Summary
Mikroplatten-basierten Verfahren werden für die farbmetrische oder fluorimetrische Analyse der extrazellulären Enzymaktivität beschrieben. Diese Verfahren ermöglichen die Schnelltest an einer solchen Tätigkeit in großer Zahl von Umweltproben in einem überschaubaren Zeitrahmen.
Abstract
Ein Großteil der Nährstoffkreislauf-und Kohlenstoffverarbeitung in natürlichen Umgebungen erfolgt durch die Aktivität extrazellulärer Enzyme, die von Mikroorganismen freigesetzt. So kann die Messung der Aktivität der extrazellulären Enzyme Einblicke in den Sätzen der Ökosystemebene Prozesse, wie den Abbau organischer Materie oder Stickstoff-und Phosphor-Mineralisierung geben. Assays der extrazellulären Enzymaktivität in Umweltproben beinhalten typischerweise das Aussetzen der Proben gegenüber künstlicher kolorimetrische oder fluorometrische Verfolgung Substrate und die Geschwindigkeit der Substrathydrolyse. Hier beschreiben wir auf Mikrotiterplatte Methoden für diese Verfahren, die die Analyse einer großen Anzahl von Proben innerhalb eines kurzen Zeitrahmens zu ermöglichen. Die Proben dürfen mit künstlichen Substraten innerhalb von 96-Well-Mikroplatten oder tiefe Well-Mikroblöcke reagieren, und die Enzymaktivität wird anschließend durch Absorption oder Fluoreszenz der resultierende Endprodukt unter Verwendung eines typischen Mikro reade bestimmtr oder Fluorometer. Solche hohen Durchsatzverfahren erleichtern nicht nur Vergleiche zwischen den räumlich getrennten Stellen oder Ökosysteme, sondern auch die Kosten für solche Tests wesentlich zu reduzieren, indem Gesamtreagenzienvolumina pro Probe benötigt.
Introduction
Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen zu erhalten Nährstoffe und Kohlenstoff von komplexen organischen Verbindungen, durch die Produktion von extrazellulären Enzymen. Diese Enzyme hydrolysieren typischerweise Polymere in kleinere Untereinheiten, die in die Zelle aufgenommen werden können. Daher wird bei einer ökologischen Ebene sind diese mikrobiellen extrazelluläre Enzyme, die für einen Großteil der Nährstoffmineralisierung und den Abbau organischer Materie, die in natürlichen Umgebungen auftritt verantwortlich. Enzyme wie Cellobiohydrolase (CBH) und β-Glucosidase sind für Celluloseabbau und arbeiten gemeinsam, um die Hydrolyse von Cellulose zu Glucose 1,2, das eine verwertbare Kohlenstoffsubstrat zur Aufnahme und mikrobielle Assimilierung bietet katalysieren. Das Enzym Phosphatase Mitteilungen löslichen anorganischen Phosphatgruppen von Organophosphaten wesentlichen Mineralisierung Phosphat und macht es für die Verwendung durch die meisten Organismen 3 verfügbar. Andere Enzyme, wie N-Acetylglucosaminidase (NAGase), sind important in Chitin-Abbau und kann sowohl Kohlenstoff und Stickstoff für die mikrobielle Erwerb 4 verfügbar zu machen.
Eines der Verfahren zur Bestimmung von mikrobiellen extrazelluläre Enzymaktivität in natürlichen Umgebungen ist die Verwendung von künstlichen p-Nitrophenyl (p NP) verbunden Substrate, ein Ansatz, der ursprünglich entwickelt wurde, um Boden-5-Phosphatase-Aktivität zu erkennen. Dieser Ansatz beruht auf dem Nachweis einer farbigen Endprodukt, p-Nitrophenol, die freigesetzt wird, wenn das künstliche Substrat durch das geeignete Enzym hydrolysiert. Das p-Nitrophenol kann anschließend kolorimetrisch durch Messung der Absorption bei etwa 400-410 nm quantifiziert werden. Dieses Verfahren ist seit angewandt, um andere Enzyme, wie NAGase 6 zu erfassen, und wurde in verschiedenen Studien verwendet worden betrachten mikrobielle extrazelluläre Enzymaktivität in Böden und Sedimenten 7-9.
