Analisi delle Targeted proteina virale nanoparticelle distribuito HER2 + Tumori

Summary

Questo articolo descrive le procedure per l'analisi di immagini ottiche delle nanoparticelle tumore-mirato, Herdox. In particolare, l'uso dettagliato del dispositivo di imaging multimodale per la rilevazione del tumore orientare e valutare la penetrazione del tumore è descritta qui.

Abstract

La nanoparticella HER2 + tumore-mirato, Herdox, espone accumulo tumore preferenziale e ablazione del tumore-crescita in un modello animale di cancro HER2 +. Herdox è formato da non covalente auto-assemblaggio di un tumore mirato proteina penetrazione cella con l'agente chemioterapico, doxorubicina, tramite una piccola linker acido nucleico. Una combinazione di elettrofilo, intercalazione, e le interazioni oligomerizzazione facilitare l'auto-assemblaggio in tutto 10-20 particelle nm. Herdox esibisce la stabilità nel sangue e nella conservazione prolungata a temperature diverse. Consegna sistemica di Herdox in topi portatori di tumore provoca la morte delle cellule tumorali, senza effetti negativi rilevabili a tessuto non tumorale, tra il cuore e il fegato (che subiscono danni segnata da doxorubicina non mirati). HER2 elevazione facilita il targeting di cellule che esprimono il recettore del fattore di crescita epidermico umano, quindi tumori che presentavano livelli elevati di HER2 mostrano maggiore accumulo di Herdox rispetto alle cellule exprescantare livelli inferiori, sia in vitro che in vivo. L'imaging di fluorescenza combinata con l'analisi confocale e spettrale situ ha permesso di verificare in vivo del tumore targeting e la penetrazione delle cellule tumorali di Herdox dopo la consegna sistemica. Qui dettaglio i nostri metodi per la valutazione targeting tumorale tramite l'imaging multimodale dopo la consegna sistemica.

Introduction

Tumore-targeting della chemioterapia ha il potenziale per eliminare le cellule tumorali a dosi inferiori rispetto ai farmaci mirati perché più della terapia erogata può accumulare la destinazione prevista in luogo della distribuzione di tessuto non tumorale. Come quest'ultima situazione sarebbe diluire la efficacia del farmaco e quindi richiedono dosi più elevate per essere efficace, tumore-targeting ha sia vantaggi terapeutici e di sicurezza oltre il trattamento non mirati standard.

Targeting chemioterapia di incapsulamento in nanoparticelle auto-assemblati permette al farmaco di rimanere chimicamente non modificato in contrasto con i farmaci che sono covalentemente legati a molecole di targeting. Come tale collegamento ha il potenziale per alterare l'attività sia del farmaco e la molecola di guida; assemblaggio non covalente permette potenza del farmaco da conservare.

Abbiamo precedentemente dimostrato che il romanzo a tre componenti, complesso auto-assemblati, Herdox, rivolge HER2 + tumori 1. Herdox è formato attraverso interazioni non covalenti tra la proteina recettoriale cellula-penetrazione, HerPBK10, e l'agente chemioterapico, doxorubicina (Dox), tramite una piccola linker acido nucleico. HerPBK10 lega il recettore del fattore di crescita epidermico umano (HER) e attiva endocitosi mediata da recettore ^2-4, mentre endosomal penetrazione membrana viene realizzato attraverso incorporazione della adenovirus-derivato penton base di capside proteico ^4-6. Un dominio carica positivamente sulla proteina permette acido nucleico legante ^{4, 5,} attraverso il quale può essere trasportato Dox DNA-intercalato per la somministrazione mirata. Elettrofila, intercalazione, e possibilmente interazioni oligomerizzazione di proteine ​​facilitano l'auto-assemblaggio in tutto 10-20 particelle nm che sono stabili nel sangue e sotto lo stoccaggio prolungato a temperature diverse ^1. Preferenziale mira a LEI2 + cellule tumorali è facilitata dalla maggiore affinità ligando quando HER2 è elevata.

