Summary
נהלי Microplate מבוססות מתוארים לניתוח colorimetric או fluorometric של פעילות אנזים תאית. נהלים אלה מאפשרים לassay המהיר של פעילות מסוג זה במספר הגדול של דגימות סביבתיות בתוך מסגרת זמן לניהול.
Abstract
חלק גדול מהרכיבה על האופניים מזינים ועיבוד פחמן בסביבה טבעית מתרחש באמצעות הפעילות של אנזימים תאיים שפורסמו על ידי מיקרואורגניזמים. לכן, מדידה של הפעילות של אנזימים תאיים אלה יכול לתת תובנות השיעורים של תהליכים ברמת מערכת אקולוגית, כגון פירוק חומר אורגני או חנקן וזרחן מינרליזציה. מבחני של פעילות אנזים תאית בדגימות סביבתיות בדרך כלל כרוכים חושפים את הדגימות למצעי colorimetric או fluorometric מלאכותיים ומעקב אחר השיעור של הידרוליזה מצע. כאן אנו מתארים שיטות microplate המבוסס על נהלים אלה המאפשרים הניתוח של מספר הגדול של דגימות תוך פרק זמן קצר. דוגמאות מותרת להגיב במצעים מלאכותיים תוך 96 גם microplates או גם עמוקים בלוקים microplate, ופעילות אנזים נקבעה לאחר מכן על ידי קליטה הקרינה או של המוצר הסופי וכתוצאה מכך באמצעות ריד microplate טיפוסיr או fluorometer. נהלי תפוקה גבוהה כגון להקל לא רק השוואות בין אתרים או מערכות אקולוגיות במרחב נפרדים, אלא גם להפחית באופן משמעותי את העלות של מבחני אלה על ידי צמצום כמויות מגיב הכוללות הנדרשות לדגימה.
Introduction
מיקרואורגניזמים כגון חיידקים ופטריות להשיג חומרים מזינים ופחמן מתרכובות אורגניות מורכבות באמצעות הייצור של אנזימים תאיים. אנזימים אלה בדרך כלל hydrolyze פולימרים ליחידות משנה קטנה יותר שאפשר לקחת אל תוך התא. לכן, ברמה אקולוגית, אנזימים תאיים של חיידקים אלו אחראים לחלק גדול ממינרליזציה התזונתית ופירוק חומר אורגני המתרחש בסביבות טבעיות. אנזימים כגון cellobiohydrolase (CBH) וβ-glucosidase חשובים לפירוק תאית ועבודה ביחד כדי לזרז הידרוליזה של תאית לגלוקוז 1,2, המספקת מצע פחמן לניצול לספיגה והטמעה של חיידקים. Phosphatase האנזים משחרר מסיסי קבוצות אורגניות פוספט מזרחנים אורגניים, במהות mineralizing פוספט והופך אותו זמין לשימוש על ידי רוב האורגניזמים 3. אנזימים אחרים, כגון N-acetylglucosaminidase (Nagase), הם importanלא בשפלת כיטין והוא יכול לעשות את שני פחמן וחנקן זמין לרכישת חיידקים 4.
אחד מההליכים עבור assay של פעילות אנזים תאית של חיידקים בסביבות טבעיות הוא השימוש בp-nitrophenyl המלאכותי מצעים (NP עמ ') מקושרים, גישה שפותחה במקור כדי לזהות פעילות phosphatase אדמת 5. גישה זו מסתמכת על זיהוי של מוצר בצבע תום, p-nitrophenol, המשתחרר כאשר המצע מלאכותי הידרוליזה על ידי האנזים המתאים. P-nitrophenol ניתן לכמת בהמשך colorimetrically ידי מדידת הספיגה שלה בסביבות 400-410 ננומטר. שיטה זו מאז הוחל לזהות אנזימים אחרים כגון Nagase 6, וכבר נעשה שימוש במחקרים שונים מסתכלת על פעילות אנזים תאית של חיידקים בקרקעות ומשקעים 7-9.
