Summary
Mikro baserte prosedyrer er beskrevet for kolorimetrisk eller fluorometrisk analyse av ekstracellulær enzymaktivitet. Disse fremgangsmåter tillater hurtig assay av en slik aktivitet i store mengder miljøprøver i løpet av en overkommelig tidsramme.
Abstract
Mye av næringssyklus og karbonbehandling i naturlige miljøer skjer gjennom aktiviteten av ekstracellulære enzymer utgitt av mikroorganismer. Således kan måling av aktiviteten av slike ekstracellulære enzymer gi innsikt i satsene for økosystem nivå prosesser, for eksempel organisk materiale nedbrytning eller nitrogen-og fosfor-mineralisering. Analyser av ekstracellulær enzymaktivitet i miljøprøver involverer typisk å utsette prøvene for kunstige kolorimetriske substrater eller fluorometriske og relativ hastighet på substratet hydrolyse. Her beskriver vi mikro baserte metoder for disse fremgangsmåter som tillater analyse av store antall prøver i løpet av en kort tidsperiode. Prøvene får lov til å reagere med kunstige substrater innenfor 96-brønners mikroplater eller dyp brønn mikroplate blokker, og enzymaktiviteten blir deretter bestemt ved absorpsjon eller fluorescens av det resulterende sluttprodukt ved hjelp av en typisk mikro reader eller fluorometer. Slike høy gjennomstrømning prosedyrer ikke bare lette sammenligninger mellom romlig atskilte områder eller økosystemer, men også betydelig redusere kostnadene for slike analyser ved å redusere samlede reagensvolumene trengs per prøve.
Introduction
Mikroorganismer som bakterier og sopp skaffe næringsstoffer og karbon fra komplekse organiske forbindelser gjennom produksjon av ekstracellulære enzymer. Disse enzymene vanligvis hydrolyze polymerer i mindre subenheter som kan tas opp i cellene. Derfor, i et økologisk nivå, disse ekstracellulære mikrobielle enzymer er ansvarlige for mye av næringsstoff mineralisering og organisk materiale nedbrytning som forekommer i naturlige omgivelser. Enzymer slik som cellobiohydrolase (CBH) og β-glukosidase er viktige for cellulosedegradering og arbeider unisont for å katalysere hydrolysen av cellulose til glukose 1,2, noe som gir en utilizable karbon substrat for mikrobiell opptak og assimilasjon. Enzymet fosfatase utgivelser løselige uorganiske fosfatgrupper fra organofosfater, i hovedsak mineralizing fosfat og gjør den tilgjengelig for bruk av de fleste organismer 3. Andre enzymer, slik som N-acetylglucosaminidase (Nagase), er important i kitin degradering og kan gjøre både karbon og nitrogen tilgjengelig for mikrobiell oppkjøpet fire.
En av de fremgangsmåter for analyse av mikrobiell ekstracellulær enzymaktivitet i naturlige omgivelser er bruken av kunstig p-nitrofenyl-(p NP) koblede substrater, en fremgangsmåte som opprinnelig ble utviklet for å detektere jord fosfataseaktivitet 5. Denne fremgangsmåten er avhengig av detektering av et farget sluttprodukt, p-nitrofenol, som frigjøres når det kunstige substrat blir hydrolysert av det aktuelle enzym. Den p-nitrofenol kan deretter bli kvantifisert kolorimetrisk ved å måle absorbans ved ca 400 til 410 nm. Metoden har senere blitt anvendt for å påvise andre enzymer så som Nagase 6, og har vært brukt i forskjellige studier ser på mikrobiell ekstracellulær enzymaktivitet i jord og sedimenter 7-9.
En alternativ tilnærming som var originally utviklet for å vurdere ekstracellulære glukosidase aktivitet i akvatiske miljøer 10,11 gjør bruk av fire-methylufilbelli (MUB) knyttet underlag. Sluttproduktet sluppet (4-methylufilbelli) er svært fluoriserende og kan påvises ved hjelp av en fluorometer med en eksitasjon / emisjon omgivelser rundt 360/460 nm. En rekke MUB-koblede kunstige substrater er tilgjengelige, tillater fluorometrisk måling av aktiviteten av minst like mange enzymer (f.eks β-glucosidase, cellobiohydrolase, Nagase, fosfatase) som kan undersøkes ved hjelp av p NP-substrat kolorimetriske prosedyre. Andre mikrobielle ekstracellulære enzymer slik som protein-nedbrytende leucin aminopeptidase, kan analyseres ved hjelp av fluorometrisk 7-amino-4-methylcoumarin (COU) koblede substrater. Både MUB-og COU-koblede substrater har blitt brukt til å bestemme enzymaktivitet i ulike terrestriske og akvatiske prøver 12,13.