Nostri studi precedenti hanno dimostrato che la consegna sistematica delle rese Herdox accumulo preferenziale nei tumori oltre tessuto non tumorale e in confronto a untargeted Dox ^1, e la penetrazione nelle cellule tumorali in vivo ^7. Abbiamo osservato che Herdox rilasci Dox dopo l'entrata delle cellule tumorali, permettendo l'accumulo di Dox nel nucleo ^1. Tumore-accumulo sembra essere correlata con il livello recettoriale, come tumori esprimenti HER2-relativamente bassi accumulano meno Herdox rispetto a quelli con livelli relativamente più elevati HER2 ^1. Inoltre, la concentrazione effettiva morte cellulare presenta una correlazione inversa con HER2 visualizzazione su linee cellulari tumorali esprimenti differenti livelli di HER2 superficie cellulare ^1. Herdox mostra un vantaggio terapeutico e di sicurezza oltre Dox non mirati, come l'uccisione del tumore si verifica in più di dosi 10 volte inferiore rispetto a decomprimeregramme incentrato farmaco e non produce effetti avversi riscontrabili su cuore (rilevata mediante ecocardiografia e istologici macchia) o il fegato (riconosciuto mediante TUNEL macchia) dei tessuti, in contrasto untargeted Dox ^1. Nonostante la sua derivazione da una proteina del capside virale, HerPBK10 presenta nessun immunogenicità rilevabile a livelli terapeutici ^2. Mentre gli anticorpi preesistenti a tutto adenovirus possono riconoscere HerPBK10, non sono in grado di prevenire vincolante ² cellule.

Volume del tumore misurata nel tempo è un metodo standard di valutazione dell'efficacia terapeutica delle terapie mirate, ed è stato impiegato per valutare l'efficacia terapeutica di Herdox. Integrando questo approccio con in vivo e ex vivo imaging di fluorescenza intensità ci ha permesso di valutare meglio gli obiettivi di efficienza ^7. Abbiamo specificatamente integrato in situ confocale di tumori asportati con analisi spettrale di Dox fluorescenza per verificare che non Herdoxt accumulato solo a tumori in vivo, ma penetrato nelle cellule tumorali e Dox consegnato nel citoplasma e nel nucleo ^7. Analisi spettrale inoltre ci ha permesso di distinguere Dox fluorescenza da autofluorescenza ^7.

Qui mostriamo più in dettaglio il nostro approccio per la valutazione Herdox in vivo dopo la consegna sistemica, e, soprattutto, per valutare il targeting attraverso metodi di imaging multimodali e di analisi.

Protocol

1. Consegna sistemica in vivo

1. Mescolare abbastanza Herdox con soluzione salina sterile per equiparare 0,2 ml di una dose mg / kg 0,004 di Herdox per iniezione per 6-8 settimane vecchio mouse cuscinetti sottocutanei tumori xenotrapianto fianco bilaterali nu / nu.
2. Disegnare delicatamente il composto Herdox in una siringa da insulina 3/10 cc con ago 29G, evitando le bolle.
3. Anestesia è indotta da una breve esposizione isoflurano in una camera di induzione dotato di un sistema di evacuazione fumi gas (portate ossigeno: 0.5-1 L / min, concentrazione isoflurano: 3-4% (o inferiore).
4. Iniettare l'intero contenuto nella vena della coda di un topo anestetizzato (0,2 ml per iniezione). IV iniezione può essere eseguita in un ambiente sobrio, topo non anestetizzati.
5. Ripetere iniezioni sullo stesso topo per sei giorni più sequenziali, una volta al giorno.

2. Fluorescence Imaging in vivo

L'accumulo di Herdox fluorescenza nei tumori puòessere rivelabile con l'ultimo giorno di iniezione (giorno 7) con un imager multimodale. Le procedure sotto comportano l'impiego di un macro-sistema di illuminazione e rilevazione personalizzata (Figura 1) ^8.

