Summary
procédures de microplaques sont décrites pour l'analyse colorimétrique ou fluorimétrique de l'activité enzymatique extracellulaire. Ces procédures permettent l'analyse rapide d'une telle activité dans un grand nombre d'échantillons de l'environnement dans un laps de temps raisonnable.
Abstract
Une grande partie du cycle des éléments nutritifs et la transformation du carbone en milieu naturel se produit grâce à l'activité des enzymes libérées par les micro-organismes extracellulaires. Ainsi, la mesure de l'activité de ces enzymes extracellulaires peut donner un aperçu des taux de processus au niveau de l'écosystème, telles que la décomposition de la matière organique et la minéralisation de l'azote ou du phosphore. Des dosages de l'activité enzymatique extracellulaire dans des échantillons environnementaux impliquent typiquement l'exposition des échantillons à des substrats colorimétriques ou fluorométriques artificiels et suivant le taux de l'hydrolyse du substrat. Nous décrivons ici microplaques basé méthodes de ces procédures qui permettent l'analyse d'un grand nombre d'échantillons dans un court laps de temps. Les échantillons sont laissés à réagir avec des substrats artificiels à l'intérieur de microplaques de 96 puits ou de puits profond blocs de microplaques, et l'activité enzymatique est ensuite déterminée par absorption ou de fluorescence du produit final résultant de l'utilisation d'un reade microplaque typiquer ou fluorimètre. Ces procédures à haut débit non seulement de faciliter les comparaisons entre les sites ou les écosystèmes séparés spatialement, mais aussi de réduire sensiblement le coût de ces tests en réduisant les volumes globaux de réactifs nécessaires par échantillon.
Introduction
Les micro-organismes tels que les bactéries et les champignons d'obtenir les nutriments et de carbone à partir de composés organiques complexes, grâce à la production d'enzymes extracellulaires. Ces enzymes hydrolysent typiquement des polymères en sous-unités plus petites qui peuvent être prises dans la cellule. Par conséquent, au niveau écologique, ces enzymes extracellulaires microbiennes sont en grande partie responsables de la minéralisation des éléments nutritifs et de la décomposition de la matière organique qui se produit dans les milieux naturels. Des enzymes telles que la cellobiohydrolase (CBH), β-glucosidase et sont importants pour la dégradation de la cellulose et de travail à l'unisson pour catalyser l'hydrolyse de la cellulose en glucose 1,2, ce qui donne un substrat de carbone utilisables pour l'absorption et l'assimilation microbienne. La phosphatase enzyme libère solubles groupes phosphates inorganiques de organophosphates, essentiellement de minéralisation du phosphate et de la rendre disponible pour une utilisation par la plupart des organismes 3. D'autres enzymes, telles que la N-acétylglucosaminidase (NAGase), sont important dans la dégradation de la chitine et peut faire à la fois du carbone et de l'azote disponible pour l'acquisition microbienne 4.
Une des procédures pour le dosage de l'activité enzymatique extracellulaire microbienne dans les milieux naturels est l'utilisation d'artificiel p-nitrophényl (p NP) des substrats liés, une approche qui a été initialement développé pour détecter sol activité de la phosphatase 5. Cette approche repose sur la détection d'un produit final coloré, le p-nitrophénol, qui est libéré lorsque le substrat artificiel est hydrolysé par l'enzyme appropriée. Le p-nitrophénol peut ensuite être quantifié par colorimétrie en mesurant son absorbance à environ 400-410 nm. Cette méthode a depuis été appliquée pour détecter d'autres enzymes telles que la NAGase 6, et a été utilisé dans diverses études portant sur l'activité enzymatique extracellulaire microbienne dans les sols et les sédiments 9.7.