Mens tidligere studier har descrIbed fluorometrisk eller kolorimetrisk mikro tilnærminger for å bestemme ekstracellulær enzymaktivitet 14, er det behov for en klar presentasjon av hvordan å gjennomføre slike analyser. Her har vi også vist fremgangsmåter for å drive høye gjennomløpsmikro teknikker for analyse av ekstracellulær enzymaktivitet i jord og sedimenter ved hjelp av kolorimetrisk p-NP-bundet substrater tilnærming og i naturlig vann ved bruk av det fluorescerende MUB-koblede substrater teknikk. Vi fokuserer på måling av virksomheten til β-glukosidase, Nagase, og fosfatase som disse enzymene kan knyttes til karbon, nitrogen og fosfor sykling, henholdsvis. Imidlertid kan fremgangsmåten som er beskrevet her kan brukes til måling av andre ekstracellulære enzymer med forskjellige kunstige substrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Colorimetric Analyse av Ekstracellulær enzymaktivitet i jord og sedimenter
En. Utarbeidelse av substrat og bufferløsninger for Kolorimetriske Analyser av enzymaktivitet
- Forbered 50 mM acetatbuffer (pH 5,0-5,5) ved å blande 50 ml 0,1 M eddiksyre (2,87 ml iseddik i 500 ml vann), 150 ml 0,1 M natrium-acetat, og 200 ml destillert H2O Juster pH til 5,0 til 5,5 med 0,1 M eddiksyre om nødvendig.
- Tilbered en løsning av 1 M natriumhydroksyd (NaOH) i destillert H2O
- Forbered p NP-linked substrat løsninger i 50 mM acetat buffer. For å analysere fosfatase forberede 5 mM p NP-fosfat i 50 mM acetatbuffer, for å bestemme β-glukosidase forberede 5 mM p NP-β-glukopyranosid; å analysen Nagase forberede 2 mM PNP-β-N-acetylglucosaminide. Forbered alle substrat løsninger i sterile 15 ml eller 50 ml sentrifugerør. Løsninger kan lagres ved 4 ° C i 2-3 uker.
2. Fastsettelse av en Standard konverterer Absorbans til p NP Konsentrasjon
- Forbered standardoppløsninger av p-nitrofenol i 50 mM acetatbuffer. Konsentrasjonene bør ligge 0,025 til 1 mM.
- Overføring tre replikater av 100 ul av hver konsentrasjon til en klar 96-brønns mikroplate. Tilsett 10 pl 1 M NaOH og 190 pl destillert H2O til hver brønn.
- Record absorbans ved 410 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
- Multipliser konsentrasjoner i standardkurven med 0,3 for å få pmol p NP per 300 pl reaksjonsvolum. Plotte en kurve for absorpsjon mot pmol av p NP. Helningen av kurven tjener som omregningsfaktor (C) som skal forholde absorbansen til pmol av p NP i hver enzymreaksjon.
Tre. Gjennomføring av enzymanalysen
- For jord, forberede en oppslemming av hver prøve som skal undersøkes i et sterilt 15 ml sentrifugerør ved en konsentrasjonerasjon på ca 1 g / ml -1 bruker 50 mm acetat buffer. For sedimenter, tilsett nok acetatbuffer å gjøre slammet lett pipettable. Det nøyaktige volum av oppslemmingen er nødvendig vil variere i henhold til det antall enzymer analysert, men et minimum på 5 ml er anbefalt. Vortex hver slurry til alle klumper av jord eller sediment har spredt og merk den endelige volum.
- Re-vortex hver oppslemming og umiddelbart pipettere 150 pl i hver av seks brønner på en 96-brønns Deepwell blokken (fig. 1). Det er viktig å virvle grundig og ofte for å holde jordpartikler i suspensjon. La det være minst to brønner pr blokk tomme for å tjene som et substrat-kontroll. Merk: clip slutten av pipettespisser med saks før pipettering som jord slam tendens til å tette tips. Tilbered en 96-brønns blokk for hvert enzym som skal undersøkes.