1. Accendere il Multimode In Imager ottico in vivo.
2. Selezionare un filtro passa-banda di emissione (590 nm ± 30 nm) adatto per doxorubicina rivelazione a fluorescenza.
3. Accendere Argon-Krypton laser e inserire un filtro passa-banda di eccitazione (488 nm ± 10 nm) nel percorso ottico laser.
4. Accendere il sistema di anestesia e quindi posizionare il mouse nella camera di anestetizzante (tassi di flusso di ossigeno: 0,5-1 L / min, concentrazione isoflurano: 3-4% (o inferiore) dotati di un sistema di evacuazione dei gas.
5. Passa il mouse dalla camera anestetizzante per la camera di imaging del Multimode In Imager ottica vivo quando il mouse è anestetizzato.
6. Posizionare un musetto sopra il naso del mouse e aprire il flusso di somministrare anestesia continuaSia durante l'acquisizione dell'immagine (tassi di flusso di ossigeno: 0,5-1 L / min, la concentrazione di isoflurano: 2-3% (o inferiore).
7. Acquisire immagini di fluorescenza utilizzando un tempo di esposizione di 5-15 sec.
8. Eseguire l'analisi delle immagini e di elaborazione tra cui la correzione del fondo o di regolazione del contrasto.

3. Fluorescence Imaging ex vivo

Herdox fluorescenza può essere ripreso in tumori e organi specifici (tra cui il fegato, reni, milza, cuore e muscolo scheletrico) raccolte da topi sacrificati a 24 ore dopo il (Giorno 7) ultima iniezione di Herdox.

1. Accendere il Multimode In Imager ottico in vivo.
2. Selezionare un filtro passa-banda di emissione (580 nm ± 20 nm) per il rilevamento di fluorescenza doxorubicina.
3. Accendere Argon-Krypton laser e inserire un filtro passa-banda di eccitazione (488 nm ± 10 nm) nel percorso ottico laser.
4. Luogo tumori e organi specifici disposti su un piatto di Petri nella camera di imaging of il Multimode In Imager ottico in vivo.
5. Acquisire immagini di fluorescenza dei tessuti utilizzando un tempo di esposizione di 5-15 sec. Un esempio di acquisizione iniziale immagine di fluorescenza è mostrato in Figura 2a. Ripetere la stessa utilizzando un vuoto Petri-piatto, che fungerà da sfondo (Figura 2b).
6. Eseguire l'analisi delle immagini e di elaborazione tra cui la correzione del fondo o di regolazione del contrasto. Un esempio di una immagine corretta viene mostrata in Figura 2c, risultante dalla sottrazione della Figura 2b dalla Figura 2a.

4. In situ Imaging confocale dei Tumori

In situ confocale permette rilevazione e l'analisi di accumulazione tumore Herdox a livello cellulare.

1. Accendere una Leica SPE microscopio confocale.
2. Selezionare 488 nm luce laser per l'eccitazione della doxorubicina e di emissione lunghezze d'onda (560-620 nm) per la doxorubicinarivelazione della fluorescenza.
3. Selezionare un obiettivo 40X o 63X e olio di immersione goccia sulla lente dell'obiettivo.
4. Estrarre i tumori freschi da topi eutanasia che in precedenza ricevuto trattamenti Herdox e finto come descritto nella procedura ^2.
5. Luogo tumori su una piastra di Petri in ghiaccio per evitare il degrado del tessuto, e poi trasferire i tumori in una camera T Delta per l'imaging confocale.
6. Acquisire le immagini confocale dei tumori a profondità focali sequenziali (dimensione del passo: 1 micron, spessore: 20 micron). Un esempio di immagini in sequenza-acquisite lungo l'asse z è mostrato in Figura 3, pannello sinistro.
7. Eseguire intensità massima z-proiezione delle immagini. Una proiezione massima intensità di z-stack immagini è mostrato in Figura 3, pannello di destra.
8. Calcola significare intensità di fluorescenza della massima intensità Z -. Immagini di proiezione media intensità di fluorescenza delle immagini sopra il campo di vista generale sono stati calcolared usando ImageJ.

5. Ratiometrica Spectral Imaging e analisi

Spectral Imaging ratiometrica e analisi consente la discriminazione tra Dox fluorescenza e autofluorescenza.