גישה חלופית שהייתה originally פותח כדי להעריך את פעילות glucosidase תאית בסביבות מימית 10,11 עושה שימוש 4 methylumbelliferone-(MUB) מצעים מקושרים. המוצר הסופי שפורסם (4-methylumbelliferone) הוא ניאון מאוד וניתן לאתר באמצעות fluorometer עם הגדרת עירור / פליטה סביב 360/460 ננומטר. מגוון מצעים מלאכותיים MUB צמודים זמין, המאפשר מדידת fluorometric של הפעילות של אנזימים לפחות כמו רבים (למשל β-glucosidase, cellobiohydrolase, Nagase, phosphatase) כפי שניתן assayed באמצעות הליך colorimetric NP-מצע p. אנזימים אחרים חיידקים תאיים, כגון aminopeptidase לאוצין החלבון משפיל, יכולים להיות assayed fluorometrically באמצעות 7-אמינו-4-methylcoumarin (COU) מצעים מקושרים. שני MUB ומצעי COU צמודים היו בשימוש כדי לקבוע פעילות אנזים בדגימות יבשתית ומימיות שונות 12,13.
בעוד שהמחקרים קודמים descrmicroplate fluorometric או colorimetric ibed גישות כדי לקבוע פעילות אנזים תאית 14, יש צורך בהצגה ברורה של איך לנהל מבחני כאלה. כאן אנו מדגימים נהלים לביצוע טכניקות microplate תפוקה גבוהות לניתוח פעילות אנזים תאי בקרקעות ומשקעים בגישת מצעים צמודים NP p colorimetric ובמים הטבעיים באמצעות טכניקת מצעי MUB צמודת הניאון. אנו מתמקדים במדידה של הפעילות של β-glucosidase, Nagase, וphosphatase כיכולים להיות קשורים אנזימים אלה לפחמן, חנקן, זרחן ורכיבה על אופניים, בהתאמה. עם זאת, ניתן ליישם הנהלים שתוארו כאן כדי המדידה של אנזימים תאיים אחרים באמצעות מצעים מלאכותיים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניתוח Colorimetric של תאית אנזים פעילות בקרקעות ומשקעים
1. הכנת התשתית ופתרונות הצפת לניתוח Colorimetric של אנזים פעילות
- H להכין 50 מ"מ אצטט חיץ (pH 5.0-5.5) על ידי ערבוב חומצת 50 מיליליטר 0.1 M אצטית (2.87 מיליליטר חומצה אצטית קרחונית ב500 מיליליטר מים), 150 מיליליטר 0.1 נתרן אצטט M, ו200 מיליליטר מזוקק 2 O. התאם ל-pH 5.0-5.5 עם 0.1 M חומצה אצטית במידת צורך.
- הכן פתרון של הידרוקסיד 1 M נתרן (NaOH) במזוקקי H 2 O.
- הכן את פתרונות מצע צמוד NP p ב50 מ"מ חיץ אצטט. לassay phosphatase להכין NP-פוספט עמ '5 מ"מ ב50 מ"מ אצטט חיץ; לassay β-glucosidase להכין NP-β-glucopyranoside עמ' 5 מ"מ; לassay Nagase להכין 2 מ"מ PNP-β-N-acetylglucosaminide. הכן את כל הפתרונות במצע 15 מיליליטר סטרילי או 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. ניתן לאחסן את הפתרונות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שבועות.
2. קביעת תקן להמרה ספיגת לריכוז NP p
- הכן את הפתרונות סטנדרטיים של p-nitrophenol ב50 מ"מ חיץ אצטט. ריכוזים צריכים לנוע .025-1 מ"מ.
- העברה שלושה משכפל של כל ריכוז 100 μl לmicroplate 96, גם ברור. הוסף 10 μl 1 M NaOH ו190 μl מזוקק H 2 O היטב כל אחד.
- שיא הספיגה ב 410 ננומטר באמצעות קורא microplate.
- ריכוזי כפל בעקומת הסטנדרט ידי 0.3 לקבל NP p μmoles ל300 μl עוצמת תגובה. עלילה עקומה של הספיגה לעומת μmole של NP p. שיפוע העקום משמש כמקדם ההמרה (C) שיתייחס לספיגת μmole של NP עמ 'בכל תגובת אנזים.
3. ניצוח Assay האנזים
- עבור קרקע, להכין את התרחיף של כל דגימה להיות assayed בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר סטרילי בconcentration של כ 1 גר '/ מיליליטר -1 באמצעות 50 מ"מ חיץ אצטט. למשקעים, להוסיף מספיק חיץ אצטט לעשות slurry קלות pipettable. נפח תרחיף צורך המדויק ישתנה בהתאם למספר האנזימים assayed, אבל מינימום של 5 מיליליטר מומלץ. ורטקס כל slurry עד שכל הגושים של אדמה או משקעים התפזרו ולב הנפח הסופי.
