Summary
Microplaat procedures beschreven voor de colorimetrische of fluorometrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit. Deze procedures zorgen voor de snelle bepaling van een dergelijke activiteit in grote aantallen milieu-monsters er binnen afzienbare tijd frame.
Abstract
Een groot deel van de cycli van nutriënten en koolstof verwerking in natuurlijke omgevingen gebeurt door de activiteit van extracellulaire enzymen vrij door micro-organismen. Zo kan het meten van de activiteit van deze extracellulaire enzymen inzicht te geven in de tarieven van de ecosysteem-niveau processen, zoals afbraak van organisch materiaal en stikstof en fosfor mineralisatie. Testen van extracellulaire enzymactiviteit in milieu monsters gewoonlijk uit het blootstellen van de monsters naar kunstmatige colorimetrische of fluorometrische substraten en het bijhouden van de snelheid van substraathydrolyse. Hier beschrijven we microplaat-methoden, voor deze procedures die de analyse van grote aantallen monsters binnen een kort tijdsbestek mogelijk te maken. Monsters worden reageren met kunstmatige substraten in 96 putjes microplaten of diepe microplaat blokken en enzymactiviteit wordt vervolgens bepaald door absorptie of fluorescentie van het verkregen eindproduct met een typische microplaat lezer of fluorometer. Dergelijke hoge throughput procedures niet alleen vergelijkingen tussen ruimtelijk verschillende plaatsen of ecosystemen vergemakkelijken, maar ook de kosten van dergelijke tests aanzienlijk beperken door algemene reagensvolumes nodig per monster.
Introduction
Micro-organismen zoals bacteriën en schimmels verkrijgen voedingsstoffen en koolstof uit complexe organische verbindingen door de productie van extracellulaire enzymen. Deze enzymen hydrolyseren typisch polymeren in kleinere subeenheden die in de cel kan worden genomen. Daarom op een ecologisch vlak, deze microbiële extracellulaire enzymen verantwoordelijk voor veel van de voedingsstoffen mineralisatie en afbraak organische materie die voorkomt in de natuur. Enzymen zoals cellobiohydrolase (CBH) en β-glucosidase zijn belangrijk voor degradatie van cellulose en werken samen om de hydrolyse van cellulose tot glucose 1,2, die bruikbaar koolstofsubstraat voor opname en microbiële assimilatie zorgt katalyseren. Het enzym fosfatase releases oplosbare anorganische fosfaatgroepen van organofosfaten, wezen mineralisatie van fosfaat en beschikbaar te maken voor gebruik door de meeste organismen 3. Andere enzymen, zoals N-acetylglucosaminidase (NAGase) zijn important in chitine degradatie en kan zowel koolstof en stikstof beschikbaar voor microbiële overname 4 maken.
Een van de procedures voor de bepaling van microbiële extracellulaire enzymactiviteit in de natuur is het gebruik van kunstmatige p-nitrofenyl (p NP) verbonden substraten, een benadering die oorspronkelijk werd ontwikkeld bodem fosfataseactiviteit 5 detecteren. Deze benadering berust op de detectie van een gekleurd eindproduct, p-nitrofenol, dat vrijkomt wanneer de kunstmatig substraat wordt gehydrolyseerd door het geschikte enzym. De p-nitrofenol kan vervolgens colorimetrisch gekwantificeerd door het meten van de absorptie bij ongeveer 400-410 nm. Deze methode is vervolgens toegepast op andere enzymen zoals NAGase 6 detecteren, en is gebruikt in verschillende onderzoeken naar microbiële extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten 7-9.