- Hell over i omtrent 5 ml acetatbuffer inn i en pipette reservoar og bruke en 8-kanals pipette for å legge til 150 pl av buffer til last to brønner for hver prøve (disse vil være eksempler på bufferkontroll) og de to substrat kontrollbrønner (figur 1)
- Hell over omtrent 10 ml av den passende p NP-substrat-løsning inn i en pipette reservoar og bruke en 8-kanals pipette for å legge til 150 pl av substratoppløsningen i de første fire brønnene til hver prøve, og de to substrat kontrollbrønner (figur 1). Legg merke til den tid som reaksjonen begynner så snart det substrat-oppløsningen tilsettes.
- Inkuber platene ved romtemperatur (22 ° C) i 0,5-4 timer. Eksakt inkubasjonstid vil variere avhengig av aktiviteten i prøvene, og enzymet som skal analyseres. For de fleste jordsmonn og sedimenter, fosfatase og β-glukosidase krever inkubasjonstid på 0,5-1,5 timer, mens Nagase og andre enzymer krever inkubasjonstidene av> 2 hr.
- Mens analysene ruger utarbeide klare 96-brønnen mikro å lese absorbans. Forbered en mikroplate for hver Deepwell blokk (dvs. for hver enzyme analysert). Pipetter 10 pl 1 M NaOH og 190 pl destillert vann til hver brønn på mikroplaten. Merk: NaOH bremser den enzymatiske reaksjon og hever pH-verdien, som forbedrer fargen på p NP frigjøres under reaksjonen.
- Etter inkubering, sentrifuger 96-brønners blokker på 2,000-5,000 xg i 5 minutter for å pelletere jordpartikler.
- Bruk en flerkanalspipette å trekke 100 mL fra hver brønn, er forsiktig med å unngå kulene, og overføre den til den tilsvarende godt på forberedt klare 96-brønns mikro.
- Slå på mikroplateleser og sette opp all nødvendig programvare. Record absorbans ved 410 nm. Hvis absorbansen til en bestemt brønn er over den lineære påvisningsgrensen for plate-leser, fortynnes så godt 1:1 med vann og re-mål. Hvis absorbans fremdeles er for høy, må analysen gjentas med en kortere inkuberingstid.
4. Bestemmelse av tørrmasse Samples
- Pipetter 1 ml av hver sampl e slurry til en veid på forhånd aluminiumspanne.
- Tørr i en 75 ° C tørking ovnen i 48 timer og veie. Subtrahere vekten av pannen fra denne verdi for å oppnå den tørre masse av jord eller sediment i 1 ml av oppslemmingen. Multipliser med en faktor på 0,15 for å bestemme tørrvekt av prøven i 150 ul tilsatt til hver brønn i enzymanalysen.
5. Beregning av enzymaktivitet per Dry Mass of Soil eller Sediment
- Beregn endelige absorbansen til hver prøve ved å trekke prøvekontroll absorbans fra prøveanalyse absorbans. Hvis underlaget kontrollene har høy absorbans (omtrent> 0,060) og deretter trekke dem også.
- Beregn enzymaktivitet i my mol t -1 g tørrvekt -1 fra ligningen:
Enzymaktivitet = Endelig absorbans / (C x inkubasjonstid x sample tørr masse)
Fluorescent Analyse av Ekstracellulær enzymaktivitet i Natural Waters
tle "> en. Forberedelse av substrat, Standard, og buffer Løsninger for fluorometrisk Analyser av enzymaktivitet- Forbered 200 uM oppløsninger av MUB-bundne substrater (for eksempel 4-MUB-β-glukopyranosid, 4-MUB-fosfat, 4-MUB-N-acetyl-β-D-glukosaminid) ved oppløsning av den passende substrat i sterilt (autoklavert) destillert H 2 O i sterile 15 ml eller 50 ml sentrifugerør. Vikle rør i aluminiumsfolie for å utelukke lys og lagre i kjøleskap før bruk. Underlaget bør være stabilt i minst en uke ved lagring på denne måten.