Ein alternativer Ansatz, die originall wary entwickelt, um extrazelluläre Glucosidase-Aktivität zu beurteilen in Gewässern 10,11 macht Gebrauch von 4-Methylumbelliferon (MUB) verbunden Substraten. Das Endprodukt freigesetzt (4-Methylumbelliferon) ist stark fluoreszierend und können mit einem Fluorometer bei einer Anregungs / Emissionseinstellung um 360/460 nm detektiert werden. Eine Vielzahl von MUB vernetzt künstlichen Substrate zur Verfügung stehen, wodurch die fluorometrische Messung der Aktivität mindestens so viele Enzyme (z. B. β-Glucosidase, Cellobiohydrolase, Nagase Phosphatase) wie mit dem p-Substrat NP kolorimetrischen Verfahren analysiert werden. Andere mikrobielle extrazelluläre Enzyme, wie das Protein abbau Leucin-Aminopeptidase kann fluorometrisch unter Verwendung von 7-Amino-4-methyl (COU) verbunden Substrate getestet werden. Sowohl MUB-und COU-verknüpften Substraten wurden verwendet, um die Enzymaktivität in verschiedenen terrestrischen und aquatischen 12,13 Proben zu bestimmen.
Während frühere Studien haben described fluorometrischer oder farbmetrischen Mikro Ansätze zur extrazellulären Enzymaktivität 14 zu bestimmen, es gibt eine Notwendigkeit für eine klare Darstellung, wie solche Tests durchzuführen. Hier zeigen wir, Verfahren für eine Hochdurchsatz-Mikrotechniken für die Analyse von extrazellulären Enzymaktivität in Böden und Sedimenten unter Verwendung des kolorimetrischen p-NP verbunden Substrate Ansatz und in natürlichen Gewässern mit Hilfe der Fluoreszenz MUB-verknüpfte Substrate Technik. Wir konzentrieren uns auf die Messung der Aktivitäten der β-Glucosidase, NAGase und Phosphatase als diese Enzyme an Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor und Radfahren gebunden sind. Jedoch können die hier beschriebenen Verfahren auf die Messung anderer extrazellulärer Enzyme mit verschiedenen künstlichen Substrate aufgebracht werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Farbmetrische Analyse der extrazellulären Enzymaktivität in Böden und Sedimenten
1. Vorbereitung der Substrat-und Pufferlösungen für farbmetrische Analysen der Enzymaktivität
- Vorbereitung 50 mM Acetat-Puffer (pH 5,0-5,5), die durch Mischen von 50 ml 0,1 M Essigsäure (2,87 ml Eisessig in 500 ml Wasser), 150 ml 0,1 M Natriumacetat und 200 ml destilliertem H 2 O. PH-Wert auf 5,0-5,5 mit 0,1 M Essigsäure, falls erforderlich.
- Es wird eine Lösung von 1 M Natriumhydroxid (NaOH) in destilliertem H 2 O.
- Vorbereitung p NP-verknüpften Substratlösungen in 50 mM Acetat-Puffer. Um zu testen Phosphatase vorzubereiten 5 mM p NP-Phosphat in 50 mM Acetat-Puffer, dem Test β-Glucosidase vorzubereiten 5 mM p NP-β-glucopyranosid, dem Test vorzubereiten NAGase 2 mM pNP-β-N-acetylglucosaminide. Bereiten Sie alle Substratlösungen in sterilen 15 ml oder 50 ml Zentrifugenröhrchen. Lösungen bei 4 ° C für 2-3 Wochen gelagert werden.
2. Bestimmung der Absorption zu einem Standard zu p NP Konzentration konvertieren
- Standardlösungen von p-Nitrophenol in 50 mM Acetat-Puffer. Konzentrationen von 0,025 bis 1 mM sollte reichen.
- Über drei Wiederholungen von 100 ul jeder Konzentration zu einer klaren 96-Well-Mikroplatten. In 10 ul 1 M NaOH und 190 ul destilliertem H 2 O in jede Vertiefung.
- Rekord Absorption bei 410 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
- Multiply-Konzentrationen in der Standardkurve von 0,3 bis umol p NP pro 300 ul Reaktionsvolumen zu erhalten. Zeichnen Sie eine Kurve der Absorption gegen umol p NP. Die Steigung der Kurve dient als Umrechnungsfaktor (C), die Absorption beziehen wird von p NP in jedem Enzymreaktion umol.
3. Die Durchführung der Enzym-Assay
- Boden, bereiten eine Aufschlämmung von jeder Probe in einem sterilen 15 ml-Zentrifugenröhrchen auf einer Konzentr untersucht werdenation von etwa 1 g / ml -1 unter Verwendung von 50 mM Acetatpuffer. Für Sedimente, fügen Sie genug Acetatpuffer der Schlamm leicht pipettierbaren zu machen. Das genaue Volumen der Aufschlämmung benötigt wird, gemäß der Anzahl von Enzymen getestet variieren, aber ein Minimum von 5 ml empfohlen. Vortex jeder Brei, bis alle Klumpen von Boden oder Sediment aufgelöst haben und beachten Sie die endgültige Volumen.