Een alternatieve benadering die originall wasy ontwikkeld om extracellulaire glucosidasewerkzaamheid beoordelen in het aquatisch milieu 10,11 maakt gebruik van 4-methylumbelliferon (MUB) gekoppeld substraten. Het eindproduct uitgebracht (4-methylumbelliferon) is sterk fluorescerende en kan worden gedetecteerd met behulp van een fluorometer met een excitatie / emissie instelling rond 360/460 nm. Diverse MUB-gekoppelde kunstmatige substraten zijn, waardoor de fluorometrische meting van de activiteit van ten minste evenveel enzymen (bijv. β-glucosidase, cellobiohydrolase, NAGase, fosfatase) zoals kan worden bepaald met de p NP-substraat colorimetrische werkwijze. Andere microbiële extracellulaire enzymen, zoals eiwit-afbrekende leucine aminopeptidase kan fluorometrisch worden getest met 7-amino-4-methylcumarine (COU) verbonden substraten. Zowel MUB-en COU-gekoppelde substraten zijn gebruikt om enzymactiviteit te bepalen in verschillende terrestrische en aquatische monsters 12,13.
Hoewel eerdere studies hebben descrIBED fluorometrische of colorimetrische microplaat benaderingen van extracellulaire enzymactiviteit 14 te bepalen, er is behoefte aan een duidelijke presentatie van hoe dergelijke tests uit te voeren. Hier laten we procedures voor de high throughput microplaat voor de analyse van extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten met de colorimetrische p-NP verbonden substraten benadering en in natuurlijk water via de fluorescente MUB verbonden substraten techniek. Wij richten ons op de meting van de activiteiten van β-glucosidase, NAGase en fosfatase als deze enzymen respectievelijk kunnen worden gekoppeld aan koolstof, stikstof en fosfor fietsen. Echter, de hier beschreven procedures voor bepaling van andere extracellulaire enzymen met verschillende artificiële substraten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Colorimetrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten
1. Voorbereiding van de ondergrond en Buffer oplossingen voor Colorimetric Analyses enzymactiviteit
- Bereid 50 mM acetaatbuffer (pH 5,0-5,5) door mengen van 50 ml 0,1 M azijnzuur (2,87 ml ijsazijn op in 500 ml water), 150 ml 0,1 M natriumacetaat en 200 ml gedestilleerd H2O Breng de pH op 5,0-5,5 met 0,1 M azijnzuur indien nodig.
- Bereid een oplossing van 1 M natriumhydroxide (NaOH) in gedestilleerd H2O
- Bereid p-NP verbonden substraatoplossingen in 50 mM acetaatbuffer. Voor het analyseren fosfatase bereiden 5 mM p NP-fosfaat in 50 mM acetaatbuffer, om assay β-glucosidase bereiden 5 mM p NP-β-glucopyranoside, om assay NAGase bereiden 2 mM pNP-β-N-acetylglucosaminide. Bereid alle substraatoplossingen in steriele 15 ml of 50 ml centrifugebuizen. Oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 2-3 weken.
2. Bepaling van een standaard te converteren Absorbance p NP Concentratie
- Bereid standaardoplossingen van p-nitrofenol in 50 mM acetaatbuffer. Concentraties te variëren ,025-1 mM.
- Overdracht drie replicaten van 100 pi van elke concentratie namelijk 96-well microplaat. Voeg 10 gl 1 M NaOH en 190 gl gedestilleerd H2O aan elk putje.
- Record absorptie bij 410 nm met behulp van een microplaat lezer.
- Vermenigvuldig concentraties in de standaard curve van 0,3 tot umol p NP per 300 ul reactie volume krijgen. Maak een bocht van de absorptie tegen de umol p NP. De helling van de kromme dient als omzettingsfactor (C) die absorptie hebben betrekking op pmol p NP elke enzymreactie.
3. Het uitvoeren van de Enzyme Assay
- Voor bodem, stelt een suspensie van elk monster worden bepaald in een steriele 15 ml centrifugebuis op concentratie van ongeveer 1 g / ml -1 met 50 mM acetaatbuffer. Voor sedimenten, voeg genoeg acetaat buffer aan de suspensie gemakkelijk pipettable maken. Het juiste volume suspensie nodig zullen variëren afhankelijk van het aantal enzymen getest, maar ten minste 5 ml aanbevolen. Vortex elk slurry totdat alle groepjes van bodem of sediment hebben verspreid en noteer het uiteindelijke volume.
