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Bioengineering

लक्षित वायरल प्रोटीन का विश्लेषण HER2 + ट्यूमर को दिया नैनोकणों

doi: 10.3791/50396 Published: June 18, 2013

Summary

इस अनुच्छेद के विवरण ट्यूमर लक्षित nanoparticle, HerDox के ऑप्टिकल इमेजिंग विश्लेषण के लिए प्रक्रियाओं. विशेष रूप से, को लक्षित और ट्यूमर पैठ का आकलन करने के ट्यूमर का पता लगाने के लिए बहुपद्वति इमेजिंग डिवाइस का विस्तृत उपयोग यहाँ वर्णित है.

Abstract

HER2 + ट्यूमर लक्षित nanoparticle, HerDox, HER2 + कैंसर के एक पशु मॉडल में ट्यूमर तरजीही संचय और ट्यूमर के विकास को पृथक दर्शाती है. HerDox एक छोटी न्यूक्लिक एसिड linker के माध्यम से, कीमोथेरपी एजेंट, डॉक्सोरूबिसिन के साथ एक ट्यूमर लक्षित सेल प्रवेश प्रोटीन की गैर सहसंयोजक विधानसभा स्वयं द्वारा बनाई है. इलेक्ट्रोफिलिक, मध्यनिवेश, और oligomerization को बातचीत का एक संयोजन दौर 10-20 एनएम कणों में आत्म विधानसभा की सुविधा. HerDox अलग तापमान पर खून में है और साथ ही विस्तारित भंडारण में स्थिरता दर्शाती है. दिल और जिगर (अलक्षित डॉक्सोरूबिसिन द्वारा चिह्नित क्षति हुई है) सहित गैर ट्यूमर के ऊतक को कोई detectable प्रतिकूल प्रभाव के साथ ट्यूमर कोशिका मृत्यु में ट्यूमर असर चूहों परिणामों में HerDox की प्रणालीगत प्रसव. HER2 के उन्नयन कोशिकाओं अभिव्यक्ति की तुलना में इसलिए बुलंद HER2 के स्तर को प्रदर्शित ट्यूमर HerDox का अधिक से अधिक संचय प्रदर्शन, मानव epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर व्यक्त कोशिकाओं को लक्षित करने की सुविधाइन विट्रो और इन विवो दोनों में निचले स्तर पर, गाते हैं. सीटू confocal और वर्णक्रम विश्लेषण में साथ संयुक्त प्रतिदीप्ति तीव्रता इमेजिंग हमें लक्षित कर विवो ट्यूमर और प्रणालीगत प्रसव के बाद HerDox का ट्यूमर सेल पैठ में सत्यापित करने के लिए अनुमति दी गई है. प्रणालीगत प्रसव के बाद बहुपद्वति इमेजिंग के माध्यम से लक्षित कर ट्यूमर का आकलन करने के लिए यहाँ हम विस्तार हमारे तरीके.

Introduction

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ट्यूमर को लक्षित कीमोथेरेपी के छुड़ाया चिकित्सा के अधिक बल्कि गैर ट्यूमर के ऊतक को वितरित की तुलना में अपने गंतव्य पर जमा कर सकते हैं क्योंकि अलक्षित दवाओं की तुलना में कम मात्रा में कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने की क्षमता है. बाद की स्थिति दवा की प्रभावकारिता बाहर पतला और इस प्रकार अधिक मात्रा प्रभावी होने की आवश्यकता होती है, ट्यूमर लक्ष्यीकरण मानक गैर लक्षित इलाज पर दोनों चिकित्सीय और सुरक्षा फायदे हैं.

आत्म इकट्ठे नैनोकणों में encapsulation के द्वारा कीमोथेरेपी लक्ष्य निर्धारण दवा रासायनिक covalently को लक्षित अणुओं से जुड़े रहे हैं कि दवाओं के विपरीत अपरिवर्तित रहने के लिए अनुमति देता है. इस तरह के संबंध दवा और लक्ष्य अणु दोनों की गतिविधि को बदलने की क्षमता है के रूप में, न सहसंयोजक विधानसभा दवा शक्ति को बनाए रखा जा सकता है.