Une approche alternative qui était originally développé pour évaluer l'activité glucosidase extracellulaire dans les milieux aquatiques 10,11 rend l'utilisation de 4-méthylumbelliférone (IUM) substrats liés. Le produit final libéré (4-méthylumbelliférone) est hautement fluorescent et peut être détectée en utilisant un fluorimètre avec un paramètre d'excitation / émission d'environ 360/460 nm. Une variété de substrats artificiels MUB-liés sont disponibles, permettant la mesure fluorométrique de l'activité d'au moins autant d'enzymes (par exemple β-glucosidase, la cellobiohydrolase, NAGase, phosphatases) que l'on peut doser à l'aide de la procédure colorimétrique de NP-substrat p. D'autres enzymes extracellulaires microbiens, tels que la leucine aminopeptidase de la protéine dégradant, peuvent être analysés par fluorimétrie à l'aide de 7-amino-4-méthylcoumarine (CUO) des substrats liés. Les deux MUB et substrats COU-liés ont été utilisés pour déterminer l'activité enzymatique dans divers échantillons terrestres et aquatiques 12,13.
Bien que des études antérieures ont descrmicroplaque fluorimétrique ou colorimétrique ibed approches pour déterminer l'activité enzymatique extracellulaire 14, il ya un besoin pour une présentation claire de la façon de mener de tels essais. Ici, nous démontrons les procédures pour la conduite des techniques à haut débit de microplaques pour l'analyse de l'activité enzymatique extracellulaire dans les sols et les sédiments à l'aide de l'approche colorimétrique p substrats de NP-lié et dans les eaux naturelles en utilisant la technique des substrats MUB-Linked Fluorescent. Nous nous concentrons sur la mesure des activités de β-glucosidase, NAGase, et phosphatase que ces enzymes peuvent être liées au carbone, l'azote et le cycle du phosphore, respectivement. Cependant, les modes opératoires décrits ici peuvent être appliqués à la mesure d'autres enzymes extracellulaires en utilisant différents substrats artificiels.
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Protocol
Colorimétrique Analyse des extracellulaire activité enzymatique dans les sols et les sédiments
Une. Préparation du substrat et solutions tampons pour les analyses colorimétriques de l'activité enzymatique
- H préparer tampon acétate 50 mM (pH 5,0 à 5,5), en mélangeant 50 ml de 0,1 M d'acide acétique (2,87 ml d'acide acétique glacial dans 500 ml d'eau), 150 ml de 0,1 M d'acétate de sodium et 200 ml d'eau distillée 2 O. Ajuster le pH à 5,0 à 5,5 avec 0,1 M d'acide acétique, si nécessaire.
- Préparer une solution de 1 M d'hydroxyde de sodium (NaOH) dans l'eau distillée 2 O.
- Préparer des solutions de substrat de NP lié p dans 50 mM de tampon acétate. Pour doser la phosphatase préparer 5 mM p NP-phosphate dans 50 mM de tampon acétate, pour doser β-glucosidase préparer 5 mM p NP-β-glucopyranoside, pour doser NAGase préparer 2 mM pNP-β-N-acétyl-glucosaminide. Préparer toutes les solutions de substrat dans stériles 15 ml ou 50 ml tubes de centrifugation. Les solutions peuvent être stockées à 4 ° C pendant 2 à 3 semaines.
2. Détermination d'une norme pour convertir l'absorbance à p NP Concentration
- Préparer des solutions standard de p-nitrophénol dans 50 mM de tampon acétate. Les concentrations devraient varier de 0,025 à 1 mM.
- Transfert trois répétitions de 100 pi de chaque concentration à une microplaque de 96 puits clair. Ajouter 10 ul de NaOH 1 M et 190 ul de H 2 O distillée à chaque puits.
- absorbance record à 410 nm en utilisant un lecteur de microplaques.
- Concentrations se multiplient dans la courbe standard par 0,3 pour obtenir micromoles p NP par 300 volume de réaction ul. Tracer la courbe d'absorbance en fonction pmol de p NP. La pente de la courbe sert de facteur de conversion (C) qui se rapportent à l'absorbance umole de p NP dans chaque réaction enzymatique.
3. Conduite de l'Enzyme Assay
- Pour le sol, préparer une suspension de chaque échantillon à analyser dans un 15 ml tube à centrifuger stérile à une concentration d'environ 1 g / ml-1 en utilisant 50 mM de tampon acétate. Pour les sédiments, ajouter un tampon d'acétate assez pour faire la bouillie facilement pipettable. Le volume exact de bouillie nécessaire variera en fonction du nombre d'enzymes testés, mais un minimum de 5 ml est recommandé. Vortex chaque suspension jusqu'à ce que toutes les mottes de terre ou les sédiments se sont dispersés et noter le volume final.