1. Accendere una scansione laser a fluorescenza microscopio confocale.
2. Acquisire 15 immagini dei tumori Herdox-trattati e non a una profondità specificata nel range spettrale di 510-650 nm, con un passo di 10 nm, e eccitazione a 488 nm luce utilizzando un microscopio confocale Leica SPE.
3. Preparare una soluzione 100 mM di doxorubicina.
4. Eseguire l'imaging spettrale della soluzione di doxorubicina 100 micron per ottenere la firma spettrale pura di Dox fluorescenza (campo spettrale: 510-650 nm, una dimensione del passo: 10 nm). Risultati tipici di acquisizione immagine da immagini spettrali e conseguente spettro di fluorescenza tracciati come un grafico sono mostrati in Figura 4.
5. Acquisire la firma spettrale autofluorescenza da un'immagine cUbe (campo spettrale: 510-650 nm, una dimensione del passo: 10 nm) ottenuta da imaging spettrale di tumori non trattati. Risultati tipici di acquisizione immagine da immagini spettrali e conseguente spettro di fluorescenza tracciati come un grafico sono mostrati in Figura 5.
6. Genera quattro firme spettrali di riferimento (autofluorescenza puro, 0.1.doxorubin +0,9. Autofluorescenza, 0.2. Doxorubicina +0,8. Autofluorescenza, 0.3.doxorubin +0,7. Autofluorescenza) utilizzando il programma che abbiamo sviluppato ^9. Una tipica curva che mostra quattro firme spettrali di riferimento è mostrato in Figura 6.
7. Eseguire la classificazione spettrale delle immagini come definito dalle firme spettrali di riferimento attraverso la misura di distanza euclidea che utilizzano il programma che precedentemente sviluppato ^9.
8. Eseguire unmixing spettrale lineare di quelle immagini utilizzando un programma spettrale unmixing (plug-in in ImageJ) abbiamo sviluppato ^{7, 10,} per il confronto con la rappresentazione spettrale raziometrico e analisi. Un indirizzo example di separare fluorescenza Herdox da autofluorescenza da unmixing spettrale lineare è mostrato in Figura 7.

Representative Results

La figura 1 mostra il vivo ottico prototipo imager, che è stato costruito a scopo di acquisizione di immagini in modalità multiple, tra intensità di fluorescenza, spettrale, durata, 2-fotone, confocale intra-vitale, e di imaging bioluminescenza in. Inoltre, la telecamera sensibile elevata raffreddata e linee laser ad alta potenza incorporato in questo sistema rese superiori contrasto immagini di fluorescenza rispetto ai sistemi di imaging ottico commerciali ^11, in particolare per il rilevamento in vivo di doxorubicina fluorescenza. Quindi, questo sistema è stato critico per l'uso nella presente studio per acquisire più punti dati complementari nella valutazione di Herdox in vivo.

La fluorescenza elevata tumore mostrata in figura 2 è tipico dopo la consegna sistemica di Herdox ed indicativo della sua Il targeting tumorale-preferenziale. La fluorescenza rilevata nel muscolo scheletrico è atipica e può provocare from anomalie nella procedura di iniezione (cioè iniettando troppo vicino al corpo). Qualitativamente, l'immagine mostrata in figura 2a ha un basso fondo. Tuttavia, per eseguire un'analisi quantitativa delle relative intensità di fluorescenza del tessuto, è necessario eseguire una correzione di fondo utilizzando un piatto vuoto, come mostrato nella Figura 2b. Ciò può risultare in un "fondo corretta" immagine mostrato in Figura 2c che ha un segnale di fondo più elevata al bordo dell'immagine rispetto all'originale (figura 2a), in quanto l'immagine di sfondo (Figura 2b) abbia intensità inferiori al bordo del immagine. Così, mentre la correzione del fondo può produrre un aumento di segnale al bordo dell'immagine, questo è un passo necessario per la successiva analisi quantitativa.

Per ottenere una valutazione quantitativa di accumulo Herdox nei tumori, immagini di fluorescenza confocale sono state ottenute al differente focaleprofondità in situ seguite da intensità massima z-proiezione delle immagini (Figura 3), e l'acquisizione della fluorescenza media dell'immagine proiettata. L'immagine risultante contiene le informazioni di accumulo Herdox negli indicati z-profondità ad ogni pixel, e quindi la media delle intensità di fluorescenza riflette accumuli complessivi Herdox in tumori a diverse profondità quantitativamente.