हम पहले उपन्यास तीन घटक, आत्म इकट्ठे जटिल, HerDox, HER2 + ट्यूमर है कि लक्ष्य से पता चला है 1 सहित, सामान्य ऊतकों बख्शते हुए ट्यूमर के विकास को पृथक elicits. HerDox रिसेप्टर बंधन सेल प्रवेश प्रोटीन, HerPBK10, और chemotherapeutic एजेंट के बीच गैर सहसंयोजक बातचीत के माध्यम से बनाई है, एक छोटा सा न्यूक्लिक एसिड linker के माध्यम से डॉक्सोरूबिसिन (Dox),. Endosomal झिल्ली प्रवेश adenovirus व्युत्पन्न Penton आधार capsid प्रोटीन 4-6 के समावेश के माध्यम से पूरा किया है जबकि HerPBK10, मानव epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर (उसके) बांध और 2-4 रिसेप्टर की मध्यस्थता endocytosis हो सके. प्रोटीन पर एक सकारात्मक आरोप लगाया डोमेन न्यूक्लिक एसिड डीएनए intercalated Dox लक्षित वितरण के लिए ले जाया जा सकता है, जिसके माध्यम से बाध्यकारी 4, 5, सक्षम बनाता है. इलेक्ट्रोफिलिक, मध्यनिवेश, और संभवतः प्रोटीन oligomerization बातचीत अलग तापमान 1 से रक्त में और विस्तारित भंडारण के तहत स्थिर रहे हैं उस दौर 10-20 एनएम कणों में आत्म विधानसभा की सुविधा. तरजीही उसके लिए लक्षित करHER2 के ऊपर उठाया है जब 2 ट्यूमर कोशिकाओं को बढ़ाया ligand के आत्मीयता से मदद की है.

हमारे पिछले अध्ययनों गैर ट्यूमर ऊतक पर ट्यूमर में और तुलना में HerDox पैदावार तरजीही संचय की प्रणालीगत प्रसव विवो 7 में ट्यूमर कोशिकाओं में Dox 1, और प्रवेश अलक्षित को दिखाया है. हमने देखा है कि ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवेश के बाद HerDox विज्ञप्ति Dox, नाभिक 1 में Dox संचय की इजाजत दी. ट्यूमर संचय अपेक्षाकृत कम HER2 व्यक्त ट्यूमर अपेक्षाकृत उच्च HER2 के स्तर को 1 के साथ उन लोगों की तुलना में कम HerDox जमा के रूप में, रिसेप्टर स्तर के साथ सहसंबंधी प्रकट होता है. इसके अलावा, प्रभावी कोशिका मृत्यु एकाग्रता भिन्न कोशिका की सतह HER2 के स्तर को 1 व्यक्त ट्यूमर सेल लाइनों पर HER2 के प्रदर्शन के साथ एक व्युत्क्रम संबंध दर्शाती है. ट्यूमर हत्या 10 गुना कम खुराक से अधिक में होता है के रूप में HerDox अनटार की तुलना में, अलक्षित Dox पर एक चिकित्सीय और सुरक्षा लाभ दर्शातीgeted दवा और अलक्षित Dox 1 के विपरीत, दिल (इकोकार्डियोग्राफी और ऊतकीय दाग से पता लगाया) या यकृत (दाग TUNEL के द्वारा पता लगाया) ऊतक पर कोई detectable प्रतिकूल असर पैदावार. एक वायरल capsid प्रोटीन से इसकी व्युत्पत्ति के बावजूद, HerPBK10 चिकित्सकीय स्तर 2 में कोई detectable प्रतिरक्षाजनकता दर्शाती है. पूरे adenovirus को पूर्व मौजूदा एंटीबॉडी HerPBK10 पहचान सकते हैं, जबकि वे 2 बंधन सेल को रोकने में असमर्थ हैं.

समय पर मापा ट्यूमर मात्रा लक्षित चिकित्सा विज्ञान की चिकित्सीय प्रभावकारिता का आकलन करने का एक मानक तरीका है, और HerDox की चिकित्सीय प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए नियोजित किया गया है. Vivo और पूर्व vivo प्रतिदीप्ति तीव्रता इमेजिंग में साथ इस दृष्टिकोण सप्लीमेंट बेहतर दक्षता 7 को निशाना बनाने का आकलन करने के लिए हमें की अनुमति दी है. हम विशेष रूप से उस HerDox कोई सत्यापित करने Dox प्रतिदीप्ति के वर्णक्रम विश्लेषण के साथ excised ट्यूमर के सीटू confocal इमेजिंग में एकीकृत हैटी केवल vivo में ट्यूमर में संचित लेकिन cytoplasm और नाभिक 7 में ट्यूमर कोशिकाओं और वितरित Dox में प्रवेश. वर्णक्रम विश्लेषण इसके अलावा हमें autofluorescence 7 से Dox प्रतिदीप्ति अंतर करने में सक्षम होना चाहिए.