- Forbered en MUB standard ved å lage en stamløsning av 100 mikrometer 4-methylufilbelli i sterilt destillert H 2 O. Oppbevares i kjøleskap i rav eller folie-innpakket flaske. Umiddelbart før anvendelse, fortynnes 100 mM stamløsning med 1/10 i sterilt H2O til å foreta en arbeidsløsning av 10 uM for enzymanalyser.
- Tilbered en stamløsning av 100 mM bikarbonatbuffer ved å oppløse 8,4 g NaHCO <sub> tre inn i en LH 2 O og autoklavering. Fortynn denne stamløsning 1/20 i sterilt H2O som er nødvendig for å foreta en arbeidsløsning av 5 mM for enzymanalyser.
2. Organisere vannprøver på en 96-Well Sort Mikro
- Organisere en mikroplate for hvert enzym etter eksempel vist i figur 2. Legg merke til at for å tillate tilfredsstillende replikasjon, standardene og kontrollene, kan denne fremgangsmåten analysen av aktiviteten til et enkelt enzym for opptil ni vannprøver på en 96-brønners sorte mikroplate.
- Hell over i omtrent 5 ml av den første prøven i en pipette reservoar og bruke en 8-kanals pipette for å pipette200 mL i alle brønnene i kolonne 1 av mikroplate (e). Kast brukte pipetter og gjenta etter behov for hver vannprøve å fylle kolonner 1-9.
Tre. Sette opp Sample, Standard, Slukke, og substrat Controls
- Sett opp kontrollene til å gjøre rede for prøver, standards, substrat og bråkjøling på den samme sorte mikroplate som prøvene (figur 2).
- Eksempel kontroller inneholder prøven vann og bikarbonat-buffer, og er ikke benyttet i beregningene aktivitet, men vil vise lesing konsistens i løpet av eksperimentet. Slukke Kontrollene består av sample vann og en standard mengde av det fluorescerende merke og blir brukt til å måle diffraksjon av fluorescens i prøven vann. Substrat og standard kontroller består av enten underlaget bundet eller standard fluorescerende tag, henholdsvis, og bikarbonatbuffer.
- Hell over i omtrent 5 ml 5 mM bikarbonatbuffer i en ren pipette reservoaret. Pipetter 50 mL buffer til mikrobrønnene 1 til 9 i Rader D og E for å danne to replikere brønner av prøvekontroller per prøve. Endre pipetter deretter overføre 200 mL bikarbonatbuffer til brønnene 10 til 12 i rader A og H.
- Reduser omgivelseslys ved å dimme eller slå av lights som fluorescerende standard er lysfølsom.
- Hell over i omtrent 5 ml av 10 mM 4-methylufilbelli i en ren pipette reservoaret. Pipetter 50 mL i mikrobrønner 1 til 12 i Rad H, og i brønner 1 til 9 i rader G og F for å danne tre gjentak av dempingen kontroller per prøve og generelle standard kontroller. Enten plassere mikro i mørket eller dekk til med en ugjennomsiktig lokk for å redusere lys nedbrytning av MUB.
- Slå på fluor og sette opp all nødvendig programvare for å være klar til å lese før du legger underlaget. Merk: noen Fluorometer pærer kan kreve en oppvarmingstid på tre minutter eller mer.
- Hell over i omtrent 5 ml av den passende MUB-bundet substrat (for eksempel 4-MUB-fosfat) i en ren pipette reservoaret. Bruk en 12-kanals pipette å pipettere 50 mL i mikrobrønner 1 til 12 i rad A, og i brønner 1 til 9 i Rader B og C for å danne tre replikat analyser for hver prøve og tre substrat kontroller. Immediately videre til trinn 4.1, innspilling fluorescens.
4. Opptak Fluorescens
- Les den første fluorescens umiddelbart etter underlaget tillegg til mikroplaten. Etter å ha lest fluorescens, Inkuber mikro ved RT (22 ° C), enten i mørke eller dekket med et ugjennomsiktig lokket for å redusere lys nedbrytning av MUB.