- Wiederwirbel jeder Aufschlämmung pipettiert und sofort 150 &mgr; l in jede von sechs Vertiefungen auf einer 96-well Deepwell-Block (1). Es ist wichtig, Vortex gründlich und häufig, um Schmutzpartikel in der Schwebe zu halten. Lassen Sie mindestens zwei Vertiefungen pro Block leer als Substrat Kontrolle dienen. Hinweis: Clip das Ende von Pipettenspitzen mit einer Schere vor dem Pipettieren als Boden Schlämme neigen, um Tipps zu verstopfen. Vorbereitung einer 96-Well-Block für jedes Enzym untersucht werden.
- Pour etwa 5 ml Acetatpuffer in einer Pipettenreservoir und einen 8-Kanal-Pipette 150 ul des Puffers auf den L hinzufügenast zwei Vertiefungen jeder Probe (diese wird Probenpuffer steuert) und die beiden Substrat-Kontrollvertiefungen (Fig. 1)
- Pour etwa 10 ml des geeigneten p NP-Substratlösung in eine Pipettenreservoir und einen 8-Kanal-Pipette 150 ul der Substratlösung zu den ersten vier Vertiefungen für jede Probe und den beiden Substratkontrollvertiefungen hinzu (Abbildung 1). Die verstrichene Zeit, wenn die Reaktion beginnt, wenn die Substratlösung zugegeben.
- Platten bei RT (22 ° C) für 0,5-4 Stunden. Genaue Inkubationszeit variiert je nach Aktivität in den Proben und dem Enzym, die untersucht werden soll, variieren. Für die meisten Böden und Sedimenten, Phosphatase und β-Glucosidase Inkubationszeiten von 0,5-1,5 h, während NAGase und andere Enzyme benötigen Inkubationszeiten von> 2 Stunden.
- Während Tests sind Inkubation vorbereiten klare 96-Well-Mikroplatten, um die Absorption zu lesen. Bereiten Sie eine Mikroplatte für jeden Deepwell-Block (dh für jede Enzyme getestet). Je 10 ul 1 M NaOH und 190 ul destilliertem Wasser in jedes Well der Mikrotiterplatte. Hinweis: NaOH verlangsamt die enzymatische Reaktion und erhöht den pH-Wert, der die Farbe des p NP während der Reaktion frei verbessert.
- Nach der Inkubation zentrifugiert, die 96-Well-Blocks bei 2000-5000 × g für 5 min pelletiert Bodenteilchen.
- Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette zu 100 ul von jedem gut zurückziehen, wobei darauf geachtet, um das Pellet zu vermeiden, und übertragen sie an die entsprechende gut vorbereitet klare 96-Well-Mikroplatten.
- Schalten Sie den Mikroplatten-Reader und die Einsetzung von Software notwendig. Rekord Absorption bei 410 nm auf. Wenn die Absorption einer bestimmten auch über dem linearen Nachweisgrenze des Plattenlesegerät, verdünnen, dass auch 1:1 mit Wasser und Re-Maßnahme. Wenn die Absorption noch zu hoch ist, sollte der Test mit einer kürzeren Inkubationszeit wiederholt werden.
4. Bestimmung der Trockenmasse der Proben
- Je 1 ml jeder sampl E Aufschlämmung in eine vorher gewogene Aluminiumschale.
- Trocken in einem 75 ° C Trockenschrank für 48 Stunden und wiegen. Subtrahieren Sie das Gewicht der Pfanne von diesem Wert um die Trockenmasse an Boden oder Sediment in 1 ml der Suspension zu erhalten. Multiplizieren mit einem Faktor von 0,15, die Trockenmasse der Probe in 150 ul zu jedem im Enzymtest zugesetzt gut bestimmen.
5. Berechnung der Enzymaktivität pro Trockenmasse Boden oder Sediment
- Berechnen endgültige Extinktion jeder Probe durch Subtraktion des Proben-Kontrolle Extinktion der Probe Assay Absorption. Wenn Substrat Kontrollen haben eine hohe Absorption (ca.> 0.060) subtrahiert dann die auch.