यहाँ हम प्रणालीगत प्रसव के बाद vivo में HerDox का आकलन करने के लिए अधिक से अधिक विस्तार में हमारे दृष्टिकोण का प्रदर्शन, और सबसे महत्वपूर्ण बात का आकलन करने के लिए बहुपद्वति इमेजिंग तरीकों और विश्लेषण के माध्यम से निशाना.

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Protocol

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1. विवो में प्रणालीगत डिलिवरी

  1. एक 6-8 सप्ताह पुराने परमाणु / परमाणु माउस असर चमड़े के नीचे द्विपक्षीय पार्श्व xenograft ट्यूमर के लिए इंजेक्शन प्रति HerDox की एक 0.004 मिलीग्राम / किग्रा खुराक की 0.2 मिलीलीटर समानता बाँझ खारा के साथ पर्याप्त HerDox मिलाएं.
  2. धीरे बुलबुले से परहेज, एक 29G सुई के साथ लगे एक 3/10 सीसी इंसुलिन सिरिंज में HerDox मिश्रण आकर्षित.
  3. 0.5-1 एल / मिनट, isoflurane एकाग्रता: 3-4% (या कम) संज्ञाहरण एक गैस सफाई व्यवस्था (आक्सीजन के प्रवाह की दर के साथ सुसज्जित एक प्रेरण कक्ष में संक्षिप्त isoflurane के जोखिम से प्रेरित है.
  4. एक anesthetized माउस (इंजेक्शन प्रति 0.2 मिलीग्राम) की पूंछ नस में पूरे मिश्रण इंजेक्षन. चतुर्थ इंजेक्शन भी एक संयमित, unanesthetized माउस में प्रदर्शन किया जा सकता है.
  5. एक बार प्रति दिन, छह और अनुक्रमिक दिनों के लिए ही माउस पर इंजेक्शन दोहराएँ.

2. विवो में प्रतिदीप्ति इमेजिंग

ट्यूमर में HerDox प्रतिदीप्ति का संचय कर सकते हैंएक बहुपद्वति इमेजर का उपयोग कर इंजेक्शन के अंतिम दिन (7 दिन) द्वारा detectable हो. नीचे प्रक्रियाओं एक स्वनिर्धारित स्थूल रोशनी और पहचान प्रणाली (चित्रा 1) 8 का उपयोग करना पड़ेगा.

  1. विवो ऑप्टिकल Imager में बहुपद्वति पर मुड़ें.
  2. डॉक्सोरूबिसिन प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए अनुकूल एक उत्सर्जन bandpass फिल्टर (590 एनएम ± 30 एनएम) का चयन करें.
  3. आर्गन, क्रिप्टन लेजर पर मुड़ें और लेजर ऑप्टिकल पथ पर एक उत्तेजना bandpass फिल्टर (488 एनएम ± 10 एनएम) जगह है.
  4. संज्ञाहरण प्रणाली पर बारी और फिर anesthetizing कक्ष (ऑक्सीजन का प्रवाह दरों में एक माउस जगह: 0.5-1 एल / मिनट, isoflurane एकाग्रता: 3-4% (या कम) एक गैस सफाई व्यवस्था से लैस.
  5. Anesthetizing कक्ष से माउस anesthetized है जब विवो ऑप्टिकल Imager में बहुपद्वति की इमेजिंग चैम्बर के लिए माउस स्थानांतरण.
  6. माउस की नाक पर एक nosecone प्लेस और निरंतर anesthe प्रशासन के लिए प्रवाह खुलाछवि अधिग्रहण के दौरान SIA (ऑक्सीजन प्रवाह दर: 0.5-1 एल / मिनट, isoflurane एकाग्रता: 2-3% (या कम).
  7. 5-15 सेकंड के एक जोखिम समय का उपयोग कर प्रतिदीप्ति छवियों मोल.
  8. पृष्ठभूमि सुधार या विपरीत समायोजन सहित छवि विश्लेषण और प्रसंस्करण प्रदर्शन करना.

3. प्रतिदीप्ति इमेजिंग पूर्व vivo

HerDox प्रतिदीप्ति ट्यूमर और विशिष्ट अंगों में imaged किया जा सकता है (जिगर सहित, गुर्दा, तिल्ली, दिल, और कंकाल की मांसपेशी) HerDox के अंतिम दिवस (7) इंजेक्शन के बाद 24 घंटे में euthanized चूहों से काटा.