- Re-מערבולת כל slurry ו פיפטה מייד 150 μl לכל אחד משש בארות בגוש 96 היטב deepwell (איור 1). חשוב מערבולת ביסודיות ולעתים קרובות על מנת לשמור על חלקיקי קרקע בהשעיה. להשאיר לפחות שתי בארות לכל בלוק ריקים כדי לשמש שליטת מצע. הערה: קליפ סוף הטיפים פיפטה עם מספריים לפני pipetting כslurries אדמה נוטה לסתום טיפים. הכן את בלוק 96 היטב אחד לכל אנזים להיות assayed.
- יוצקים כ 5 מיליליטר של חיץ אצטט לתוך מאגר פיפטה ולהשתמש pipettor 8 ערוצים להוסיף 150 μl של החיץ לליטרAST שתי בארות של כל דגימה (אלה יהיו פקדי חיץ מדגם) ושתי בארות שליטת מצע (איור 1)
- יוצקים כ 10 מיליליטר של פתרון NP-מצע p המתאים למאגר פיפטה ולהשתמש pipettor 8 ערוצים להוסיף 150 μl של פתרון המצע לארבע הבארות הראשונות של כל דגימה ושתי בארות שליטת מצע (איור 1). שים לב לזמן כתגובה מתחילה ברגע שפתרון המצע הוא הוסיף.
- דגירה צלחות ב RT (22 מעלות צלזיוס) במשך 0.5-4 שעה. זמן דגירה מדויק משתנה בהתאם לרמת פעילות בדגימות והאנזים להיות assayed. עבור רוב הקרקעות ומשקעים, phosphatase וβ-glucosidase דורשים פעמים דגירה של 0.5-1.5 שעה, ואילו Nagase ואנזימים אחרים דורשים פעמים דגירה של> 2 שעות.
- בעוד מבחני דוגרים להכין 96 היטב ברור microplates לקרוא הספיגה. הכן microplate אחד עבור כל בלוק deepwell (כלומר עבור כל דוארnzyme assayed). פיפטה 10 μl 1 M NaOH ו190 μl של מים מזוקקים לתוך באר כל microplate. הערה: NaOH מאט את התגובה האנזימטית ומעלה את רמת החומציות אשר משפרת את הצבע של NP p שוחרר במהלך התגובה.
- לאחר דגירה, צנטריפוגות בלוקים 96 היטב ב2,000-5,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה חלקיקי קרקע.
- השתמש פיפטה רבה לסגת 100 μl מכל באר, להיות זהיר, כדי למנוע את הכדור, ולהעביר אותו למתאים גם בmicroplate 96, גם ברור שהוכן.
- הפעל את קורא microplate ולהגדיר כל תוכנה נחוצה. שיא הספיגה ב 410 ננומטר. אם הספיגה טובה במיוחד היא מעל לגבול גילוי ליניארי של קורא הצלחת, לדלל היטב כי 01:01 עם מים ומחדש מידה. אם הספיגה היא עדיין גבוהה מדי, assay יש לחזור עם זמן דגירה קצר יותר.
4. קביעת יבש ההמונית של דוגמאות
- פיפטה 1 מיליליטר של כל sampl תרחיף דואר לתוך מחבת אלומיניום preweighed.
- יבש בתנור ייבוש 75 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות ולשקול. הפחת את המשקל של את המחבת מהערך הזה כדי להשיג את המסה היבשה של אדמה או משקעים ב 1 מיליליטר של התרחיף. תכפיל בפקטור של 0.15 כדי לקבוע את המסה היבשה של מדגם בμl 150 מתווסף גם כל בassay האנזים.
5. חישוב פעילות אנזים ליבש המוני של קרקע או משקעים
- חישוב הספיגה סופית של כל דגימה על ידי הפחתת ספיגת שליטת מדגם מספיגת assay המדגם. אם יש לי פקדי מצע גבוהה הספיגה (בערך> 0.060) אחר כך להפחית אותם גם.
- חישוב פעילות אנזים במסה יבשה μmoles גרם -1 שעה -1 מהמשוואה:
פעילות אנזים = הספיגה סופית / (מסת x C מדגם x זמן דגירה יבשה)
ניתוח של פלורסנט התאי אנזים פעילות בטבע ווטרס
פתרונות TLE "> 1. הכנת המצע, רגיל, והצפה לניתוח fluorometric של אנזים פעילות- הכן 200 מיקרומטר פתרונות של מצעי MUB צמודים (למשל 4-MUB-β-glucopyranoside, 4-MUB פוספט, 4-MUB-N-אצטיל-β-D-glucosaminide) על ידי המסת המצע המתאים בסטרילי (autoclaved) מזוקק H 2 O ב15 מיליליטר סטרילי או 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. לעטוף את הצינורות בנייר אלומיניום, כדי להוציא לאור ולאחסן במקרר לפני השימוש. מצעים צריכים להיות יציבים במשך שבוע לפחות 1 אם מאוחסנים בדרך זו.