- Re-vortex chaque suspension et la pipette juste 150 pi dans chacun des six puits sur un bloc de 96 puits deepwell (Figure 1). Il est important de vortex complètement et fréquemment afin de maintenir les particules de sol en suspension. Laisser au moins deux puits par bloc vide pour servir de contrôle de substrat. Remarque: clip la fin de pointes de pipettes avec des ciseaux avant de pipetage comme les boues, ont tendance à obstruer conseils. Préparer un bloc à 96 puits pour chaque enzyme à doser.
- Verser environ 5 ml de tampon acétate dans un réservoir de pipette et en utilisant une pipette à 8 canaux d'ajouter 150 ul du tampon à la last deux puits de chaque échantillon (ce seront des contrôles de tampon échantillon) et les deux puits de contrôle de substrat (Figure 1)
- Verser environ 10 ml de la solution de NP-substrat p appropriée dans un réservoir de pipette et en utilisant une pipette à 8 canaux d'ajouter 150 ul de la solution de substrat pour les quatre premiers puits de chaque échantillon et les deux puits de contrôle de substrat (Figure 1). Noter le temps que la réaction commence dès que la solution de substrat est ajouté.
- Incuber les plaques à température ambiante (22 ° C) pendant 0,5-4 h. Temps d'incubation exacte varie en fonction du niveau d'activité dans les échantillons et l'enzyme à doser. Pour la plupart des sols et des sédiments, de la phosphatase et de β-glucosidase nécessitent des temps d'incubation de 0,5 à 1,5 heures, tandis que la NAGase et d'autres enzymes nécessitent des temps d'incubation de> 2 h.
- Bien que des essais sont en période d'incubation préparer clair microplaques de 96 puits à l'absorbance. Préparer une microplaque pour chaque bloc deepwell (c'est à dire pour chaque enzyme dosé). Introduire à la pipette 10 ul de NaOH 1 M et 190 ul d'eau distillée dans chaque puits de la microplaque. Remarque: NaOH ralentit la réaction enzymatique et augmente le pH qui améliore la couleur de la NP p libéré pendant la réaction.
- Après incubation, centrifuger les blocs de 96 puits à 2000-5000 x g pendant 5 min pour sédimenter les particules du sol.
- Utilisez une pipette multicanaux de retirer 100 pi de chaque puits, en veillant à éviter le culot, et le transférer dans le puits correspondant à préparé microplaque de 96 puits clair.
- Allumez le lecteur de microplaques et mettre en place les logiciels nécessaires. absorbance record à 410 nm. Si l'absorbance d'un bien donné est au-dessus de la limite de détection linéaire du lecteur de plaques, diluer ainsi que 1:01 avec de l'eau et re-mesure. Si l'absorbance est encore trop élevé, le test doit être répété avec un temps d'incubation plus courte.
4. Détermination de la masse sèche des échantillons
- Introduire à la pipette 1 ml de chaque sampl e bouillie dans une casserole en aluminium préalablement pesée.
- Sécher dans une étuve de séchage à 75 ° C pendant 48 h et peser. Soustraire le poids de la cuve à partir de cette valeur pour obtenir la masse sèche du sol ou de sédiment dans 1 ml de la suspension. Multiplier par un facteur de 0,15 pour déterminer la masse sèche de l'échantillon dans les 150 ul ajoutés à chaque puits dans le dosage d'enzyme.
5. Calcul de l'activité enzymatique par masse sèche de sol ou les sédiments
- Calculer l'absorbance finale de chaque échantillon en soustrayant l'absorbance de l'échantillon de contrôle à partir de l'absorbance de l'échantillon d'essai. Si les contrôles de substrat ont une forte absorption (environ> 0,060) alors soustraire ceux aussi.