- Opnieuw vortex elk suspensie onmiddellijk pipet 150 pi in elk van zes putjes op 96-well deepwell blok (figuur 1). Het is belangrijk vortex grondig en regelmatig om vuildeeltjes in suspensie te houden. Laat minstens twee putjes per blok leeg te dienen als een substraat controle. Opmerking: clip eind pipetuiteinden met een schaar voorafgaand aan pipetteren als bodem slurries neiging om tips verstoppen. Bereid een 96-wells blok voor elk enzym te worden getest.
- Verdeel ongeveer 5 ml acetaatbuffer een pipet reservoir en gebruik een 8-kanaals pipet 150 ul van de buffer aan de last twee putjes van elk monster (deze zullen monsterbuffer controles) en de twee substraat controleputjes (figuur 1)
- Giet ongeveer 10 ml van de geschikte p NP-substraatoplossing in een pipet reservoir en gebruik een 8-kanaals pipet 150 pi van de substraatoplossing aan de eerste vier putjes van elk monster en de twee substraat controleputjes (figuur 1). Noteer de tijd de reactie begint zodra de substraatoplossing toegevoegd.
- Incubeer de platen bij kamertemperatuur (22 ° C) gedurende 0,5-4 uur. Exact incubatietijd is afhankelijk activiteit in monsters en het enzym worden bepaald. Voor de meeste bodems en sedimenten, fosfatase en β-glucosidase vereisen incubatie tijden van 0,5-1,5 uur, terwijl NAGase en andere enzymen vereisen incubatie tijd van> 2 uur.
- Terwijl assays zijn incubatie bereiden duidelijke 96-putjes te absorptie lezen. Bereid een microplaat voor elke deepwell blok (dwz voor iedere enzyme getest). Pipet 10 ul 1 M NaOH en 190 pi gedestilleerd water in elk putje van de microtiterplaat. Opmerking: NaOH vertraagt de enzymatische reactie en verhoogt de pH die de kleur van de p NP vrijkomt tijdens de reactie verhoogt.
- Na incubatie gecentrifugeerd 96 putjes blocks 2,000-5,000 g gedurende 5 min aan bodemdeeltjes pellet.
- Gebruik een multichannel pipet 100 pi trekken uit elk putje, let daarbij goed op de korrel te vermijden, en overbrengen naar de bijbehorende goed op voorbereid duidelijke 96-putsmicroplaat.
- Zet de microplaatlezer en het opzetten van de nodige software. Record absorptie bij 410 nm. Indien de absorptie van een bepaalde put boven de lineaire detectiegrens van de plaatlezer, die goed verdund 1:01 met water en opnieuw meten. Als absorptie nog te hoog is, moet de test worden herhaald met een kortere incubatietijd.
4. Bepaling van de droge massa van de monsters
- Pipetteer 1 ml van elk sampl e slurrie in een vooraf gewogen aluminium pan.
- Droog in een 75 ° C droogoven voor 48 uur en weeg. Trek het gewicht van de pan van deze waarde naar het drooggewicht van grond of sediment te vinden in 1 ml van de suspensie. Vermenigvuldigen met een factor 0,15 tot het drooggewicht van het monster te bepalen in de 150 pi aan elk putje toegevoegd in de enzymbepaling.
5. Berekening van de enzymactiviteit per drooggewicht van grond of sediment
- Bereken eindextinctie van elk monster door het aftrekken van de steekproef controle absorptie van het monster test absorptie. Als substraat controles hebben hoge absorptie (ongeveer> 0.060) aftrekken dan zijn die ook.
- Bereken enzymactiviteit in mmol hr -1 g droge massa -1 uit de vergelijking:
Enzymactiviteit = Final absorptie / (C x incubatietijd x monster drogestofgehalte)
Fluorescerende Analyse van extracellulaire enzymactiviteit in natuurlijke wateren
TLE "> 1. Voorbereiding van de ondergrond, Standard, en Buffer oplossingen voor Fluorometrische Analyses enzymactiviteit- Bereid 200 uM oplossingen MUB-gekoppelde substraten (bijv. 4-MUB-β-glucopyranoside, 4-MUB-fosfaat, 4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide) door oplossen van het substraat in geschikte steriele (geautoclaveerd) gedestilleerd H 2 O in steriele 15 ml of 50 ml centrifuge buizen. Wikkel buizen in aluminiumfolie om het licht uit te sluiten en op te slaan in de koelkast voor gebruik. Ondergronden moet stabiel zijn gedurende tenminste 1 week indien opgeslagen op deze manier.