- הכן סטנדרטי MUB על ידי ביצוע פתרון מניות של 100 מיקרומטר 4-methylumbelliferone בסטרילי H מזוקק 2 O. חנות בקירור בענבר או בקבוק עטוף בנייר אלומיניום. מייד לפני השימוש, לדלל את פתרון 100 המניה מיקרומטר ידי 1/10 לסטרילי H 2 O כדי להפוך את פתרון עבודה של 10 מיקרומטר עבור מבחני אנזים.
- הכן פתרון מניות של 100 חיץ ביקרבונט מ"מ על ידי המסת 8.4 גרם של NaHCO <תת> 3 לתוך 1 LH 2 O ומעוקר. לדלל פתרון מניות זה 1/20 לסטרילי H 2 O לפי צורך כדי להפוך את פתרון עבודה של 5 מ"מ עבור מבחני אנזים.
2. דגימות מים ארגון על 96, גם השחורה Microplate
- לארגן microplate לכל אנזים בעקבות הדוגמא שמוצגת באיור 2. שים לב שמאפשר שכפול נאות, סטנדרטים, ופקדים, הליך זה יכול assay את פעילותו של אנזים בודד לתקופה של עד תשע דגימות מים על microplate השחור 96 היטב אחד.
- יוצקים כ 5 מיליליטר של המדגם הראשון לתוך מאגר פיפטה ולהשתמש pipettor 8 ערוצים לpipette200 μl לכל הבארות בטור 1 של microplate (ים). מחק טיפים פיפטה משומשים וחזור לפי צורך עבור כל דגימת מים כדי למלא עמודי 1-9.
3. הגדרה לדוגמא, תקן, להרוות, ובקרת תשתית
- הגדרת בקרות לחשבון עבור דגימות, סטנדרטיותים, מצע ומרווה באותו microplate השחור כמו הדגימות (איור 2).
- פקדים לדוגמא מכילים מים מדגם חיץ ביקרבונט, ואינם משמשים בחישובי הפעילות אבל ידגימו קריאת עקביות לאורך כל תקופת הניסוי. הפקדים להרוות מורכבים ממי מדגם וכמות סטנדרטית של תג הניאון ומשמשים למדידה העקיפה של הקרינה במים לדוגמא. מצע ופקדים סטנדרטיים מורכבים מחיץ או צמוד מצע או תג הניאון הסטנדרטי, בהתאמה, וסודה לשתייה.
- יוצקים כ 5 מיליליטר של 5 מ"מ חיץ ביקרבונט למאגר פיפטה נקי. פיפטה 50 μl של חיץ לתוך בארות microplate 1 עד 9 בשורות D ו-E ליצירת שני לשכפל בארות מדגם פקדים לדגימה. הטיפים פיפטה השינוי לאחר מכן להעביר 200 μl של חיץ ביקרבונט לבארות 10 דרך 12 בשורות וה '
- להפחית תאורה מפוזרת על ידי עמעום או כיבוי lights כתקן הניאון הוא רגיש לאור.
- יוצקים כ 5 מיליליטר של 10 מיקרומטר 4 methylumbelliferone-לתוך מאגר פיפטה נקי. פיפטה 50 μl לתוך בארות microplate 1 עד 12 בשורה H, ולתוך בארות 1 עד 9 לתוך שורות G ו F כדי ליצור שלושה משכפל של בקרות להרוות לדגימה ופקדים סטנדרטיים הכלליים. כך או למקם microplate בחושך או לכסות עם מכסה אטום כדי להפחית השפלה אור MUB.
- הפעל את fluorometer והגדרה כל תוכנה נחוצה כדי להיות מוכן לקריאה לפני הוספת המצע. שים לב: כמה נורות fluorometer עשויות לדרוש זמן חימום של 3 דקות או יותר.
- יוצקים כ 5 מיליליטר של המצע המתאים MUB הצמוד (למשל 4-MUB פוספט) לתוך מאגר פיפטה נקי. השתמש pipettor 12 ערוצי פיפטה 50 μl לתוך בארות microplate 1 עד 12 בשורה, ולתוך בארות 1 עד 9 בשורות B ו-C כדי ליצור שלושה מבחני לשכפל עבור כל דגימה ושלושה פקדי מצע. Immediately המשך לשלב 4.1, הקרינה הקלטה.