  1. विवो ऑप्टिकल Imager में बहुपद्वति पर मुड़ें.
  2. डॉक्सोरूबिसिन प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए एक उत्सर्जन bandpass फिल्टर (580 एनएम ± 20 एनएम) का चयन करें.
  3. आर्गन, क्रिप्टन लेजर पर मुड़ें और लेजर ऑप्टिकल पथ पर एक उत्तेजना bandpass फिल्टर (488 एनएम ± 10 एनएम) जगह है.
  4. प्लेस ट्यूमर और विशिष्ट अंगों इमेजिंग कक्ष ओ में एक पेट्री डिश पर व्यवस्थाच विवो ऑप्टिकल Imager में बहुपद्वति.
  5. 5-15 सेकंड के एक जोखिम समय का उपयोग करते हुए ऊतकों की प्रतिदीप्ति छवियों मोल. प्रारंभिक प्रतिदीप्ति छवि अधिग्रहण का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. पृष्ठभूमि (चित्रा 2 बी) के रूप में काम करेगा, जो पेट्री डिश के एक खाली का उपयोग कर एक ही दोहराएँ.
  6. पृष्ठभूमि सुधार या विपरीत समायोजन सहित छवि विश्लेषण और प्रसंस्करण प्रदर्शन करना. एक सही छवि का एक उदाहरण चित्रा 2a से चित्रा 2b का घटाव से उत्पन्न, चित्रा 2c में दिखाया गया है.

4. ट्यूमर का सीटू confocal इमेजिंग में

सीटू confocal इमेजिंग में सेलुलर स्तर पर पता लगाने और HerDox ट्यूमर संचय के विश्लेषण की अनुमति देता है.

  1. एक Leica एसपीई confocal खुर्दबीन पर मुड़ें.
  2. डॉक्सोरूबिसिन के लिए डॉक्सोरूबिसिन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (560-620 एनएम) की उत्तेजना के लिए 488 एनएम लेजर प्रकाश का चयन करेंप्रतिदीप्ति का पता लगाने.
  3. उद्देश्य लेंस पर एक 40X या 63X उद्देश्य और ड्रॉप विसर्जन के तेल का चयन करें.
  4. प्रक्रिया 2 में वर्णित के रूप में पहले HerDox और नकली उपचार प्राप्त किया है कि euthanized चूहों से ताजा ट्यूमर निकालें.
  5. बर्फ पर एक पेट्री डिश पर जगह ट्यूमर के ऊतक गिरावट से बचने, और फिर confocal इमेजिंग के लिए एक टी डेल्टा कक्ष में ट्यूमर स्थानांतरित करने के लिए.
  6. अनुक्रमिक फोकल गहराई (1 माइक्रोन, मोटाई: 20 माइक्रोन कदम आकार) में ट्यूमर के confocal छवियों मोल. Z-अक्ष के साथ क्रमिक रूप से अधिग्रहीत छवियों का एक उदाहरण चित्रा 3, बाएं पैनल में दिखाया गया है.
  7. अधिकतम तीव्रता छवियों के z-प्रक्षेपण प्रदर्शन करना. Z-खड़ी छवियों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण चित्रा 3, सही पैनल में दिखाया गया है.
  8. . अधिकतम तीव्रता के प्रतिदीप्ति तीव्रता जेड मतलब की गणना - देखने का समग्र क्षेत्र से अधिक चित्रों के प्रतिदीप्ति तीव्रता मीन प्रक्षेपण छवियों की गणना कर रहे थेघ ImageJ का उपयोग.

5. Ratiometric स्पेक्ट्रल इमेजिंग और विश्लेषण

Ratiometric वर्णक्रमीय इमेजिंग और विश्लेषण Dox प्रतिदीप्ति और autofluorescence के बीच भेदभाव की अनुमति देता है.