Per distinguere Herdox fluorescenza da autofluorescenza nei tumori e quantitativamente discriminare i due con alta specificità, immagini spettrali ratiometrica e analisi è stata effettuata. Le firme spettrali puri per doxorubicina e autofluorescenza ottenuto per immagini spettrali sono illustrati nelle figure 4 e 5, rispettivamente. Firme spettrali di riferimento (Figura 6) sono stati creati anche miscelando diversi rapporti delle firme spettrali puri con il programma che abbiamo sviluppato ^9. Ogni reference firma spettrale qui rappresenta relativa fluorescenza di Herdox accumulato nei tumori rispetto alla autofluorescenza. Le immagini di classificazione spettrali (dati non compaiono nel presente documento) ha mostrato una migliore accumuli Herdox quantitative ⁷ rispetto all'immagine unmixed spettrale ottenuti utilizzando le firme spettrali di riferimento puri (Figura 7). Figure 4-7 rappresentano risultati tipici quando si esegue l'imaging spettrale raziometrico e analisi.

Figura 1. Nel imager ottici vivo. Un sistema di imaging ottico con intensità di fluorescenza, spettrale, durata e funzionalità di imaging di fluorescenza confocale intravitale deve essere utilizzato. Il sistema di imaging ottico multimodale usata qui è mostrato, ed è stato descrindr precedentemente ^8. Immagine fornita per gentile concessione del Springer Science & Business Media BV: Hwang, JY, et al, Mol.. Imaging Biol., 14, 431-42 (2012).

Figura 2. Rappresentante immagini di intensità di fluorescenza di organi interni e tumori estratti da un topo ricevente Herdox. I tessuti e tumori sono state raccolte da topi sacrificati a 24 ore dopo il (Giorno 7) ultima iniezione di immagini di fluorescenza Herdox prima e dopo la correzione del fondo (b) sono rappresentati da (a) e (c), rispettivamente. Clicca qui per ingrandire figura .

Figura 3. Intensità massima z-proiezione delle immagini ottenute al sequenziali z-profondità. Le immagini impilati mostrate a sinistra sono rappresentativi delle scansioni confocale del tessuto tumorale ottenuto al sequenziali 1 micron profondità. L'immagine a destra mostra la compilazione delle immagini impilate sulla sinistra.

Figura 4. Acquisizione di una firma spettrale puro per la doxorubicina. Dopo le immagini di soluzione di doxorubicina sono stati ottenuti a lunghezze d'onda 510-650 nm sequenziali all'interno, con un passo dimensione di 10 nm (a sinistra), la firma spettrale puro è stato ottenuto per doxorubicina utilizzando il programma che abbiamo sviluppato. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5. Acquisizione di una firma spettrale puro per autofluorescenza. Dopo le immagini di tumore non trattati sono stati ottenuti a lunghezze d'onda sequenziali all'interno 510-650 nm, con un passo-dimensione di 10 nm (a sinistra), la firma spettrale puro per autofluorescenza è stato ottenuto con il programma che abbiamo sviluppato. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 6. Quattro firme spettrali di riferimento per l'imaging spettrale ratiometrica e analisi. Le firme spettrali di riferimento sono stati creati miscelando le firme spettrali puri utilizzando il programma che abbiamo sviluppato. La linea continua di colore verde rappresenta la pura autofluorescenza, la linea continua di colore rosso rappresenta 0.1.doxorubin +0,9. Autofluorescenza, la linea continua di colore blu rappresenta il 0,2. doxorubicina +0,8. autofluorescenza, e la linea continua di colore ciano 0.3.doxorubin +0,7. autofluorescenza, rispettivamente. La figura è riprodotta dal precedente lavoro degli autori: Hwang, JY, et al, PLoS One 7 (4), (2012)...