4. הקרינה הקלטה
- קראו את הקרינה הראשונית מייד לאחר בנוסף מצע לmicroplate. אחרי שקראתי את הקרינה, דגירה microplate ב RT (22 מעלות צלזיוס) או בחושך או מכוסה במכסה אטומה כדי להפחית השפלה אור MUB.
- זמן הדגירה הנדרש כדי למדוד את פעילות האנזים הפוטנציאלית המרבית בדגימת מים יהיה תלוי בריכוז האנזים בתוך המדגם. מכיוון שזו אינה ידועה לפני assay הושלם, microplate יצטרך לקרוא בצעדי זמן מרובים. בדרך כלל, קריאה במרווחים של 10-15 דקות במשך 1 שעות מקובלת לאנזימים רבים, אם כי דגימות עם פעילות גבוהה מאוד על אנזימים מסוימים עשויות להגיע לשיא לפני 10 דקות.
- המשך קריאת הקרינה בmicroplate במרווחי הזמן המיועד שלך במשך שעה לפחות 1. הקפד לשמור מכוסה microplate או בחושך בין הקריאהs.
5. חישוב פעילות האנזים לנפח מים
- עבור כל דגימה בכל מרווח זמן לחשב את: אומר הקרינה מדגם ראשונית (בארות D ו-E), הקרינה הממוצעת הסופית המדגם (בארות AC), הקרינה הממוצעת סטנדרטית (בארות H10-11), ומתכוונים להרוות את הקרינה שליטה (הבארות FG).
- לכל מרווח זמן, לחשב פעילות אנזים בשעת nmoles -1 מיליליטר -1 מהמשוואה:
פעילות אנזים = (כלומר הקרינה מדגם - כלומר הקרינה מדגם ראשונית) / ((x אומר הקרינה / 0.5 mol הסטנדרטי) (מתכוון להרוות את הקרינה שליטה / אומר x הקרינה הסטנדרטי) (0.2 מיליליטר) x (פעם בשעה))
- בדוק את ערכי הפעילות מחושבים לכל שלב זמן. קבע פעילות פוטנציאל סופית מהצעד הזמן עם הפעילות הגבוהה ביותר. אם ערכי פעילות ימשיכו לעלות ולאחר מכן צעדי מועד מאוחר יותר ייתכן שיידרשו, אם ערכי פעילות ליפול througהאוט במהלך הריצה, ולאחר מכן להפעיל שוב עם צעדי זמן קצרים יותר. הפעילות האחרונה היא בnmoles של מצע נצרך שעה -1 מיליליטר -1 אך ניתן לשנותם עד כדי להביע כμmoles שעה -1 L -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קרקעות ומשקעים ימיים יש בדרך כלל רמות ניכרות של פעילות אנזים תאית כתוצאה מקהילות המצורפות חיידקים (biofilms) גובר על פני השטח של חלקיקים. איור 3 מראה כיצד פעילות זו משתנה בהתאם לגודל של חלקיקים המתקבלים מהמשקעים של כשליש המשטח זרם כדי שבצפון מיסיסיפי, ארה"ב. מחקר קודם הראה כי קהילות חיידקים על חלקיקי משקעים מהזרם הזה ניתן להפריד לשלוש קבוצות מובחנות המבוססות על ניתוח מולקולרי של מבנה הקהילה שלהם: אלה ב0.063 חלקיקי מ"מ, אלה על 0.125, 0.25, ו0.5 מ"מ חלקיקים, ואלה ב -1 מ"מ חלקיקי 15. ניתוח של דפוסים בפעילות אנזים תאי תומך במסקנה זו; עם (איור 3 א) phosphatase להיות דומה ב0.125, 0.25, ו0.5 מ"מ חלקיקים אבל הרבה יותר גבוה שבברים 1 ו0.063 מ"מ כאשר נמדדו תוך שימוש בטכניקת המצע צמוד NP p. Oאנזימי יס כגון β-glucosidase (איור 3), וNagase (איור 3 ג) להראות פסגות דומות בחלקיקים המשובחים ביותר, אך אינם גבוהים על חלקיקי 1 מ"מ, המדגישים את העובדה שאנזימים שונים עשויים להראות הפצות סביבתיות שונות ואלה יכולים להיות הובהר באמצעות assay. הברים השגיאה נמוכים יחסית מראים כי מבחני colorimetric של פעילות אנזים על משקעים הם לשחזור, ולכן ניתן לניתוח סטטיסטי בהשוואה בין דגימות סביבתיות שונות.