  1. प्रतिदीप्ति confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर पर पावर.
  2. एक कदम और 10 एनएम के आकार, और एक Leica एसपीई confocal खुर्दबीन का उपयोग कर 488 एनएम प्रकाश में उत्तेजना के साथ, 510-650 एनएम वर्णक्रमीय सीमा के भीतर एक निर्धारित गहराई में HerDox का इलाज और इलाज ट्यूमर के 15 छवियों मोल.
  3. डॉक्सोरूबिसिन की एक 100 माइक्रोन समाधान तैयार है.
  4. Dox प्रतिदीप्ति (510-650 एनएम, एक कदम आकार: 10 एनएम वर्णक्रमीय रेंज) का शुद्ध वर्णक्रमीय हस्ताक्षर प्राप्त करने के लिए 100 माइक्रोन डॉक्सोरूबिसिन समाधान की वर्णक्रमीय इमेजिंग प्रदर्शन करना. एक ग्राफ चित्रा 4 में दिखाया जाता है के रूप में वर्णक्रमीय इमेजिंग और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम जिसके परिणामस्वरूप से छवि अधिग्रहण की विशिष्ट परिणाम साजिश रची.
  5. एक छवि ग से autofluorescence वर्णक्रमीय हस्ताक्षर मोलयूबे (वर्णक्रमीय रेंज: 510-650 एनएम, एक कदम आकार: 10 एनएम) के इलाज ट्यूमर के वर्णक्रमीय इमेजिंग द्वारा प्राप्त की. एक ग्राफ चित्रा 5 में दिखाया जाता है के रूप में वर्णक्रमीय इमेजिंग और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम जिसके परिणामस्वरूप से छवि अधिग्रहण की विशिष्ट परिणाम साजिश रची.
  6. हम 9 विकसित प्रोग्राम का उपयोग कर चार संदर्भ वर्णक्रमीय हस्ताक्षर (शुद्ध autofluorescence, 0.1.doxorubin 0.9. Autofluorescence, 0.2. डॉक्सोरूबिसिन 0.8. Autofluorescence, 0.3.doxorubin 0.7. Autofluorescence) उत्पन्न करता है. चार संदर्भ वर्णक्रमीय हस्ताक्षर दिखा एक ठेठ वक्र 6 चित्र में दिखाया गया है.
  7. हम पहले 9 विकसित प्रोग्राम का उपयोग इयूक्लिडियन दूरी को मापने के माध्यम से संदर्भ वर्णक्रमीय हस्ताक्षर द्वारा परिभाषित के रूप में छवियों के वर्णक्रमीय वर्गीकरण प्रदर्शन.
  8. Ratiometric वर्णक्रमीय इमेजिंग और विश्लेषण की तुलना के लिए हम 7 विकसित एक वर्णक्रमीय unmixing कार्यक्रम (ImageJ में प्लग में), 10, का उपयोग करके उन छवियों के रैखिक वर्णक्रमीय unmixing प्रदर्शन करना. एक ईरैखिक वर्णक्रमीय unmixing द्वारा autofluorescence से HerDox प्रतिदीप्ति अलग करने की xample 7 चित्र में दिखाया गया है.

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Representative Results

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चित्रा 1 प्रतिदीप्ति तीव्रता, वर्णक्रमीय, जीवनकाल, 2 फोटॉन, अंतर महत्वपूर्ण कोंफोकल, और bioluminescence इमेजिंग सहित एकाधिक रूपरेखा के तहत छवि अधिग्रहण के प्रयोजन के लिए बनाया गया था, जो इन विवो ऑप्टिकल इमेजर प्रोटोटाइप में पता चलता है. इसके अलावा, इस प्रणाली में शामिल ठंडा उच्च संवेदनशील कैमरा और उच्च शक्ति लेजर लाइनों खासकर डॉक्सोरूबिसिन प्रतिदीप्ति के vivo का पता लगाने के लिए वाणिज्यिक ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम के 11 की तुलना में उच्च विपरीत प्रतिदीप्ति छवियों, पैदावार. इसलिए, इस प्रणाली vivo में HerDox के आकलन में कई पूरक डेटा अंक प्राप्त करने के लिए वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल के लिए महत्वपूर्ण था.

चित्रा 2 में दिखाया उच्च ट्यूमर प्रतिदीप्ति HerDox की प्रणालीगत प्रसव के बाद ठेठ, और उसके ट्यूमर तरजीही लक्ष्यीकरण का संकेत है. कंकाल की मांसपेशी में पाया प्रतिदीप्ति असामान्य है और fro परिणाम हो सकता हैइंजेक्शन प्रक्रिया में हूँ विसंगतियों (यानी शरीर के करीब इंजेक्शन लगाने). गुणात्मक, चित्रा 2 में दिखाया छवि कम पृष्ठभूमि है. हालांकि, रिश्तेदार ऊतक प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए, यह के रूप में चित्रा 2b में दिखाया गया एक खाली पकवान का उपयोग कर एक पृष्ठभूमि सुधार, प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है. इस की तुलना में छवि के किनारे पर एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत है कि चित्रा 2c में दिखाया गया एक "पृष्ठभूमि को सही" छवि में परिणाम कर सकते हैं मूल (चित्रा 2) पृष्ठभूमि छवि (चित्रा 2 बी) के किनारे पर कम तीव्रता है क्योंकि छवि. पृष्ठभूमि सुधार छवि के किनारे पर एक संकेत वृद्धि उपज कर सकते हैं, जबकि इस प्रकार, यह बाद में मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक आवश्यक कदम है.