- Inkubasjonstiden er nødvendig for å måle det maksimale potensialet enzymaktivitet i en vannprøve, vil avhenge av enzymkonsentrasjonen i prøven. Siden dette er ikke kjent før analysen er fullført, vil mikro må leses i flere tidstrinn. Vanligvis lesing ved intervaller på 10-15 minutter i løpet av 1 time er akseptabelt for mange enzymer, selv om prøvene med svært høy aktivitet for visse enzymer kan nå en topp før 10 min.
- Fortsett å lese fluorescens i mikroplate ved de angitte intervaller i minst 1 time. Sørg for å holde mikro dekket eller i mørket mellom lesings.
5. Beregning av enzymaktivitet per volum av vann
- For hver prøve ved hvert tidsintervall beregne: bety første fluorescens (brønner D og E) og det gjennomsnittlige endelige prøven fluorescens (brønner AC), den midlere standard fluorescens (brønner H10-11), og den midlere slukke styre fluorescens (brønner FG).
- For hvert tidsintervall, å beregne enzym-aktivitet i nmol t -1 -1 ml fra ligningen:
Enzymaktivitet = (gjennomsnittlig fluorescens - betyr initial fluorescens) / ((gjennomsnittlig standard fluorescens / 0,5 mol) x (midlere slukke styre fluorescens / betyr standard fluorescens) x (0,2 ml) x (tid i timer))
- Undersøk aktivitetsverdiene beregnes for hvert tidstrinn. Bestem endelige potensial aktivitet fra tid takt med den høyeste aktiviteten. Hvis aktivitetsverdiene fortsetter å øke så senere tidspunkter skritt kan være nødvendig, hvis aktivitets verdier faller througHout løpet av kjøringen, så løpe igjen med kortere tidssteg. Endelig aktivitet er i nmole av underlaget konsumert hr -1 ml -1 men kan skaleres opp til å uttrykke så jimol hr -1 L -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jordsmonn og akvatiske sedimenter vanligvis har betydelige nivåer av ekstracellulær enzymaktivitet som en følge av vedlagte mikrobielle samfunn (biofilm) som vokser på overflaten av partiklene. Figur 3 viser hvordan denne aktiviteten varierer avhengig av størrelsen på partiklene som oppnås fra overflaten sediment av et tredje For produksjon i nordlige Mississippi, USA. En tidligere studie har vist at bakteriesamfunn på sedimentpartikler fra denne strømmen kan deles inn i tre forskjellige grupper, basert på molekylær analyse av deres samfunnsstruktur: de på 0,063 mm partikler, de på 0,125, 0,25 og 0,5 mm partikler, og de på en mm partikler 15. Analyse av mønstre i ekstracellulære enzymaktivitet støtter denne konklusjonen, med fosfatase (figur 3A) er omtrent det samme på 0.125, 0,25 og 0,5 mm partikler, men mye høyere på en og 0,063 mm fraksjoner målt ved bruk av p NP-linked underlaget teknikk. Other enzymer så som β-glukosidase (figur 3B) og Nagase (figur 3C) viser tilsvarende topper på de fineste partikler, men er ikke forhøyet på 1 mm partikler, fremhever det faktum at forskjellige enzymer kan vise forskjellige miljø fordelinger, og disse kan bli belyst ved hjelp av denne analysen. De relativt lave feilfelt viser at fargemetriske analyser av enzymaktivitet på sedimenter er reproduserbare og dermed mottakelig for statistisk analyse når man sammenligner ulike miljøprøver.
Naturlig vann har en tendens til å ha lavere ekstracellulære enzymaktivitet per ml enn jord eller sedimenter gjør per g. Som sådan bør de bli analysert fluorometrisk ved hjelp av MUB-bundne substrater. Figur 4 viser hvordan aktiviteten av enzymene fosfatase (figur 4A), β-glukosidase (figur 4B) og Nagase (figur 4C) varierer med dybden i en grunn lake i det nordlige Mississippi, USAA. Den lake (Lake Boondoggle) er kjent for å være næringsfattige 16, som også er foreslått av den relativt høye aktivitet av fosfatase (figur 4A), et enzym som produserer mikroorganismer for å erverve fosfat fra organiske forbindelser. For alle de tre enzymene analysert, ble prøver tatt ved overflaten vannet (0 cm) og 50 cm dybde viste tilsvarende aktivitet, mens aktiviteten ble forhøyet i 100 cm prøven. Denne prøven ble tatt fra i det vesentlige vann-sediment grensesnittet, og tilstedeværelsen av sedimentpartikler i prøven sannsynligvis utgjør den høyere aktivitet sett i denne prøven, spesielt for β-glukosidase og Nagase. Som med de p NP underlag, lav feilfelt viser at selv med bare tre replikat avlesninger, er høy reproduserbarhet av de fluorometriske analyser ved hjelp MUB underlag.