מי טבע נוטה להיות בעלי פעילות נמוכה תאית אנזים לכל מיליליטר מקרקעות או משקעים לעשות לגרם. ככזה, הם צריכים להיות assayed fluorometrically באמצעות מצעים MUB צמודים. איור 4 מראה כיצד פעילותם של האנזימים פוספטאז (איור 4 א), β-glucosidase (איור 4), וNagase (איור 4C) משתנים עם עומק באגם רדוד בצפון מיסיסיפי, ארה"בא האגם (boondoggle האגם) ידוע להיות 16 תזונתיים ירודים, שגם היא הוצעה על ידי הפעילות גבוהה יחסית של phosphatase (איור 4 א), אנזים שמיקרואורגניזמים לייצר על מנת לרכוש פוספט מתרכובות אורגניות. לכל שלושת האנזימים assayed, דגימות שנאספו על פני המים (0 סנטימטר) ו50 סנטימטר עומק הראו פעילות דומה, ואילו פעילות הייתה גבוהה במדגם 100 סנטימטר. מדגם זה בעצם נלקח מממשק מים המשקע, ואת הנוכחות של חלקיקי משקעים במדגם סביר חשבונות עבור הפעילות גבוהה יותר ניתן לראות בדוגמה זו, במיוחד עבור β-glucosidase וNagase. כמו עם מצעי NP p, הברים השגיאה הנמוכה מראים כי אפילו עם רק שלוש קריאות לשכפל, שחזור של מבחני fluorometric באמצעות מצעי MUB הוא גבוה.
שים לב שיחידות לאיור 4 נמצאות בnmoles של מצע נצרך ואילו אלה לאיור 3נמצא בμmoles של המצע הנצרך, למרות שגודל יחידה לדומה (או לכל מיליליטר או לז). זה מדגיש את העובדה שקרקעות ומשקעים נוטים להיות פעילות תאית גבוהה בהרבה ממים הטבעיים (הפעילות של כל אנזים ספציפי באיור 3 הן גבוהה בכ 10-100x מהפעילות של האנזים המקביל באיור 4). הוא גם ממחיש את הרגישות המוגברת של טכניקת MUB צמודת המצע, ואת הצורך בשימוש בטכניקה הזו למנסה לאמוד פעילות אנזים תאית בדגימות מים.
איור 1. פריסה מוצעת של לוקי 96 היטב גם עמוק עבור assay של פעילות אנזים תאית בקרקעות או משקעים באמצעות ים צמוד NP p colorimetricטכניקת ubstrate. כל גם צריך לקבל סך של 300 μl, מורכב מתרחיף מדגם, פתרון מצע, או אצטט חיץ תלוי אם זה ריצת מדגם, בקרת מדגם, או שליטת מצע.
איור 2. פריסה מוצעת של 96, גם שחור microplates עבור assay של פעילות אנזים תאית בדגימות מים באמצעות טכניקת מצע MUB צמודת fluorometric. ניתן לארגן תשע דגימות אנכית על () הצלחת כל כובש שמונה בארות. שמונה בארות אלה משמשות לריצות לדוגמא, פקדי מדגם, ולהרוות את הפקדים ואילו בארות שנותרו משמשות עבור פקדי מצע וסטנדרטים MUB (ב ').
איור 3. פעילות תאית אנזים בגדלים שונים של חלקיקי משקעים שנאספו ממשטח זרם קטן בצפון מיסיסיפי, ארה"ב. כל שבריר גודל חלקיקים הייתה assayed לפעילות של phosphatase (), β-glucosidase (ב '), וNagase (C) הבא הליך colorimetric p NP-מצע. פעילות מדווחת במצע μmoles גרם -1 hr המוני יבש נצרכו של משקעים -1 והוא הממוצע (+ SE) של שלוש קריאות לשכפל לשבריר גודל חלקיקים.