ट्यूमर में HerDox संचय का एक मात्रात्मक मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए, confocal प्रतिदीप्ति छवियों अलग फोकल पर प्राप्त किया गयाबगल में गहराई अधिकतम तीव्रता छवियों के z-प्रक्षेपण (चित्रा 3), और अनुमानित छवि का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता के अधिग्रहण के द्वारा पीछा किया. परिणामी छवि हर पिक्सेल में संकेत Z-गहराई से अधिक HerDox संचय जानकारी होती है, और इस प्रकार प्रतिदीप्ति तीव्रता का औसत मात्रात्मक अलग गहराई में ट्यूमर में समग्र HerDox राशि को दर्शाता है.

ट्यूमर में autofluorescence से HerDox प्रतिदीप्ति भेद और मात्रात्मक उच्च विशिष्टता, ratiometric वर्णक्रमीय इमेजिंग और विश्लेषण के साथ दो भेदभाव करने के लिए प्रदर्शन किया था. डॉक्सोरूबिसिन और वर्णक्रमीय इमेजिंग द्वारा प्राप्त autofluorescence के लिए शुद्ध वर्णक्रमीय हस्ताक्षर क्रमशः आंकड़े 4 और 5 में सचित्र हैं. संदर्भ वर्णक्रमीय हस्ताक्षर (चित्रा 6) भी हम 9 विकसित प्रोग्राम का उपयोग कर शुद्ध वर्णक्रमीय हस्ताक्षर के विभिन्न अनुपात के मिश्रण से बनाया गया था. प्रत्येक refereवर्णक्रमीय हस्ताक्षर यहाँ autofluorescence के संबंध में ट्यूमर में जमा HerDox के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करता है nce. वर्णक्रमीय वर्गीकरण छवियों (डेटा इस पत्र में नहीं दिखाया गया था) शुद्ध संदर्भ वर्णक्रमीय हस्ताक्षर (चित्रा 7) का उपयोग करके प्राप्त वर्णक्रमीय unmixed छवि की तुलना में बेहतर मात्रात्मक HerDox राशि 7 दिखाया. ratiometric वर्णक्रमीय इमेजिंग प्रदर्शन जब 4-7 आंकड़े ठेठ निष्कर्षों का प्रतिनिधित्व और विश्लेषण.

चित्रा 1
चित्रा 1. विवो ऑप्टिकल इमेजर में. प्रतिदीप्ति तीव्रता, वर्णक्रमीय, प्रतिदीप्ति जीवनकाल और intravital confocal इमेजिंग क्षमताओं के साथ एक ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यहां इस्तेमाल बहुपद्वति ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली दिखाया गया है, और describ कर दिया गया हैएड पहले 8. ह्वांग, जे, एट अल, मॉल:. छवि स्प्रिंगर विज्ञान और व्यापार मीडिया बी.वी. से रज़ामंदी के साथ प्रदान की है. इमेजिंग बॉय., 14, 431-42 (2012).

चित्रा 2
चित्रा 2. HerDox प्राप्त एक माउस से निकाले आंतरिक अंगों और ट्यूमर के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति तीव्रता छवियों. ऊतकों और ट्यूमर से पहले HerDox प्रतिदीप्ति तीव्रता छवियों के अंतिम दिवस (7) इंजेक्शन के बाद और (ख) (क) और (ग), क्रमशः का प्रतिनिधित्व कर रहे पृष्ठभूमि सुधार के बाद 24 घंटे में euthanized चूहों से काटा गया. बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा .


चित्रा 3. अनुक्रमिक Z-गहराई पर प्राप्त छवियों की अधिकतम तीव्रता Z-प्रक्षेपण. बाएँ में दिखाया खड़ी छवियों अनुक्रमिक 1 माइक्रोन गहराई पर प्राप्त ट्यूमर के ऊतक के confocal स्कैन के प्रतिनिधि हैं. सही पर छवि बाईं तरफ खड़ी चित्रों के संकलन से पता चलता है.