- Bereid een MUB standaard door een voorraadoplossing van 100 uM 4-methylumbelliferon in steriel gedestilleerd H2O In de koelkast bewaren in oranje of folie verpakte fles. Onmiddellijk vóór gebruik verdunnen 100 uM voorraadoplossing van 1/10 in steriel H2O een werkoplossing van 10 pM voor enzym assays maken.
- Bereid een voorraad oplossing van 100 mM bicarbonaat buffer door het oplossen van 8,4 g NaHCO <sub> 3 in 1 LH 2 O en autoclaaf. Verdun deze stamoplossing 1/20 in steriele H 2 O als nodig is om een werkende oplossing van 5 mm voor enzymanalyses maken.
2. Het organiseren van watermonsters op een 96-Well Black Microplaat
- Dient een microplaat voor elk enzym overeenkomstig de in figuur 2 voorbeeld. Merk op dat het toestaan voor een adequate replicatie, normen en controles, deze procedure kan de activiteit van een enkel enzym assay voor maximaal negen watermonsters op een 96-wells zwarte microtiterplaat.
- Verdeel ongeveer 5 ml van het eerste monster in een reservoir pipet en gebruik een 8-kanaals pipet om pl pipette200 in alle putjes in kolom 1 van de microplaat (s). Gooi gebruikte pipet tips en herhalen als nodig is voor elk watermonster kolommen 1-9 te vullen.
3. Het opzetten van Sample, Standaard, Quench en Ondergrond Controls
- Opgezet controles om rekening te houden met monsters, standaards, substraat en afschrikken dezelfde zwarte microplaat de monsters (Figuur 2).
- Steekproef controles bevatten monster water en bicarbonaat buffer, en worden niet gebruikt in de activiteit berekeningen maar zal aantonen lezen van coherentie in de loop van het experiment. De demping controles bestaan van het monster water en een standaard bedrag van de tl-tag en worden gebruikt om de diffractie van de fluorescentie in de steekproef van het water te meten. Substraat en standaard controles zijn samengesteld uit of-substraat verbonden of de standaard tl-tag, respectievelijk, en bicarbonaat buffer.
- Verdeel ongeveer 5 ml 5 mM bicarbonaatbuffer in een schone pipet reservoir. Pipetteer 50 ul buffer aan putjes microplaat 1 tot 9 in rijen D en E vormen twee repliceren putjes van monster controles per monster. Verandering pipetuiteinden vervolgens overbrengen 200 ul van bicarbonaat putjes 10 tot en met 12 in Rijen A en H.
- Verminder omgevingslicht door het dimmen of uitschakelen van lights als de tl-standaard is lichtgevoelig.
- Verdeel ongeveer 5 ml 10 uM 4-methylumbelliferon in een schone pipet reservoir. Pipetteer 50 ul in microtiterplaat putjes 1 tot en met 12 in rij H, en in putten 1 tot en met 9 in Rijen G en F tot drie herhalingen van afschrik controles per monster en de algemene standaard controles vormen. Ofwel plaats de microplaat in het donker of bedekken met een ondoorzichtige deksel aan het licht degradatie van MUB verminderen.
- Zet de fluorometer en de set-up van alle benodigde software klaar om te lezen voordat u de ondergrond te zijn. Opmerking: sommige fluormeter bollen kan een warm-up tijd van 3 min of meer nodig.
- Verdeel ongeveer 5 ml van de geschikte MUB-gekoppelde substraat (bijv. 4-MUB-fosfaat) in een schone pipet reservoir. Gebruik een 12-kanaals pipet 50 ul pipet in microtiterplaat putjes 1 tot 12 in rij A en in putten 1 tot 9 in rijen B en C drie replica testen voor elk monster en drie controles substraat vormen. Immediately verder naar stap 4.1, opname fluorescentie.