- Calcul de l'activité enzymatique en pmoles hr -1 -1 g de matière sèche à partir de l'équation:
l'activité de l'enzyme = absorbance finale / (C x temps d'incubation x échantillon masse sèche)
Analyse fluorescent de extracellulaire activité enzymatique dans les eaux naturelles
TLE "> 1. Préparation du support, Standard et solutions tampons pour analyses fluorométriques de l'activité enzymatique- Préparer 200 uM des solutions de substrats MUB-liés (par exemple 4-MUB-β-glucopyranoside, le 4-MUB-phosphate, le 4-MUB-N-acétyl-β-D-glucosaminide) en dissolvant le substrat approprié dans stérile (autoclavée) distillée H 2 O dans 15 ml stériles ou 50 ml tubes de centrifugation. Enveloppez tubes en papier d'aluminium pour exclure la lumière et stocker au réfrigérateur avant de l'utiliser. Les substrats doivent être stables pendant au moins 1 semaine si elles sont stockées de cette manière.
- Préparer une norme MUB en faisant une solution stock de 100 uM 4 méthylumbelliférone dans de l'eau distillée stérile 2 O. Conserver au réfrigérateur dans de l'ambre ou bouteille en aluminium gainé. Immédiatement avant utilisation, diluer la solution 100 uM d'actions par 1/10 en H 2 O stérile pour obtenir une solution de travail de 10 uM pour les dosages enzymatiques.
- Préparer une solution stock de tampon de bicarbonate 100 mM en dissolvant 8,4 g de NaHCO <sub> 3 en 1 LH 2 O et autoclave. Diluer cette solution mère 1/20 en H 2 O stérile si nécessaire pour obtenir une solution de travail de 5 mm pour les dosages enzymatiques.
2. Organiser des échantillons d'eau sur un 96 puits noir microplaques
- Organiser une microplaque pour chaque enzyme suivant l'exemple représenté sur la figure 2. Notez que pour permettre la réplication adéquat, des normes et des contrôles, cette procédure peut doser l'activité d'une enzyme unique pour un maximum de neuf échantillons d'eau sur une microplaque à 96 puits noir.
- Verser environ 5 ml du premier échantillon dans un réservoir de pipette et utiliser une pipette à 8 canaux à pipette200 ul dans tous les puits de la colonne 1 de la microplaque (s). Jeter les embouts de pipette neufs et répéter au besoin pour chaque échantillon d'eau pour remplir les colonnes 1-9.
3. Mise en place d'échantillon, Standard, prend goût, et des contrôles de substrat
- Mettre en place des contrôles pour tenir compte des échantillons, standardss, et le substrat de trempe sur la même microplaque noire que les échantillons (Figure 2).
- Contrôles exemples contiennent de l'eau de l'échantillon et le tampon bicarbonate, et ne sont pas utilisées dans les calculs d'activité mais démontreront lecture cohérence tout au long de l'expérience. Les contrôles de trempe sont constitués d'eau de l'échantillon et une quantité standard de l'étiquette fluorescente et sont utilisés pour mesurer la diffraction de la fluorescence dans l'eau de l'échantillon. Substrat et contrôles standard sont constitués de tampon de substrat soit lié ou le marqueur fluorescent standard, respectivement, et le bicarbonate.
- Verser environ 5 ml de 5 mM de tampon de bicarbonate dans un réservoir de pipette propre. Pipette 50 ul de tampon dans les puits de la microplaque de 1 à 9 dans les lignes D et E pour former deux puits réplicats de commandes d'échantillon par échantillon. Changer d'embout de pipette puis transférer 200 pi de tampon bicarbonate de puits 10 à 12 dans les lignes A et H.
- Réduisez l'éclairage ambiant par gradation ou d'éteindre lipo ds que la norme fluorescent est sensible à la lumière.
- Verser environ 5 ml de 10 pM de 4-méthylumbelliférone dans un réservoir de pipette propre. Pipette 50 ul dans les puits de la microplaque de 1 à 12 dans la ligne H, et dans les puits 1 à 9 dans les lignes G et F pour former trois répétitions de contrôles de trempe par échantillon et l'ensemble des contrôles standard. Soit placer la microplaque dans l'obscurité ou couvrir avec un couvercle opaque pour réduire la dégradation de la lumière MUB.
- Allumez le fluorimètre et mettre en place les logiciels nécessaires pour être prêt à lire avant d'ajouter le substrat. Note: certaines ampoules fluorimètre peuvent nécessiter un temps d'échauffement de 3 minutes ou plus.