איור 4. פעילות אנזים תאית במים שצולמו בשלושה difמעמקי ferent (0, 50, ו100 סנטימטר) מאגם רדוד בצפון מיסיסיפי, ארה"ב. המים היו assayed לפעילות של phosphatase (), β-glucosidase (ב '), וNagase (C) הבא MUB-המצע הליך fluorometric. פעילות מדווחת במיליליטר -1 שעות נצרך מצע nmoles של מים ו -1 היא הממוצע (+ SE) של שלוש קריאות לשכפל לדגימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קביעת הפעילות של מגוון רחב של אנזימים תאיים של חיידקים בקרקעות ומשקעים יכולות לספק תובנות שימושיות לשיעורים של מינרליזציה התזונתית ועיבוד חומר אורגני 17. עם זאת, קרקעות יכולות להשתנות ברמות הלחות שלהם, ולכן חשוב לבצע סטנדרטיזציה של פעילות למשקל יבש אדמה. זה דורש צעד נוסף ייבוש (בדרך כלל של שני ימים) מעבר פשוט מדידת פעילות אנזים. לפיכך, בניגוד למבחנים של פעילות אנזים בדגימות מים המספקות ליד תוצאות מיידיים, מבחני אמינים של פעילות אנזים באדמה ומשקעים לקחת כמה ימים. עבור חלק מקרקעות, זה עשוי אפילו להיות מתאים יותר להביע את הפעילות לגרם של חומר אורגני או מסה יבשה אפר חופשי, דורש צעד נוסף ashing (בדרך כלל שעה 2 ב 500 מעלות צלזיוס) מעבר להליך הייבוש. בכל מקרה, השלב הקריטי ביותר בassay colorimetric של פעילות אנזים קרקע או משקע הוא הנסיגה של supernatant מF הבלוק העמוק היטבollowing צנטריפוגה בתום תקופת הדגירה. מכיוון שהליך זה מסתמך על מדידת הספיגה, גם את נוכחותם של כמה חלקיקי אדמה תועים בmicroplate הסופי יכולה להוביל לתוצאות מזויפות. מהירויות גבוהות יותר צנטריפוגה (XG> 5,000) עשוי לעזור להפחית את הבעיה הזו, אבל ברוטורים צנטריפוגות הניסיון שלנו שקבלו microplates בדרך כלל יש מגבלות סיבוב מתחת לסף זה, וחוסם את עצמם לא יכול לסבול את מהירויות גבוהות בהרבה. בעיקרו של דבר, צעד pipetting מסוים זה דורש שילוב של טיפול ומהירות להשתמש pipettor מרובים ערוצים להעביר במהירות את הכמות הנדרשת של supernatant מהגוש העמוק היטב לmicroplate.
יש מבחני של פעילות אנזים תאית בדגימות מים לא את הצורך בתקופת ייבוש ולא צעד צנטריפוגה, האפשרות השנייה, כי שניהם תגובת אנזים-המצע והמדידה של הקרינה של המוצר הסופי מתרחשים באותו microplate. כאמור, אלהssays הם בדרך כלל מהיר יותר וייתכן שבתחילה נראה קל יותר להפעלה. עם זאת, יש להם המגבלות שלהם בזה, בכל ההזדמנות אפשרית, סטנדרטי MUB ומצעי MUB צמודים לא צריכים להיות חשופים לאור. מניסיוננו, לעמעם את האורות ככל האפשר במהלך pipetting ודוגר microplates בחושך (או מכוסה במכסה אטומה) הוא הכרח. מכיוון שמבחנים אלה דורשים גם צלחות יש לקרוא בנקודות זמן רבות, זה לעתים קרובות תוצאות הצורך במיתוג מהיר מאוד בין הצלחות כשמנסים לאמוד אנזימים מרובים באותו הזמן. לדוגמא, כדי assay תשע דגימות מים לפעילותם של שישה אנזימים בו זמנית (כלומר, באמצעות שישה microplates שונה), הוא הופך להיות נחוץ כדי לקרוא את לוחית כל 2 דקות לשעה 1 על מנת להבטיח שכל צלחת אדם לקרוא כל 10 -15 דקות (במקרה זה, כל 12 דקות). יש להקפיד לעקוב אחר צלחת המסוימת להיות לקרוא, כמו גם כדי לוודא ששום נוזל שנשפך לכאן ולכאןמ 'את הצלחת כפי שהוא מועבר לתוך ומחוץ לfluorometer microplate. כשמנסים לאמוד אנזימים מרובים בבת אחת, חשוב גם לזכור את הזמן שלוקח לקורא microplate כדי באמת לקרוא את הצלחת ולהתנודד קריאת מרווחים בהתאם. דאגה סופית עם assay הניאון של פעילות אנזים תאית בדגימות מים היא בעבודה עם דגימות כי הם עכורים. דגימות מים המכילות חלקיקים מרחפים צריכים להיות מזועזעים בתחילה לפני ששופכים לתוך מאגר פיפטה וערבבו שוב על ידי נסיגה ולהוציא עם pipettor לפני שהועמס על microplate. מספרים גבוהים יותר של חלקיקים במדגם גם בדרך כלל תוצאות מרווה גדולה יותר של אות הניאון, ואת החשיבות של בקרות להרוות עבור כל דגימה לא יכולה להדגיש מספיק.