- Berechnen Enzymaktivität in umol h -1 g -1 Trockenmasse aus der Gleichung:
Die Enzymaktivität = Schluss Absorption / (C x Inkubationszeit x Probentrockenmasse)
Leuchtstoff-Analyse der extrazellulären Enzymaktivität in natürlichen Gewässern
tle "> 1. Herstellung des Substrats, Standard und Pufferlösungen für Fluorometric Analysen der Enzymaktivität- Planen 200 uM Lösungen der MUB-verknüpften Substraten (z. B. 4-MUB-β-glucopyranosid, 4-MUB-phosphat, 4-MUB-N-Acetyl-β-D-glucosaminid) durch Auflösen des geeigneten Substrats in sterile (autoklaviert) destilliert H 2 O in 15 ml sterile oder 50 ml Zentrifugenröhrchen. Wickeln Sie Rohre in Aluminiumfolie, um Licht auszuschließen und lagern im Kühlschrank vor der Verwendung. Grund sollte stabil sein, für mindestens 1 Woche, wenn auf diese Weise gespeichert.
- Bereiten Sie eine MUB Standard, indem sie eine Stammlösung von 100 uM 4-Methylumbelliferon in sterilem destilliertem H 2 O. Kühl lagern, in Bernstein oder Folie umwickelt Flasche. Unmittelbar vor der Verwendung, verdünnen das 100 uM Stammlösung von 1/10 in sterilem H 2 O, um eine Arbeitslösung von 10 uM für Enzymtests zu machen.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von 100 mM Bicarbonat-Puffer durch Auflösen von 8,4 g NaHCO <sub> 3 in 1 LH 2 O und Autoklavieren. Verdünnen dieser Stammlösung 1/20 in sterilem H 2 O als erforderlich, um eine Arbeitslösung von 5 mM für Enzymtests zu machen.
2. Organisieren von Wasserproben auf einer 96-Well Mikroplatten-Schwarz
- Organisation einer Mikrotiterplatte für jedes Enzym nach dem in 2 gezeigten Beispiel. Beachten Sie, dass damit eine ausreichende Replikation, Standards und Kontrollen, kann dieses Verfahren die Aktivität eines einzelnen Enzyms bis zu neun Wasserproben auf einer 96-Well-Mikroplatte schwarz testen.
- Pour etwa 5 ml der ersten Probe in einer Pipettenreservoir und einen 8-Kanal-Pipette auf ul in alle Vertiefungen in Spalte 1 der Mikrotiterplatte (n) pipette200. Entsorgen Sie gebrauchte Pipettenspitzen und wiederholen Sie so für jede Probe benötigt, um Spalten 1-9 zu füllen.
3. Einrichten Probe, Standard, Quench und Substrat Kontrollen
- Stellen Sie die Kontrollen, für Proben, Standardkontos, Substrat und Abschrecken auf der gleichen schwarzen Mikroplatte wie die Proben (Abb. 2).
- Probenkontrollen enthalten Beispiel Wasser und Bikarbonat-Puffer und werden nicht in den Tätigkeits Berechnungen verwendet, aber wird zeigen, Lesen Konsistenz im gesamten Verlauf des Experiments. Die Quench-Kontrollen bestehen aus Wasser und einer Probe Standardmenge des Fluoreszenzmarkierung und werden verwendet, um die Beugung der Fluoreszenz-in-Wasser-Probe zu messen. Substrat-und Standard-Steuerelemente werden entweder aus Substrat-gebundenen oder die Standard-Fluoreszenzmarkierung sind, und Bicarbonat-Puffer hergestellt.
- Gießen Sie ca. 5 ml 5 mM Bicarbonat-Puffer in eine saubere Pipettenreservoir. Je 50 ul Puffer in Mikrotitervertiefungen 1 bis 9 in Zeilen D und E, um zwei replizieren Vertiefungen der Probenkontrollen pro Probe. Pipettenspitzen wechseln übertragen dann 200 ul von Bikarbonat-Puffer in Vertiefungen 10 bis 12 in den Reihen A und H.
- Reduzieren Umgebungslicht durch Dimmen oder Ausschalten lights als Fluoreszenzstandard ist lichtempfindlich.
- Gießen Sie ca. 5 ml 10 uM 4-Methylumbelliferon in eine saubere Pipettenreservoir. Je 50 ul in Mikrotitervertiefungen 1 bis 12 in Reihe H, und in die Vertiefungen 1 bis 9 in Zeilen G und F bis drei Wiederholungen der Quench-Kontrollen pro Probe und insgesamt Standardkontrollen bilden. Entweder legen Sie die Mikrotiterplatte in der Dunkelheit oder Abdeckung mit einem undurchsichtigen Deckel, Licht Abbau von MUB reduzieren.
- Schalten Sie das Fluorometer und Set-up notwendige Software bereit, vor der Zugabe des Substrats zu lesen sein. Hinweis: Einige Fluorometer Glühbirnen kann eine Aufwärmzeit von 3 Minuten oder mehr benötigen.