- Verser environ 5 ml de substrat approprié MUB-lié (par exemple 4-MUB-phosphate) dans un réservoir de pipette propre. Utilisez une pipette 12 canaux à la pipette 50 ul dans les puits de la microplaque de 1 à 12 dans la ligne A, et dans les puits 1 à 9 dans les lignes B et C pour former trois essais répétés pour chaque échantillon et trois contrôles de substrat. Immediately passez à l'étape 4.1, fluorescence d'enregistrement.
4. Fluorescence enregistrement
- Lire la fluorescence initiale immédiatement après l'addition de substrat à la microplaque. Après la lecture de la fluorescence, incuber la microplaque à température ambiante (22 ° C), soit dans le noir ou recouvert d'un couvercle opaque pour réduire la dégradation de la lumière MUB.
- Le temps d'incubation nécessaire pour mesurer l'activité enzymatique maximale possible dans un échantillon d'eau va dépendre de la concentration d'enzyme dans l'échantillon. Etant donné que ce n'est pas connue avant le dosage est terminé, la microplaque devra être lu à intervalles de temps multiples. Typiquement, la lecture à des intervalles de 10-15 minutes au cours de 1 h est acceptable pour de nombreuses enzymes, bien que les échantillons avec une activité très élevée pour certaines enzymes peuvent culminer avant 10 min.
- Continuer la lecture de fluorescence dans la microplaque à vos intervalles désignés pendant au moins 1 heure. Soyez sûr de garder la microplaque couvert ou dans l'obscurité entre la lectures.
5. Calcul de l'activité enzymatique par volume d'eau
- Pour chaque échantillon à chaque intervalle de temps de calculer les: fluorescence moyenne de l'échantillon initial (puits D et E), la fluorescence de l'échantillon final moyen (puits AC), la fluorescence moyenne standard (puits H10-11), et la moyenne étancher fluorescence de contrôle (puits FG).
- Pour chaque intervalle de temps, calculer l'activité enzymatique en nmoles ml -1 h -1 à partir de l'équation:
l'activité de l'enzyme = (fluorescence moyenne de l'échantillon - fluorescence moyenne de l'échantillon initial) / ((fluorescence moyenne / 0,5 mole) x standards (moyenne étancher fluorescence de contrôle / moyenne de fluorescence) x standards (0,2 ml) x (temps en h))
- Examiner les valeurs de l'activité calculée pour chaque pas de temps. Déterminer l'activité de potentiel final de l'étape de temps avec la plus forte activité. Si les valeurs d'activité continuent d'augmenter alors pas de temps plus tard, peuvent être nécessaires, si les valeurs d'activité tombent Throughout cours de l'exécution, puis exécutez à nouveau avec plus courts intervalles de temps. Dernière activité est en nmoles de substrat consommée h -1 ml -1, mais peut être étendu à exprimer comme micromoles h -1 L -1.
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Representative Results
Les sols et les sédiments aquatiques ont généralement des niveaux appréciables d'activité enzymatique extracellulaire par suite des communautés microbiennes joints (biofilms) se développant sur la surface des particules. Figure 3 montre comment cette activité varie en fonction de la taille des particules obtenues à partir du sédiment de surface d'une troisième courant de l'ordre dans le nord du Mississippi, États-Unis. Une étude antérieure a montré que les communautés bactériennes sur des particules de sédiments du ruisseau peuvent être séparés en trois groupes distincts basés sur l'analyse moléculaire de la structure de leur communauté: ces sur 0.063 particules mm, ceux de 0,125, 0,25 et 0,5 mm particules, et ceux sur 1 mm de particules 15. L'analyse des motifs de l'activité enzymatique extracellulaire soutient cette conclusion, à la phosphatase (Figure 3A) étant similaire à 0,125, 0,25 et 0,5 mm particules mais beaucoup plus élevé dans les fractions 1 et 0,063 mm lorsqu'elle est mesurée en utilisant la technique de substrat de NP-lié p. Oenzymes ther tels que β-glucosidase (Figure 3B), et NAGase (figure 3C) montrent des pics similaires sur les particules les plus fines, mais ne sont pas élevés sur une particules de mm, mettant en évidence le fait que les différentes enzymes peuvent présenter différentes distributions de l'environnement et de ceux-ci peuvent être élucidé par ce test. Les barres d'erreur relativement faibles montrent que les dosages colorimétriques de l'activité enzymatique sur les sédiments sont reproductibles et donc favorable à l'analyse statistique lorsque l'on compare les différents échantillons de l'environnement.