चित्रा 4
4 चित्रा. डॉक्सोरूबिसिन के लिए एक शुद्ध वर्णक्रमीय हस्ताक्षर का अधिग्रहण. डॉक्सोरूबिसिन समाधान की छवियों 10 एनएम के एक कदम आकार (बाएं), डॉक्सोरूबिसिन प्राप्त हुई थी के लिए शुद्ध वर्णक्रमीय हस्ताक्षर के साथ, 510-650 एनएम भीतर अनुक्रमिक तरंग दैर्ध्य पर थे प्राप्त करने के बाद हम विकसित प्रोग्राम का उपयोग कर. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. Autofluorescence के लिए एक शुद्ध वर्णक्रमीय हस्ताक्षर का अधिग्रहण. इलाज ट्यूमर की छवियों 10 एनएम के एक कदम आकार (बाएं), autofluorescence के लिए शुद्ध वर्णक्रमीय हस्ताक्षर हम विकसित कार्यक्रम का उपयोग कर प्राप्त किया गया था. के साथ, 510-650 एनएम भीतर अनुक्रमिक तरंग दैर्ध्य पर थे प्राप्त करने के बाद बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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6 चित्रा. Ratiometric वर्णक्रमीय इमेजिंग और विश्लेषण के लिए चार संदर्भ वर्णक्रमीय हस्ताक्षर. संदर्भ वर्णक्रमीय हस्ताक्षर हम विकसित प्रोग्राम का उपयोग कर शुद्ध वर्णक्रमीय हस्ताक्षर मिश्रण से बनाया गया था. हरे रंग का ठोस लाइन शुद्ध autofluorescence का प्रतिनिधित्व करता है, लाल रंग का ठोस लाइन 0.1.doxorubin 0.9 का प्रतिनिधित्व करता है. autofluorescence, नीले रंग का ठोस लाइन 0.2 का प्रतिनिधित्व करता है. डॉक्सोरूबिसिन 0.8. autofluorescence, और सियान रंग का ठोस लाइन 0.3.doxorubin 0.7. autofluorescence, क्रमशः. ह्वांग, जे, एट अल, एक PLoS 7 (4), (2012).. चित्रा लेखक 'पिछले काम से reproduced है.

7 चित्रा
चित्रा 7. वर्णक्रमीय संयुक्त राष्ट्र के मिश्रण से पहले और बाद के ऊतकों में HerDox प्रतिदीप्ति. Dox और autofluorescence, वीं के वर्णक्रमीय हस्ताक्षर प्राप्त करने के बादई Dox संकेत रैखिक वर्णक्रमीय संयुक्त राष्ट्र के मिश्रण 12,13 का उपयोग कर से अलग होती है. आंकड़ा autofluorescence और HerDox मिश्रित छवि से पता चलता है वर्णक्रमीय संयुक्त राष्ट्र के मिश्रण और अलग HerDox छवि वर्णक्रमीय संयुक्त राष्ट्र के मिश्रण के बाद से पहले.

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Discussion

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Dox प्रतिदीप्ति ट्यूमर चमड़े के नीचे हैं जब बहुपद्वति इमेजर का उपयोग vivo में detectable किया जा सकता है. हालांकि, HerDox की therapeutically प्रभावी खुराक (0.004 मिलीग्राम / किग्रा) एक खुराक के बाद नीचे का पता लगाने की सीमा है. इसके विपरीत, 7 दैनिक इंजेक्शन (7 दिनों के लिए 1x/day) के बाद, कण का ट्यूमर संचय और प्रतिधारण Dox प्रतिदीप्ति के दृश्य सक्षम करने के लिए पर्याप्त है.

Dox या स्वच्छ तकनीक का इस्तेमाल किया जाता है कि vivo इमेजिंग में किसी भी अन्य फ्लोरोफोरे साथ कार्य करते समय यह महत्वपूर्ण है. इमेजर Dox बाहरी या आंतरिक है कि क्या भेदभाव के बिना त्वचा के बाहर पर प्रतिदीप्ति का पता लगाने जाएगा के रूप में माउस के बाहर पर भरी, बचा जाना चाहिए. इसी प्रकार, दस्ताने पर Dox संदूषण जिससे गलत प्रतिदीप्ति का पता लगाने के कारण, जानवर से निपटने के दौरान माउस के बाहर पर फ्लोरोसेंट निशान छोड़ सकते हैं.