4. Opnemen Fluorescentie
- Lees de initiële fluorescentie onmiddellijk na substraat naast de microplaat. Na het lezen van fluorescentie, incubeer de microplaat bij kamertemperatuur (22 ° C), hetzij in het donker of bedekt met een opake deksel lichtdegradatie van MUB verminderen.
- De incubatietijd nodig om de maximale potentiële enzymactiviteit in een watermonster maatregel zal afhangen van de enzymconcentratie in het monster. Aangezien dit niet bekend voordat de test is voltooid, wordt de microplaat moeten worden gelezen op verschillende tijdstippen stappen. Typisch lezen met intervallen van 10-15 min in de loop van 1 uur is aanvaardbaar voor vele enzymen, hoewel monsters met zeer hoge activiteit voor bepaalde enzymen piek bereikt voor 10 minuten.
- Lees verder fluorescentie in de microplaat op de door u tussenpozen gedurende minstens 1 uur. Zorg ervoor dat houden de microplaat bedekt of in het donker tussen lezens.
5. Berekening van de enzymactiviteit per volume water
- Voor elk monster op elk tijdsinterval berekenen: betekenen eerste steekproef fluorescentie (putten D en E), de gemiddelde uiteindelijke steekproef fluorescentie (putten AC), de gemiddelde standaard fluorescentie (putten H10-11), en de gemiddelde demping controle fluorescentie (wells FG).
- Voor elk tijdsinterval berekenen enzymactiviteit in nmol h -1 -1 ml van de vergelijking:
Enzymactiviteit = (gemiddelde monster fluorescentie - bedoel eerste steekproef fluorescentie) / ((gemiddelde standaard fluorescentie / 0,5 mol) x (gemiddelde controle fluorescentie doven / gemiddelde standaard fluorescentie) x (0,2 ml) x (tijd in hr))
- Onderzoek de activiteit worden berekend voor ieder keer stap. Bepaal laatste potentiële activiteit vanaf het moment stap met de hoogste activiteit. Als activiteit waarden blijven stijgen dan later stappen tijd kan nodig zijn, als activiteit waarden vallen throughout het verloop van de run, ren dan weer met kortere tijd stappen. Final activiteit is in nmol substraat verbruikt hr -1 ml -1, maar kan worden opgeschaald om uit te drukken als umol hr -1 L -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bodems en waterbodems hebben meestal aanzienlijke niveaus van extracellulaire enzymactiviteit als gevolg van de bijgevoegde microbiële gemeenschappen (biofilms) groeien op het oppervlak van deeltjes. Figuur 3 toont hoe deze activiteit is afhankelijk van de grootte van de deeltjes verkregen bij het oppervlak sediment van een derde orderstroom in het noorden van Mississippi, USA. Een eerdere studie heeft aangetoond dat de bacteriële gemeenschappen sedimentpartikels van deze stroom kan worden gescheiden in drie groepen op basis van moleculaire analyse van hun gemeenschap structuur: die op 0.063 mm deeltjes, die op 0,125, 0,25 en 0,5 mm deeltjes, en die op 1 mm deeltjes 15. Analyse van patronen in extracellulaire enzymactiviteit steunt deze conclusie, met fosfatase (figuur 3A) dat vergelijkbaar aan 0,125, 0,25 en 0,5 mm deeltjes maar veel hoger op de 1 en 0.063 mm fracties gemeten met de p-NP gekoppelde substraat techniek. Other enzymen zoals β-glucosidase (figuur 3B) en NAGase (figuur 3C) vertonen gelijkaardige pieken op de fijnste deeltjes, maar niet verhoogd op 1 mm deeltjes benadrukt het feit dat verschillende enzymen verschillende milieu distributies kunnen vertonen en deze kunnen worden opgehelderd met deze assay. De relatief lage foutstaven zien dat colorimetrische assays van enzymactiviteit op sedimenten reproduceerbaar zijn en dus vatbaar voor statistische analyse bij het vergelijken van verschillende milieu-monsters.
