.8. autofluorescencia y la línea continua de color cian 0.3.doxorubin 0.7. autofluorescencia, respectivamente. La figura se reproduce a partir de los autores de trabajos previos: Hwang, JY, et al, PLoS One 7 (4), (2012)...
Figura 7. Herdox fluorescencia en el tejido antes y después espectral sin mezcla. Después de obtener las firmas espectrales de Dox y autofluorescencia, thseñales e Dox se separan mediante el uso del espectro lineal sin mezclar 12,13. La figura muestra la imagen mezclada autofluorescencia y Herdox antes espectral de la imagen Herdox separado después espectral sin mezcla y sin mezclar.
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Discussion
Dox fluorescencia puede ser detectable in vivo utilizando el generador de imágenes multimodo cuando los tumores son subcutánea. Sin embargo, la dosis terapéuticamente eficaz de Herdox (0,004 mg / kg) está por debajo del umbral de detección después de una sola dosis. En contraste, después de 7 inyecciones diarias (1 vez al día durante 7 días), la acumulación del tumor y la retención de la partícula es suficiente para permitir la visualización de la fluorescencia Dox.
Es de suma importancia cuando se trabaja con Dox o cualquier otro fluoróforo para la formación de imágenes in vivo de que se utiliza una técnica limpia. Gotea sobre el exterior del ratón se debe evitar, como el reproductor de imágenes detectará la fluorescencia en el exterior de la piel sin discriminar si el Dox es externo o interno. Del mismo modo, la contaminación Dox en los guantes puede dejar marcas fluorescentes en el exterior del ratón durante la manipulación de los animales, provocando de este modo la detección de fluorescencia errónea.
En el sistema óptico multimodo, unarayo láser se utiliza para la excitación de Herdox. El haz de láser tiene típicamente un perfil gaussiano. Por lo tanto, para la excitación uniforme de las muestras de interés, se utilizan difusores ópticos. Sin embargo, la luz del láser difusa tanto conserva un perfil de haz gaussiano. Por lo tanto, para el análisis cuantitativo ideal, debe realizarse la corrección de fondo. Las imágenes antes con corrección de fondo y tienen típicamente una profundidad de 16 bits. Por lo tanto, antes de que se lleva a cabo la corrección de fondo, la profundidad de la imagen debe ser convertido a 32 bits con el fin de evitar errores no deseados de la imagen discrepancia entre la profundidad de las imágenes resultantes y de entrada.
En la adquisición de una imagen de fondo, un papel negro (Artagain) fue puesto previamente en una placa de imagen con el fin de evitar las reflexiones de iluminación antes de la realización de imágenes de fluorescencia. Sin embargo, ya que la cámara es muy sensible, las señales de bajo fondo de la de papel negro fue detectado por la cámara. Por lo tanto, el fondoseñales mostradas en la Figura 2 proceden de la papel negro en lugar de a partir de una placa Petri vacía.
Una alta concentración de la solución de doxorrubicina se utilizó para obtener las firmas espectrales puros con una alta precisión. Además, examinó las resoluciones espectrales en el que el sistema es capaz de detectar suficiente fluorescencia de la muestra para producir firmas espectrales fiables. Como resultado de ello, la resolución espectral fue sintonizado a 10 nm. Aquí encontramos que el microscopio bajo la configuración de las resoluciones espectrales mayores (<10 nm) no pudo detectar la fluorescencia suficiente para producir firmas espectrales fiables. Con las firmas espectrales puros, podríamos generar varias firmas espectrales radiométricos (Figura 6). En particular, podríamos distinguir cuantitativamente las señales de fluorescencia Herdox de autofluorescencia por las respectivas firmas espectrales ratiometric 7. La imagen no mezclado espectral obtenida con la firma espectral puros (Figura 7) fue similar a la imagen clasificada por las dos firmas espectrales de referencia (azul:. 0.2.Dox 0.8 Autofl y verde:.. Autofl). En conjunto, la imagen confocal / radiométrica espectral proporcionado más información cuantitativa sobre la acumulación de Herdox en las células tumorales in situ con alta resolución, verificando así su utilidad en el análisis de las nanopartículas entregados a los tumores HER2 +.
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Disclosures
El autor, Daniel Farkas, es Presidente de espectral Imagen Molecular. El resto de autores no tienen intereses en conflicto.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por donaciones a LKM-K de los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Cáncer (R01CA129822 y R01CA140995). Dr. Medina-Kauwe gracias C. Rey, M. M-Kauwe y D. Revetto de apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence laser scanning confocal microscope | Leica | SPE | |
| In Vivo Optical Imager | Spectral Molecular Imaging | Multimode In Vivo Optical Imager | |
| Doxorubicin-HCl | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week | Charles River | Strain code 088 | |
| MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells | NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository | 0507292 | |
| 3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle | BD | 309301 | |
| Delta T chamber | Bioptechs | 04200417B |
References
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