Les eaux naturelles ont tendance à avoir une activité enzymatique extracellulaire inférieure par ml de sols et les sédiments font par g. En tant que tels, ils doivent être dosés par fluorimétrie en utilisant des substrats MUB-liés. Figure 4 montre comment l'activité de la phosphatase enzymes (figure 4A), β-glucosidase (figure 4B), et NAGase (Figure 4C) varie avec la profondeur dans un lac peu profond dans le nord du Mississippi, États-UnisA. Le lac (lac Boondoggle) est connu pour être pauvres en éléments nutritifs 16, qui est également suggéré par l'activité relativement élevé de phosphatase (figure 4A), une enzyme qui produisent des micro-organismes dans le but d'acquérir phosphate à partir de composés organiques. Pour l'ensemble des trois enzymes testés, les échantillons prélevés à la surface de l'eau (0 cm) et 50 cm de profondeur ont montré une activité similaire, alors que l'activité était élevée dans l'échantillon de 100 cm. Cet échantillon a été essentiellement tirée de l'interface eau-sédiments, et la présence de particules de sédiments dans l'échantillon explique probablement la plus grande activité vu dans cet exemple, en particulier pour les β-glucosidase et NAGase. Comme dans le cas des substrats de la p NP, les barres d'erreur bas montrent que, même avec seulement trois lectures répétées, la reproductibilité des dosages utilisant des substrats fluorométriques MUB est élevée.
Notez que les unités utilisées pour la figure 4 sont en nmoles de substrat consommé tandis que ceux de la Figure 3sont en micromoles de substrat consommé, même si la taille de l'unité par comparable (soit par ml ou par g). Cela met en évidence le fait que les sols et les sédiments ont tendance à avoir une activité extracellulaire beaucoup plus élevé que les eaux naturelles (les activités de chaque enzyme spécifique à la figure 3 sont d'environ 10 100 fois plus élevée que l'activité de l'enzyme équivalente à la figure 4). Il démontre également l'augmentation de la sensibilité de la technique de substrat MUB-lié, et la nécessité d'utiliser cette technique pour le dosage de l'activité enzymatique extracellulaire dans des échantillons d'eau.
Figure 1. Disposition suggérée de blocs de 96 puits profond et pour le dosage de l'activité enzymatique extracellulaire dans les sols ou les sédiments en utilisant les p colorimétriques NP lié stechnique ubstrate. Chaque puits devrait recevoir un total de 300 pi, composé de l'échantillon en suspension, la solution de substrat, ou un tampon d'acétate selon qu'il s'agit d'un exemple d'exécution, le contrôle de l'échantillon, ou le contrôle de substrat.
Figure 2. Disposition suggérée de 96 puits de microtitration noire pour le dosage de l'activité enzymatique extracellulaire dans des échantillons d'eau à l'aide de la technique de substrat MUB lié fluorimétrique. Neuf échantillons peut être disposée verticalement sur la plaque (A) occupant chacun huit puits. Ces huit puits sont utilisés pour des courses de l'échantillon, les contrôles de l'échantillon, et les contrôles étancher alors que les puits restants sont utilisés pour les contrôles de substrat et les normes IUM (B).
Figure 3. Activité enzymatique extracellulaire sur différentes tailles de particules de sédiments de surface prélevés à partir d'un petit cours d'eau dans le nord du Mississippi, États-Unis. Chaque fraction de la taille des particules a été testé pour l'activité de la phosphatase (A), β-glucosidase (B), et NAGase (C) suite à la p NP-substrat procédure colorimétrique. Activité est rapportée en pmoles de substrat consommé h-1 g de masse sèche de sédiment et -1 est la moyenne (+ ET) pour les trois lectures répétées par fraction granulométrique.