אמנם בדרך כלל מצעי MUB וp NP צמודים מראים ערכי מקסימום V הדומה לאנזימים סביבתיים, הערכים מ 'Kיכול להיות שונה, ואנזימים כגון β-glucosidases וphosphatases ייתכן שיש זיקה גבוהה יותר עבור מצעי MUB צמודים מאשר אנלוגים צמודים NP p שלהם 14. לכן, מצעי MUB צמודים צפויים להיות רגיש יותר מצמודי NP עמ ', אשר טוען כי הם יהיו בחירה טובה יותר לשימוש בעת מדידת פעילות אנזים בקרקעות ומשקעים. עם זאת המוצר הסופי fluorogenic שנמדד במהלך מבחני MUB כפוף למרווה פוטנציאלית בכמה תמציות אדמה, וקריאות הקרינה יכולות להיות יציבה לאורך זמן 12. קרקעות ומשקעים גם נוטים להיות פעילות אנזים תאית גבוהה יותר ממים הטבעיים, ולכן הרגישות המוגברת של מבחני MUB צמודי fluorometric עשויה להציע יתרון קטן על פני שיטות NP p colorimetric נתון בעיות הפוטנציאליות עם מרווה בעת ניתוח קרקעות מסוימות. בתור הערה צדדית, מצעים צמודים NP p והסטנדרטי NP p עצמו הוא בדרך כלל יותר affordable מאשר עמיתי MUB; סיבה נוספת לשימוש שלהם אם מגבלות תקציביות ליישם.
אולי ההיבט החשוב ביותר של יכולת assay פעילות אנזים תאית של חיידקים בסביבות ימיות ויבשתיות הוא שבעוד שטכניקות אלה למדוד תהליכים פיסיולוגיים של חיידקים, יש תהליכים אלה השפעה ישירה על שינויים ברמת המערכת האקולוגית של פחמן וחומרים מזינים. מחירים של פירוק חומר אורגני נקשרו ישירות לפעילות של cellulases תאי במשקעים 18,19, כך שמדידות מהירה של פעילות אנזים שעלול להקל על הקביעה מיידית בשיעורי פירוק אתר בדגימות סביבתיות. תוך שימוש בגישות microplate תפוקה גבוהות מאפשרת המדידה בו זמנית של פעילות אנזים במספרים גדולים יותר של דגימות מאשר גישות צינור יחיד טיפוסיות יותר, כך תרגיל שבפעילות אנזים (ובהרחבה בתהליכים ברמת המערכת האקולוגית) בשו"תonse לגורמים כגון עומק 20 או הפרעות סביבתיות 9,21 יכול להיבחן. בדומה לכך, מבחני של אנזימים מעורבים ברכיבה על אופניים מזינים, כגון phosphatase וNagase, יכולים לספק תובנות על הגבלה תזונתית בסביבה מסוימת, למשל, את החשיבות היחסית של זרחן האורגני לחנקן אורגני במהלך פיתוח קרקע 8.
בגלל פעילות האנזים נמדדה בדגימות סביבתיות במשך למעלה משלושים שנים, השוואות בין מחקרים באמצעות meta-ניתוחים מתקדמים נמצאות כעת הופכות אפשריות. מחקרים אלה מראים כי, בשיעורים בקנה מידה הגלובלית, פעילות אנזים, ולכן פירוק של חומר אורגני ומינרליזציה התזונתית, קשורים לחומציות, זמינות מצע, והרכב תזונתי 17. במקביל, השימוש בפרוטוקול המבוסס על microplate החל להתיר ניתוח דפוסים בקנה מידה בסדר בפעילות אנזים באמצעות טכניקות מיפוי geostatistical 22
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מימון להיבטים של עבודה זו סופק על ידי מקורות שונים, כולל ארצות הברית מחלקת חקלאות ההסכם שיתופי ספציפי 58-6408-1-595 והקרן הלאומית למדע (הפרס 1,049,911).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers | ||
References
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
- Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
- Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
- Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
- Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
- Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
- Hoppe, H. -G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
- Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
- Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
- Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
- Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
- Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
- Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
- Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).