Natuurlijke wateren hebben meestal lagere extracellulaire enzymactiviteit per ml dan bodems en sedimenten doen per gram hebben. Als zodanig moeten zij fluorometrisch worden getest met MUB verbonden substraten. Figuur 4 toont hoe de activiteit van de enzymen fosfatase (figuur 4A), β-glucosidase (figuur 4B) en NAGase (figuur 4C) varieert met de diepte in een ondiep meer in het noorden van Mississippi, VSA. Het meer (Boondoggle Lake) is bekend dat voedselarme 16, die ook wordt gesuggereerd door de relatief hoge activiteit van fosfatase (figuur 4A), een enzym dat micro-organismen produceren om fosfaat te nemen van organische verbindingen. Voor alle drie de enzymen getest, monsters verzameld op het wateroppervlak (0 cm) en 50 cm diepte toonde vergelijkbare activiteit, terwijl activiteit werd verhoogd in de 100 cm monster. Dit monster werd in hoofdzaak uit het water-sediment interface en de aanwezigheid van sediment deeltjes in het monster waarschijnlijk verklaart de hogere activiteit waargenomen in dit voorbeeld met name voor β-glucosidase en NAGase. Zoals bij de p NP substraten, de lage foutbalken blijkt dat zelfs met slechts drie herhaalde metingen, de reproduceerbaarheid van de fluorometrische bepalingen met MUB substraten is hoog.
Merk op dat eenheden Figuur 4 zijn in nmol substraat verbruikt terwijl die voor Figuur 3in umol substraat geconsumeerd, terwijl het unitgrootte vergelijkbaar (of per ml of per gram). Dit benadrukt het feit dat bodems en sedimenten meestal veel hogere extracellulaire activiteit dan natuurlijke wateren (de activiteiten van elk specifiek enzym in figuur 3 zijn ongeveer 10-100x hoger dan de activiteiten van de equivalente enzym in figuur 4) hebben. Het toont ook de verhoogde gevoeligheid van de MUB-gekoppelde substraat techniek en de noodzaak van het gebruik van deze techniek voor het bepalen extracellulaire enzymactiviteit in watermonsters.
Figuur 1. Stelde lay-out van 96-well diepe put blokken voor de bepaling van de extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten met de colorimetrische p-NP verbonden substrate techniek. Elk goed moet een totaal van 300 ul, bestaande uit steekproef slurry, substraat oplossing, of acetaat buffer, afhankelijk van of het een monster run, sample controle, of substraat controle ontvangen.
Figuur 2. Stelde lay-out van 96-wells zwarte microplaten voor de bepaling van de extracellulaire enzymactiviteit in watermonsters met behulp van de fluorometrische MUB-gekoppelde substraat techniek. Negen monsters kan verticaal worden aangebracht op de plaat (A) elk in acht putjes. Deze acht putjes worden gebruikt voor het monster loopt, sample controles en lessen controles terwijl de resterende putjes worden gebruikt voor substraat controles en standaarden MUB (B).
Figuur 3. Extracellulaire enzymactiviteit op verschillende groottes van sediment deeltjes vanuit een kleine stroom in noord Mississippi, USA. Elke deeltjesgrootte fractie werd getest op de activiteit van fosfatase (A), β-glucosidase (B) en NAGase (C) volgens de p NP-substraat colorimetrische procedure. Activiteit wordt gemeld in mmol substraat verbruikt hr -1 g droge massa sediment -1 en is de gemiddelde (+ SE) drie gelijke metingen per deeltjesgroottefractie.