Figura 7. Herdox fluorescenza nel tessuto prima e dopo spettrale non-miscelazione. Dopo aver ottenuto le firme spettrali di Dox e autofluorescenza, thsegnali elettronici Dox sono separati utilizzando lineare spettrale non-miscelazione ^12,13. La figura mostra l'immagine mista autofluorescenza e Herdox prima spettrale non-miscelazione e l'immagine Herdox separati dopo spettrale non-miscelazione.

Discussion

Dox fluorescenza può essere rilevabile in vivo utilizzando la termocamera multimode quando i tumori sono sottocutaneo. Tuttavia, la dose terapeuticamente efficace di Herdox (0,004 mg / kg) è al di sotto della soglia di rilevamento dopo una singola dose. Al contrario, dopo 7 iniezioni giornaliere (1x/day per 7 giorni), l'accumulo tumore e ritenzione della particella è sufficiente per consentire la visualizzazione di Dox fluorescenza.

È critico quando si lavora con Dox o qualsiasi altra fluoroforo per immagini in vivo che è utilizzato tecnica pulita. Gocciola sulla parte esterna del mouse dovrebbero essere evitati, come la termocamera rileverà la fluorescenza sulla parte esterna della pelle senza discriminare se il Dox è esterno o interno. Analogamente, la contaminazione Dox i guanti possono lasciare segni fluorescenti sulla parte esterna del mouse durante la manipolazione animale, provocando così il rilevamento della fluorescenza erronea.

Nel sistema ottico multimodale, unraggio laser viene utilizzato per l'eccitazione del Herdox. Il fascio laser ha tipicamente un profilo Gaussiano. Quindi, per l'eccitazione uniforme di esemplari di interesse, diffusori ottici sono utilizzati. Tuttavia, la luce laser diffusa alquanto conserva un profilo fascio gaussiano. Così, per l'analisi quantitativa ideale, la correzione del fondo deve essere eseguita. Le immagini prima con correzione e sfondo in genere hanno una profondità di 16 bit. Pertanto, prima che la correzione del fondo viene effettuata, la profondità di immagine deve essere convertita a 32 bit per evitare errori indesiderati dall'immagine profondità discrepanza tra immagini risultanti ed ingresso.

L'acquisizione di una immagine di sfondo, una carta nera (Artagain) è stato precedentemente messo su una piastra di imaging per evitare riflessioni illuminazione prima di eseguire l'imaging di fluorescenza. Tuttavia, poiché la fotocamera è altamente sensibile, segnali di sfondo basse dal nero-carta è stata rilevata dalla telecamera. Pertanto, lo sfondosegnali mostrati nella Figura 2 provenivano dalla carta nera piuttosto che da un vuoto Petri-piatto.

Un'elevata concentrazione di soluzione di doxorubicina è stata utilizzata per ottenere firme spettrali puri con elevata precisione. Abbiamo esaminato ulteriormente risoluzioni spettrali in cui il sistema è in grado di rilevare abbastanza fluorescenza dal campione per produrre firme spettrali affidabili. Come risultato, la risoluzione spettrale era sintonizzato a 10 nm. Qui abbiamo scoperto che il microscopio con l'impostazione di risoluzioni spettrali più elevate (<10 nm) non è riuscito a rilevare la fluorescenza sufficiente per produrre firme spettrali affidabili. Con le firme spettrali puri, potremmo generare diverse firme spettrali raziometrici (Figura 6). In particolare, si potrebbe distinguere quantitativamente segnali di fluorescenza Herdox da autofluorescenza dalle rispettive firme spettrali raziometriche ^7. L'immagine unmixed spettrale ottenuto con la firma spettrale puros (Figura 7) è stata simile alla immagine classificata dai due firme spettrali di riferimento (blu:. 0.2.Dox +0,8 Autofl e Verde:.. Autofl). Complessivamente, il confocale / spettrale raziometrica fornito dati quantitativi sugli Herdox accumulo nelle cellule tumorali in situ con alta risoluzione, verificando così la sua utilità nell'analisi delle nanoparticelle consegnati tumori HER2 +.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope	Leica	SPE
In Vivo Optical Imager	Spectral Molecular Imaging	Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl	Sigma-Aldrich	D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week	Charles River	Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells	NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository	0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle	BD	309301
Delta T chamber	Bioptechs	04200417B