- Gießen ca. 5 ml der entsprechenden MUB vernetzt Substrat (z. B. 4-MUB-phosphat) in eine saubere Pipettenreservoir. Verwenden Sie ein 12-Kanal-Pipette auf 50 ul in Mikrotitervertiefungen 1 bis 9 in Zeilen B und C pipettieren 1 bis 12 in Reihe A, und in die Vertiefungen zu drei Wiederholungstests für jede Probe und drei Substrat Kontrollen bilden. SOFORTy fahren Sie mit 4.1, Aufnahme Fluoreszenz Schritt.
4. Aufnahme Fluoreszenz
- Lesen Sie die Anfangsfluoreszenz unmittelbar nach Substrat Neben der Mikro. Nach der Lektüre Fluoreszenz, inkubieren Sie die Platte bei RT (22 ° C) entweder in der Dunkelheit oder mit einem undurchsichtigen Deckel, Licht Abbau von MUB reduzieren bedeckt.
- Die Inkubationszeit, um den maximal möglichen Enzymaktivität in einer Probe zu messen muss, hängt von der Enzymkonzentration in der Probe abhängt. Da dies bekannt ist, bevor der Test abgeschlossen ist, wird die Mikroplatte müssen an mehreren Zeitschritten gelesen werden. Typischerweise liest in Intervallen von 10-15 Minuten über den Verlauf von 1 Stunde ist für viele Enzyme akzeptabel, obwohl Proben mit sehr hoher Aktivität bestimmter Enzyme können vor 10 min Peak.
- Lesen Fluoreszenz in der Mikroplatte an Ihrer gekennzeichneten Abständen für mindestens 1 h weiter. Achten Sie darauf, halten die Mikroplatte abgedeckt oder in der Dunkelheit zwischen Lesens.
5. Berechnung der Enzymaktivität pro Volumen Wasser
- Für jede Probe in jedem Zeitintervall berechnen: meine erste Probenfluoreszenz (Brunnen D und E), die mittlere endgültige Probe Fluoreszenz (Brunnen AC), die mittlere Standard Fluoreszenz (Brunnen H10-11), und die mittlere Steuer löschen Fluoreszenz (Brunnen FG).
- Für jedes Zeitintervall berechnet Enzymaktivität in nmol h -1 ml -1 aus der Gleichung:
Die Enzymaktivität = (mittlere Probenfluoreszenz - meine erste Probenfluoreszenz) / ((mittlere Standard Fluoreszenz / 0,5 mol) x (Mittelwert stillen Steuer Fluoreszenz / mittlere Standard Fluoreszenz) x (0,2 ml) x (Zeit in Stunden))
- Prüft die Aktivitätswerte für jeden Zeitschritt berechnet. Bestimmen Endpotential Aktivität aus der Zeitstufe mit der höchsten Aktivität. Wenn Aktivitätswerte weiter zunehmen, dann kann später Schritte erforderlich; wenn Aktivitätswerte throug fallenhout der Verlauf der Flucht, dann wieder laufen mit kürzeren Zeitschritten. Schluss Aktivität in nmol Substrat verbraucht h -1 ml -1 kann aber bis skaliert werden, um auszudrücken, wie umol h -1 L -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Böden und Gewässern Sedimente haben typischerweise merkliche Mengen an extrazellulären Enzymaktivität als Folge der beigefügten Mikrobengemeinschaften (Biofilme) wachsen auf der Oberfläche der Teilchen. Fig. 3 zeigt, wie diese Aktivität sich in Abhängigkeit von der Größe der Partikel von der Oberfläche Sediment eines dritten erhaltene Ordnung im nördlichen Mississippi, USA. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die bakteriellen Gemeinschaften auf Sedimentpartikel aus diesem Strom kann in drei verschiedene Gruppen auf der Basis molekularer Analyse der Gemeindestruktur getrennt werden: diejenigen auf 0,063 mm Partikel, die auf 0,125, 0,25 und 0,5 mm Partikel, und diejenigen, auf 1 mm Partikel 15. Analyse von Mustern der extrazellulären Enzymaktivität unterstützt diese Schlußfolgerung, mit Phosphatase (Fig. 3A) und die ähnlich zu 0,125, 0,25 und 0,5 mm-Teilchen, aber viel höher auf den 1 und 0,063 mm-Fraktionen, gemessen mit dem p-NP verbunden Substrat Technik. Other Enzyme wie β-Glucosidase (3B) und NAGase (3C) zeigen ähnliche Spitzen auf den feinsten Partikel, sind aber nicht auf 1 mm Partikel erhöht, Hervorhebung der Tatsache, dass verschiedene Enzyme können verschiedene Umweltverteilungen zeigen, und diese können erläutert in diesem Test. Die relativ geringen Fehlerbalken zeigen, dass die farbmetrischen Assays der Enzymaktivität auf Sedimente sind reproduzierbar und somit zugänglich für die statistische Analyse beim Vergleich verschiedener Umweltproben.