Figuur 4. Extracellulaire enzymactiviteit in water genomen met drie verschillendeschillende diepten (0, 50 en 100 cm) een ondiepe meer in het noorden Mississippi, USA. Water werd getest op de activiteit van fosfatase (A), β-glucosidase (B) en NAGase (C) volgens de MUB-substraat fluorometrische procedure. De activiteit wordt gerapporteerd in nmol substraat geconsumeerd h -1 -1 ml water en de gemiddelde (+ SE) drie gelijke metingen per monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het bepalen van de activiteit van een verscheidenheid van extracellulaire microbiële enzymen in bodems en sedimenten kunnen bruikbare inzichten tarieven voedingsstoffen mineralisatie en organisch materiaal verwerking 17 verschaffen. Echter, kan de bodem variëren in hun vochtgehalte, dus is het belangrijk om te standaardiseren op drooggewicht. Dit vereist een extra droogstap (gewoonlijk twee dagen) dan alleen het meten van enzymactiviteit. Aldus, in tegenstelling tot assays enzymactiviteit in watermonsters die voorzien vrijwel direct resultaat betrouwbaar testen van de enzymactiviteit in de bodem en sedimenten een paar dagen. Voor sommige bodems, kan het zelfs beter zijn om de activiteit per gram organische stof of asvrij drooggewicht uiten, waarvoor een extra verassingsstap (normaal 2 uur bij 500 ° C) buiten het droogproces. Hoe dan ook, de meest cruciale stap in de colorimetrische analyse van de bodem of sediment enzymactiviteit is de terugtrekking van de bovenstaande vloeistof uit de diepe en Blok Fadat centrifugeren aan het einde van de incubatieperiode. Deze procedure berust op het meten van absorptie, kan zelfs de aanwezigheid van een enkele verdwaalde gronddeeltjes in de definitieve microplaat tot valse resultaten. Hogere snelheden centrifugeren (> 5000 xg) zou kunnen helpen dit probleem te verzachten, maar in onze ervaring centrifuge rotors die microplates accepteren hebben meestal rotatie grenzen onder deze drempel, en de blokken zelf kunnen niet veel hogere snelheden tolereren. In wezen, dit pipetteren stap vereist een combinatie van zorg en snelheid een Meerkanaalspipet om snel de benodigde hoeveelheid supernatant brengen van de diepe en blok naar de microplaat.
Testen van extracellulaire enzymactiviteit in watermonsters noch de noodzaak van een droogperiode noch centrifugatie stap, de laatste omdat zowel het enzym-substraat reactie en meten van de fluorescentie van het eindproduct binnen hetzelfde microplaat. Als dusdanig, in diessays zijn doorgaans sneller en aanvankelijk makkelijker uit te voeren weergegeven. Echter, ze hebben hun eigen beperkingen in dat, waar mogelijk, moet de MUB standaard en MUB-gebonden ondergronden niet worden blootgesteld aan licht. In onze ervaring, het dimmen van de lichten zo veel mogelijk tijdens een pipetteren en incuberen van de microplaten in het donker (of bedekt met een ondoorzichtige deksel) is een noodzaak. Omdat deze testen vereisen ook de platen te lezen op verschillende tijdstippen dit vaak resulteert in de noodzaak van een zeer snelle omschakeling tussen de platen wanneer testen van meerdere enzymen tegelijk. Bijvoorbeeld, om negen watermonsters voor de activiteit van de zes enzymen gelijktijdig (bijvoorbeeld middels zes verschillende microplaten) assay, wordt het noodzakelijk om een plaat om de 2 min gedurende 1 uur om te waarborgen dat elke individuele plaat lezen elk 10 -15 min (in dit geval, elke 12 min). Voorzichtigheid is geboden bij te houden van de specifieke plaat gelezen, en te voorkomen dat vloeistof wordt gemorst from de plaat zoals wordt overgebracht in en uit de microtiterplaat fluorometer. Bij testen van meerdere enzymen tegelijk, is het ook belangrijk om in gedachten te houden de tijd die het duurt voor de microplaat lezer echt gelezen plaat en spreiden lezen intervallen dienovereenkomstig. Een laatste zorg met de fluorescentie van extracellulaire enzymactiviteit in watermonsters is bij het werken met samples die troebel zijn. Watermonsters dat zwevende deeltjes moet worden geschud alvorens aanvankelijk gieten in de pipet reservoir en opnieuw gemengd door en uitwerpen met de pipet alvorens ze in de microtiterplaat wordt geladen. Hogere aantallen deeltjes in een monster ook meestal resulteert in een grotere uitdoving van het fluorescente signaal, en het belang van afschrik controles voor elk monster kan niet genoeg worden benadrukt.