बहुपद्वति ऑप्टिकल प्रणाली में, एकलेजर बीम HerDox की उत्तेजना के लिए उपयोग किया जाता है. लेजर बीम आम तौर पर एक गाऊसी प्रोफाइल है. इसलिए, ब्याज के नमूनों की वर्दी उत्तेजना के लिए, ऑप्टिकल डिफ्यूज़र उपयोग किया जाता है. फिर भी, दूर तक फैला हुआ लेजर रोशनी कुछ हद तक एक गाऊसी बीम प्रोफाइल को बरकरार रखता है. इस प्रकार, आदर्श मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, पृष्ठभूमि सुधार किया जाना चाहिए. से पहले सही और पृष्ठभूमि छवियों को आमतौर पर 16 बिट के एक गहराई है. पृष्ठभूमि सुधार किया जाता है इसलिए, इससे पहले, छवि गहराई परिणामी और इनपुट छवियों के बीच छवि गहराई विसंगति से अवांछित त्रुटियों से बचने के क्रम में 32 बिट के लिए परिवर्तित किया जाना चाहिए.

एक पृष्ठभूमि छवि के अधिग्रहण में, एक काले कागज (Artagain) पहले से प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदर्शन से पहले रोशनी प्रतिबिंब को रोकने के क्रम में एक इमेजिंग थाली पर रखा गया था. कैमरा अत्यधिक संवेदनशील है हालांकि, बाद से, काले कागज से कम पृष्ठभूमि संकेत कैमरे द्वारा खोजा गया था. इसलिए, पृष्ठभूमिचित्रा 2 में दिखाया संकेतों काले कागज से बजाय पेट्री डिश के एक खाली से आया है.

डॉक्सोरूबिसिन समाधान के एक उच्च एकाग्रता उच्च सटीकता के साथ शुद्ध वर्णक्रमीय हस्ताक्षर प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया था. हम आगे प्रणाली विश्वसनीय वर्णक्रमीय हस्ताक्षर निर्माण करने के लिए नमूना से पर्याप्त प्रतिदीप्ति का पता लगाने में सक्षम है, जिस पर वर्णक्रमीय प्रस्तावों की जांच की. नतीजतन, वर्णक्रमीय संकल्प 10 एनएम से परिचित था. यहाँ हम उच्च वर्णक्रमीय संकल्प (<10 एनएम) की सेटिंग के तहत खुर्दबीन विश्वसनीय वर्णक्रमीय हस्ताक्षर उपज के लिए पर्याप्त प्रतिदीप्ति का पता नहीं लगा सकता है. शुद्ध वर्णक्रमीय हस्ताक्षर के साथ, हम कई ratiometric वर्णक्रमीय हस्ताक्षर (चित्रा 6) उत्पन्न कर सकता है. विशेष रूप से, हम मात्रात्मक संबंधित ratiometric वर्णक्रमीय हस्ताक्षर 7 से autofluorescence से HerDox प्रतिदीप्ति संकेत भेद सकता है. शुद्ध वर्णक्रमीय हस्ताक्षर के साथ प्राप्त वर्णक्रमीय unmixed छविएस (चित्रा 7) दो संदर्भ वर्णक्रमीय हस्ताक्षर द्वारा वर्गीकृत छवि के समान था (नीला:. 0.2.Dox 0.8 Autofl और ग्रीन:.. Autofl). कुल मिलाकर, ratiometric वर्णक्रमीय / confocal इमेजिंग इस प्रकार HER2 + ट्यूमर को दिया नैनोकणों के विश्लेषण में इसकी उपयोगिता की पुष्टि करने, उच्च संकल्प के साथ बगल में ट्यूमर कोशिकाओं में HerDox संचय पर अधिक मात्रात्मक जानकारी प्रदान की.

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Disclosures

लेखक, डैनियल Farkas, वर्णक्रमीय आण्विक इमेजिंग के अध्यक्ष हैं. शेष लेखक कोई प्रतिस्पर्धा हितों की है.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य / राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (R01CA129822 और R01CA140995) के राष्ट्रीय संस्थानों से लाइन किमी कश्मीर को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया. डा. मदीना-Kauwe निरंतर समर्थन के लिए सी. रे, एम. एम Kauwe और डी. Revetto धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope Leica SPE
In Vivo Optical Imager Spectral Molecular Imaging Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl Sigma-Aldrich D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week Charles River Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository 0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle BD 309301
Delta T chamber Bioptechs 04200417B

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References

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लक्षित वायरल प्रोटीन का विश्लेषण HER2 + ट्यूमर को दिया नैनोकणों
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Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).More

Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).

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