Natürliche Gewässer weisen meist geringere extrazelluläre Enzymaktivität pro ml als Böden oder Sedimenten zu tun pro g aufweisen. Als solche sollten sie fluorometrisch unter Verwendung MUB-verknüpfte Substrate getestet werden. 4 zeigt, wie die Aktivität der Enzyme Phosphatase (4A), β-Glucosidase (4B) und NAGase (4C) variiert mit der Tiefe in einem flachen See im nördlichen Mississippi, USAA. Der See (Boondoggle-See) ist bekannt, nährstoffarmen 16, die auch durch die relativ hohe Aktivität der Phosphatase (4A) vorgeschlagen wird, ein Enzym, dass Mikroorganismen produzieren, um Phosphat aus organischen Verbindungen zu erwerben. Für alle drei Enzyme untersucht, Proben an der Wasseroberfläche (0 cm) und 50 cm Tiefe gesammelt zeigte ähnliche Aktivität, während die Aktivität wurde in 100 cm Probe erhöht. Dieses Beispiel wurde im Wesentlichen von der Wasser Sediment Schnittstelle entnommen, und das Vorhandensein von Schmutzpartikeln in der Probe wahrscheinlich erklärt die höhere Aktivität in diesem Beispiel zu sehen ist, insbesondere für β-Glucosidase und NAGase. Wie bei den p NP Substrate, zeigen die niedrigen Fehlerbalken, dass auch mit nur drei Wiederholungsmessungen, ist die Reproduzierbarkeit der fluorimetrischen Assays unter Verwendung von Substraten MUB hoch.
Beachten Sie, dass für Einheiten sind in Abbildung 4 nmol Substrat während diejenigen für Abbildung 3 verbrauchtsind in umol Substrat verbraucht wird, auch wenn die nach Größe vergleichbar ist (entweder pro ml oder pro g). Dies unterstreicht die Tatsache, dass Böden und Sedimenten sind in der Regel viel höher extrazelluläre Aktivität als natürlichen Gewässern (die Aktivitäten der einzelnen spezifischen Enzym in Abbildung 3 sind ca. 10-100x höher als die Aktivitäten der äquivalenten Enzym, das in Abbildung 4). Es zeigt auch die erhöhte Empfindlichkeit der MUB-Substrat verbunden Technik, und die Notwendigkeit der Verwendung dieser Technik zur Bestimmung der extrazellulären Enzymaktivität in Wasserproben.
Fig. 1 ist. Empfohlene Layout der 96-Loch-Deep-Well-Blöcke für den Test von extrazellulären Enzymaktivität in Böden oder Sedimenten mit den farbmetrischen p NP-verknüpft substrate Technik. Jeder sollte gut über insgesamt 300 ul, bis der Probensuspension, Substrat-Lösung oder Acetat-Puffer, je nachdem ob es sich um eine Probe laufen, Probenkontrolle oder Substratsteuer gemacht empfangen.
2. Empfohlene Layout der 96-Well-Mikroplatten schwarz für den Test von extrazellulären Enzymaktivität in Wasserproben mit Hilfe der fluorimetrischen MUB-Linked-Substrat-Technik. Neun Proben senkrecht auf der Platte (A) jedes Besatzungs acht Vertiefungen angeordnet werden. Diese acht Wells für Probe läuft, Probenkontrollen verwendet, und löschen Kontrollen während verbleibenden Wells für Substrat Kontrollen und Standards MUB (B) verwendet.
3. Extrazelluläre Enzymaktivität auf verschiedenen Größen von Oberflächensedimentpartikel aus einem kleinen Bach im Norden von Mississippi, USA gesammelt. Jede Kornfraktion wurde für die Aktivität der Phosphatase (A), β-Glucosidase (B) untersucht und NAGase (C) nach der p NP-Substrat farbmetrischen Verfahren. Die Aktivität wird in umol Substrat verbraucht h -1 g Trockenmasse des Sediments -1 gemeldet und ist der Mittelwert (+ SE) von drei Wiederholungsmessungen pro Korngrößenfraktion.