Figure 4. Activité enzymatique extracellulaire dans l'eau prise à trois différentes profondeurs (0, 50, et 100 cm) à partir d'un lac peu profond dans le nord du Mississippi, États-Unis. L'eau a été analysée pour l'activité de la phosphatase (A), β-glucosidase (B), et NAGase (C) après la MUB-substrat procédure fluorimétrique. Activité est signalée dans le substrat nmoles consommés h -1 ml d'eau -1 et est la moyenne (+ SE) de trois lectures répétées par échantillon.
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Discussion
Détermination de l'activité d'une variété d'enzymes extracellulaires microbiennes dans les sols et les sédiments peut fournir des indications utiles sur les taux de minéralisation des éléments nutritifs et de matière organique traitement 17. Cependant, les sols peuvent varier dans leurs niveaux d'humidité, il est donc important de normaliser l'activité de sol poids sec. Cela nécessite une étape de séchage supplémentaire (typiquement de deux jours) au-delà de la simple mesure de l'activité enzymatique. Ainsi, contrairement aux dosages de l'activité enzymatique dans des échantillons d'eau qui fournissent des résultats instantanés à proximité, des dosages fiables de l'activité enzymatique dans les sols et les sédiments prennent quelques jours. Pour certains sols, il peut même être plus approprié pour exprimer l'activité par gramme de matière organique ou de la cendre gratuit masse sèche, ce qui nécessite une étape de calcination supplémentaire (généralement de 2 heures à 500 ° C) au-delà de la procédure de séchage. Quoiqu'il en soit, l'étape la plus critique dans le dosage colorimétrique de l'activité enzymatique du sol ou de sédiment est le retrait du surnageant à partir du bloc de puits profonds fuite centrifugation à la fin de la période d'incubation. Comme cette méthode repose sur la mesure de l'absorbance, même la présence de quelques particules de sol errants dans la microplaque finale peut conduire à des résultats erronés. Des vitesses plus élevées de centrifugation (> 5000 xg) pourrait aider à atténuer ce problème, mais dans nos rotors de centrifugeuses d'expérience qui acceptent microplaques ont généralement des limites de rotation en dessous de ce seuil, et les blocs eux-mêmes ne peut pas tolérer des vitesses beaucoup plus élevées. Essentiellement, cette étape de pipetage particulier nécessite une combinaison de soins et de la vitesse à utiliser une pipette multi-canaux pour transférer rapidement la quantité nécessaire de surnageant à partir du bloc de puits profonds de la microplaque.
Des dosages de l'activité enzymatique extracellulaire dans des échantillons d'eau n'ont ni la nécessité d'une période de séchage, ni l'étape de centrifugation, à la fois parce que celui-ci de la réaction enzyme-substrat et mesure de la fluorescence du produit final apparaissent dans la même microplaque. En tant que tel, il s'agit d'unssays sont généralement plus rapides et peuvent d'abord sembler plus facile à exécuter. Cependant, ils ont leurs propres limites en ce que, chaque fois que possible, la norme MUB et substrats MUB liées ne doivent pas être exposés à la lumière. Dans notre expérience, tamisant les lumières autant un possible pendant le pipetage et l'incubation des microplaques dans le noir (ou recouverte d'un couvercle opaque) est une nécessité. Parce que ces dosages nécessitent également les plaques à lire à plusieurs points dans le temps, il en résulte souvent en la nécessité d'une commutation très rapide entre les plaques lors du dosage de plusieurs enzymes en même temps. Par exemple, afin de doser neuf échantillons d'eau pour l'activité des six enzymes simultanément (par exemple en utilisant six différents microplaques), il devient nécessaire de lire une plaque toutes les 2 min pendant 1 heure afin d'assurer que chaque plaque individuelle est lu chaque 10 -15 min (dans ce cas, toutes les 12 min). Il faut prendre soin de garder une trace de la plaque particulière lire, ainsi que de veiller à ce qu'aucun liquide est renversé en arrièrem la plaque lorsqu'il est transféré dans et hors du fluorimètre pour microplaques. Lorsque le dosage de plusieurs enzymes à la fois, il est également important de garder à l'esprit le temps qu'il faut pour le lecteur de microplaques à fait lire la plaque et de décaler la lecture intervalles en conséquence. Une préoccupation final avec le dosage par fluorescence de l'activité enzymatique extracellulaire dans des échantillons d'eau est lorsque l'on travaille avec des échantillons qui sont troubles. Les échantillons d'eau contenant des particules en suspension devraient être secoués avant de verser d'abord dans le réservoir de la pipette et mélanger à nouveau par le retrait et l'éjection de la pipette avant d'être chargés sur la microplaque. Augmentation du nombre de particules dans un échantillon aussi traduit généralement par une plus grande extinction du signal fluorescent, et l'importance des contrôles de trempe pour chaque échantillon ne peut pas être assez souligné.