Terwijl MUB-en p NP-gebonden substraten doorgaans weergegeven Vertaald Vmax waarden voor milieu-enzymen, de Km-waardenkunnen verschillen en enzymen zoals β-glucosidase en fosfatasen kunnen hogere affiniteit voor MUB-gekoppelde substraten dan de p-NP gekoppelde analoga 14. Daarom MUB-gekoppelde substraten waarschijnlijk gevoeliger dan die welke verband houden p NP, wat suggereert dat ze een betere keuze moeten worden gebruikt bij enzymactiviteit in bodems en sedimenten zou zijn. Maar het fluorogene eindproduct dat wordt gemeten tijdens MUB assays wordt bedreigd uitdoving in sommige bodemextracten en fluorescentie metingen kunnen instabiel tijd 12. Bodems en sedimenten ook de neiging om hogere extracellulaire enzymactiviteit dan natuurlijke wateren, dus de verhoogde gevoeligheid van de fluorometrische MUB-gekoppelde assays kan weinig voordeel bieden ten opzichte van de colorimetrische p NP methoden gezien de mogelijke problemen met blussen bij het analyseren van bepaalde bodems. Als een kanttekening, de p-NP verbonden substraten en de p NP standaard zelf zijn over het algemeen meer affordaBLE dan hun tegenhangers MUB, een extra reden voor het gebruik ervan als budgettaire beperkingen gelden.
Misschien wel het belangrijkste aspect van de mogelijkheid om microbiële extracellulaire enzymactiviteit assay in aquatische en terrestrische milieus is dat terwijl deze technieken meten microbiële fysiologische processen, deze processen hebben een directe invloed op het ecosysteem niveau transformaties van koolstof en voedingsstoffen. Tarieven van decompositie van organisch materiaal zijn direct gekoppeld aan de activiteit van extracellulaire cellulases in sedimenten 18,19, zodat een snelle metingen van enzymactiviteit mogelijk de bepaling van momentane in situ afbraak tarieven in milieu monsters te vergemakkelijken. Met behulp van high throughput microplaat aanpak voorziet in de gelijktijdige meting van de enzymactiviteit in grotere aantallen monsters dan de meer typische enkele buis benaderingen, zodat variatie in enzymactiviteit (en bij uitbreiding in het ecosysteem niveau processen) in response aan factoren zoals diepte 20 of ecologische verstoringen 9,21 kan worden onderzocht. Evenzo, testen van enzymen die betrokken zijn bij de nutriëntcyclering, zoals fosfatase en NAGase, kan inzicht in nutriënten limitatie te bieden in specifieke omgevingen, bijvoorbeeld, het relatieve belang van organische fosfor organische stikstof in de bodem ontwikkeling 8.
Omdat enzym activiteiten zijn gemeten in milieu monsters meer dan dertig jaar, zijn vergelijkingen tussen studies met behulp van geavanceerde meta-analyses nu steeds mogelijk. Dergelijke studies suggereren dat, op wereldschaal, enzymactiviteit, en daarom de tarieven van de afbraak van organische stof en nutriënten mineralisatie, zijn gebonden aan pH, beschikbaarheid substraat en nutriënten stoichiometrie 17. Tegelijkertijd is het gebruik van een microplaat-protocol begonnen met de analyse van fijne schaalpatronen in enzymactiviteit met geostatistische analysemethoden 22 toestaan
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Financiering voor aspecten van dit werk werd geleverd door verschillende bronnen, waaronder het Amerikaanse ministerie van Landbouw Specifieke samenwerkingsovereenkomst 58-6408-1-595 en de National Science Foundation (award 1.049.911).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers | ||
References
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
- Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
- Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
- Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
- Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
- Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
- Hoppe, H. -G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
- Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
- Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
- Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
- Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
- Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
- Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
- Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).