4. Extrazelluläre Enzymaktivität in Wasser bei drei verschiedenen genommenschiedenen Tiefen (0, 50 und 100 cm) aus einem flachen See im Norden von Mississippi, USA wurde. Wasser für die Aktivität der Phosphatase (A), β-Glucosidase (B) untersucht und NAGase (C) nach der MUB-Substrat- fluorimetrischen Verfahren. Die Aktivität wird in nMol Substrat verbraucht h -1 ml Wasser -1 angegeben und ist die mittlere (+ SE) drei Wiederholungsmessungen pro Probe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Bestimmung der Aktivität einer Vielzahl von mikrobiellen extrazelluläre Enzyme in Böden und Sedimenten können nützliche Einblicke in Raten von Nährstoffmineralisierung und organische Stoffe Verarbeitung 17 vorzusehen. Allerdings können Böden in ihren Feuchtigkeitsgehalt variieren, so ist es wichtig, den Boden Trockengewicht standardisieren Aktivität. Dies erfordert einen zusätzlichen Trocknungsschritt (typischerweise von zwei Tagen), über die einfache Messung der Enzymaktivität. Somit im Gegensatz zu Assays der Enzymaktivität in Wasserproben, die nahezu augenblickliche Ergebnisse liefern, zuverlässige Assays der Enzymaktivität im Boden und in Sedimenten ein paar Tage. Bei einigen Böden kann es sogar sinnvoll sein, um die Aktivität pro Gramm der organischen Substanz oder aschefreier Trockenmasse ausdrücken, dass ein zusätzlicher Veraschungsschritt (typischerweise 2 Stunden bei 500 ° C) über dem Trocknungsvorgang. Unabhängig davon ist der wichtigste Schritt bei der kolorimetrischen Assay an Boden oder Sediment Enzymaktivität der Abzug der überstehenden Flüssigkeit aus dem Tiefbrunnen Block fach Zentrifugieren am Ende der Inkubationszeit. Da dieses Verfahren beruht auf der Messung der Absorption kann auch die Anwesenheit von wenigen Streubodenpartikel in der endgültigen Mikro zu falschen Ergebnissen führen. Höhere Geschwindigkeiten Zentrifugation (> 5.000 xg) könnte helfen, dieses Problem zu mildern, aber in unserer Erfahrung Zentrifugenrotoren, die Mikroplatten haben in der Regel akzeptieren Drehgrenzen unterhalb dieser Schwelle, und die Blöcke selbst können nicht viel höheren Geschwindigkeiten zu tolerieren. Im Wesentlichen diese besondere Pipettieren Schritt erfordert eine Kombination von Pflege und Geschwindigkeit, um eine Multi-Kanal-Pipette verwenden, um schnell die erforderliche Menge an Überstand übertragen aus dem Deep-Well-Block an den Mikro.
Assays der extrazellulären Enzymaktivität in Wasserproben weder die Notwendigkeit eines Trocknungszeit noch den Zentrifugationsschritt, die letztere, weil in der gleichen Mikroplatte sowohl die Enzym-Substrat-Reaktion und Messung der Fluoreszenz des Endproduktes auftreten. Als solche sind diese einssays sind in der Regel schneller und kann zunächst einfacher zu laufen scheinen. Allerdings haben sie ihre eigenen Grenzen, dass, wann immer möglich, sollte die Standard-und MUB MUB-Linked-Substrate nicht dem Licht ausgesetzt werden. Nach unserer Erfahrung Dimmen der Beleuchtung ebenso möglich beim Pipettieren und Inkubation der Mikroplatten in der Dunkelheit (oder mit einem undurchsichtigen Deckel abgedeckt) ist eine Notwendigkeit. Da diese Tests erfordern auch die Platten zu mehreren Zeitpunkten gelesen werden, führt dies oft zu der Notwendigkeit sehr schnelles Umschalten zwischen Platten bei Bestimmung mehrerer Enzyme gleichzeitig. Beispielsweise um neun Wasserproben für die Aktivität von sechs Enzymen gleichzeitig (dh unter Verwendung von sechs verschiedenen Mikrotiterplatten-Test), wird es notwendig, eine Platte alle 2 min für 1 h, um sicherzustellen, dass jedes einzelne Leseplatte lesen jede 10 -15 min (in diesem Fall alle 12 min). Ist darauf zu achten, den Überblick über die jeweilige Platte gelesen zu halten, als auch um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit verschüttet werden from die Platte, wenn sie in und aus dem Mikro Fluorometer übertragen wird. Beim Testen mehrerer Enzyme auf einmal, es ist auch wichtig zu beachten, die Zeit, die es dauert, bis der Mikroplatten-Reader, um tatsächlich die Platte zu lesen und zu staffeln Lesen Intervalle entsprechend zu halten. Eine endgültige Auseinandersetzung mit dem Fluoreszenztest von extrazellulären Enzymaktivität in Wasserproben ist bei der Arbeit mit Proben, die trüb sind. Wasserproben, die Schwebeteilchen enthalten, sollten vor Beginn Gießen in die Pipettenbehälter geschüttelt und durch Zurückziehen und Auswerfen mit der Pipette, bevor sie auf der Mikroplatte wieder geladen gemischt werden. Höhere Anzahl von Teilchen in einer Probe führt auch in der Regel in größeren Abschrecken des Fluoreszenzsignals, und die Bedeutung der Quench-Steuerungen für jede Probe kann nicht genug betont werden.