Bien substrats MUB-et p-NP liés montrent typiquement des valeurs de V max similaire pour les enzymes de l'environnement, les valeurs de K mpeuvent différer, et des enzymes telles que β-glucosidases et phosphatases peuvent avoir une plus grande affinité pour des substrats MUB liés que leurs NP lié analogues p 14. Par conséquent, les substrats MUB liées sont susceptibles d'être plus sensibles que celles liées à la p NP, ce qui suggère qu'ils seraient un meilleur choix à utiliser pour mesurer l'activité enzymatique dans les sols et les sédiments. Cependant le produit final fluorogène qui est mesurée au cours de dosages MUB est soumis à une trempe potentiel dans certains extraits de sol, et des lectures de fluorescence peut être instable dans le temps 12. Les sols et les sédiments ont également tendance à avoir une activité enzymatique extracellulaire plus que les eaux naturelles, de sorte que la sensibilité accrue des essais MUB liés fluorométriques peuvent offrir peu d'avantages sur les méthodes p NP colorimétriques étant donné les problèmes potentiels avec trempe dans l'analyse de certains sols. Comme une note côté, les substrats de NP lié p et la norme p NP lui-même sont généralement plus Affordable que leurs homologues IUM, une raison supplémentaire pour leur utilisation si les restrictions budgétaires s'appliquent.
Peut-être l'aspect le plus important d'être en mesure de déterminer l'activité enzymatique extracellulaire microbienne dans les milieux aquatiques et terrestres est que, bien que ces techniques mesurent les processus physiologiques microbiens, ces processus ont une influence directe sur les transformations au niveau de l'écosystème de carbone et d'éléments nutritifs. Les taux de décomposition de la matière organique ont été directement liée à l'activité des cellulases extracellulaires dans les sédiments 18,19, de sorte que des mesures rapides de l'activité enzymatique de faciliter la détermination du potentiel instantané dans les taux de décomposition in situ dans des échantillons environnementaux. En utilisant des approches à haut débit de la microplaque permet la mesure simultanée de l'activité enzymatique dans un plus grand nombre d'échantillons que les approches les plus typiques de tube unique, de sorte que la variation de l'activité enzymatique (et par extension dans les processus au niveau de l'écosystème) dans le REEEonse à des facteurs tels que la profondeur de 20 ou perturbations environnementales 9,21 peut être examiné. De même, les dosages d'enzymes impliquées dans le cycle des nutriments, tels que la phosphatase et NAGase, peuvent fournir des indications sur la limitation en nutriments dans des environnements spécifiques, par exemple, l'importance relative du phosphore organique de l'azote organique au cours du développement du sol 8.
Parce que les activités enzymatiques ont été mesurées dans des échantillons environnementaux pour plus de trente ans, les comparaisons entre les études utilisant des méta-analyses avancées sont en train de devenir possible. Ces études suggèrent que, à l'échelle mondiale, l'activité de l'enzyme, et donc des taux de décomposition de la matière organique et la minéralisation des éléments nutritifs, sont liés au pH, la disponibilité du substrat, et des éléments nutritifs stoechiométrie 17. Dans le même temps, l'utilisation d'un protocole sur microplaques a commencé à permettre l'analyse des motifs d'échelle fines dans l'activité enzymatique en utilisant des techniques de cartographie géostatistique 22
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Le financement des aspects de ce travail a été fourni par différentes sources, y compris le Département américain de l'Agriculture de l'accord de coopération spécifique 58-6408-1-595 et la National Science Foundation (prix 1049911).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers | ||
References
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