Während MUB-und p-NP verbunden Substraten zeigen typischerweise ähnlich V max-Werte für die Umwelt Enzyme, die K m-Werteunterscheiden können, und Enzyme, wie β-Glucosidasen, Phosphatasen und kann höhere Affinität für MUB-verknüpfte Substrate als ihre p NP-verknüpfte Analoga 14 haben. Daher sind MUB-verknüpfte Substrate wahrscheinlich empfindlicher als die p NP, was darauf hindeutet, dass sie eine bessere Wahl, wenn die Messung der Enzymaktivität in Böden und Sedimenten zu verwenden verbunden sein. Doch die fluorogenen End-Produkt, während MUB-Assays gemessen wird, ist dem potentiellen Abschrecken in einigen Bodenextrakten und Fluoreszenzmesswerte über die Zeit 12 instabil sein. Böden und Sedimente sind in der Regel auch zu höheren extrazellulären Enzymaktivität als natürlichen Gewässern haben, so dass die erhöhte Empfindlichkeit der fluorometrischer MUB-Linked-Assays können kleine Vorteil gegenüber den farbmetrischen p NP Methoden angesichts der möglichen Probleme mit Lösch wenn bestimmte Böden bieten. Als Randbemerkung, die p NP-Substrate verbunden und der p NP-Standard selbst sind in der Regel affordaBLE als ihre Pendants MUB, einen weiteren Grund für ihre Verwendung, wenn die Haushaltsbeschränkungen gelten.
Vielleicht der wichtigste Aspekt in der Lage, mikrobielle extrazelluläre Enzymaktivität in aquatischen und terrestrischen Umgebungen zu untersuchen ist, dass während diese Techniken messen mikrobiellen physiologische Prozesse, haben diese Prozesse einen direkten Einfluss auf Ökosystemebene Transformationen von Kohlenstoff und Nährstoffen. Preise der Abbau organischer Materie wurden direkt auf die Aktivität von extrazellulären Cellulasen in Sedimenten 18,19 verknüpft, so dass eine schnelle Messungen der Enzymaktivität möglicherweise die Bestimmung des momentanen in situ Abbauraten in Umweltproben zu erleichtern. Mit Hochdurchsatz-Mikro Ansätze ermöglicht die gleichzeitige Messung der Enzymaktivität in einer größeren Anzahl von Proben als weitere typische Einzelrohr Ansätze, so dass eine Variation der Enzymaktivität (und durch Erweiterung in Ökosystemebene Prozesse) bzw. inonse Faktoren wie Tiefe 20 oder Umgebungsstörungen 9,21 untersucht werden. Ebenso Tests von Enzymen in den Nährstoffkreislauf beteiligt sind, wie Phosphatase und Nagase, können Einblicke in einen Nährstoffmangel in bestimmten Umgebungen zu organischen Stickstoff während 8 Bodenentwicklung bieten, zum Beispiel, die relative Bedeutung der organischen Phosphor.
Da Enzymaktivitäten wurden in Umweltproben seit über dreißig Jahren gemessen werden Vergleiche zwischen den Studien mit Hilfe modernster Meta-Analysen jetzt immer möglich. Solche Studien deuten darauf hin, dass bei den globalen Maßstab, Enzymaktivität und damit Raten der Abbau organischer Materie und Nährstoffmineralisierung werden pH-Wert, Substratverfügbarkeit und Nährstoff Stöchiometrie 17 gebunden. Zugleich wird die Verwendung einer Mikro-basiertes Protokoll begonnen hat, die Analyse der Feinstufenmuster in der Enzymaktivität unter Verwendung von Abbildungstechniken geostatistisches 22 zu ermöglichen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Finanzierung für Aspekte dieser Arbeit wurde von verschiedenen Quellen, einschließlich des United States Department of Agriculture Spezifische Kooperationsvertrag 58-6408-1-595 und der National Science Foundation (preis 1049911) zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers | ||
References
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
- Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
- Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
- Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
- Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
- Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
- Hoppe, H. -G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
- Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
- Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
- Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
- Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
- Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
- Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
- Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).