Merk at enheter for figur 4 er i nmole av underlaget forbrukes mens de for figur 3er i pmol av substrat forbrukes, selv om per enhetsstørrelse er sammenlignbare (enten per ml eller per g). Dette understreker det faktum at jord og sedimenter tendens til å ha mye høyere ekstracellulære aktivitet enn naturlig vann (aktivitetene til hver bestemt enzym i figur 3 er ca 10-100x høyere enn aktivitetene til den tilsvarende enzym i figur 4). Det demonstrerer også den økte følsomheten til MUB-bundet substrat teknikk, og nødvendigheten av å bruke denne teknikken for analyse av ekstracellulær enzymaktivitet i vannprøver.
Figur 1. Forslag til utformingen av 96-brønners dype brønnblokker for analyse av ekstracellulær enzymaktivitet i jord eller sjøbunn ved hjelp av kolorimetrisk p-NP-koblede substrate teknikk. Hver brønn skal motta totalt 300 pl, som består av prøve slurry, substratoppløsning eller acetatbuffer, avhengig av om det er en prøve utført, sample-kontroll, eller substrat-kontroll.
Figur 2. Forslag til utformingen av 96-brønners sorte mikroplater for analyse av ekstracellulær enzymaktivitet i vannprøver ved hjelp av fluorometrisk MUB-bundet substrat teknikk. Ni prøver kan være anordnet loddrett på platen (A) som hver opptar åtte brønner. Disse åtte brønner er brukt for prøven går, eksempel kontroller, og slukke kontroller, mens de resterende brønner brukes til substrat-kontroller og MUB-standarder (B).
Figur 3. Ekstracellulær enzymaktivitet på forskjellige størrelser av overflatesedimentpartikler er samlet inn fra en liten strøm i nord Mississippi, USA. Hvert partikkelstørrelse fraksjon ble analysert med hensyn på aktiviteten av fosfatase (A), β-glukosidase (B) og Nagase (C) ved å følge p NP-substrat kolorimetriske prosedyre. Aktiviteten er rapportert i pmol substrat forbrukes t -1 g tørr masse av sediment -1 og er gjennomsnittet (+ SE) i tre gjentatte avlesninger pr partikkelstørrelsesfraksjon.
Figur 4. Ekstracellulær enzymaktivitet i vann tatt ved tre forskjelskjellige dybder (0, 50, og 100 cm) fra en grunn innsjø i nord Mississippi, ble USA. Vann analysert med hensyn på aktiviteten av fosfatase (A), β-glukosidase (B) og Nagase (C) som følge av MUB-substrat fluorometrisk prosedyre. Aktiviteten er rapportert i nmole substrat forbrukes h -1 dl vann -1 og er gjennomsnittet (+ SE) av tre replikat målinger per prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestemme aktiviteten til en rekke mikrobielle ekstracellulære enzymer i jordsmonn og sedimenter kan gi nyttig innsikt i utbredelsen av næringsstoff mineralisering og organisk materiale behandlingen 17. Imidlertid kan jord varierer i deres fuktighetsnivå, slik at det er viktig å standardisere aktiviteten til jorden tørrvekt. Dette krever et ekstra tørketrinn (typisk av to dager) enn bare å måle enzymaktiviteten. Således, i motsetning til analyser av enzym-aktivitet i vannprøver som gir nær øyeblikkelig resultater, pålitelige undersøkelser av enzymaktivitet i jord og sedimenter ta noen dager. For noen slags jordsmonn, kan det også være mer hensiktsmessig å uttrykke aktiviteten per gram av organisk materiale eller askefritt tørrmasse, som krever en ekstra ashing trinn (vanligvis 2 timer ved 500 ° C) utover tørkeprosedyren. Uansett, det mest kritiske trinn i kolorimetrisk analyse av jord eller sediment enzymaktivitet er uttak av supernatanten fra det dype brønnen blokk following sentrifugering ved slutten av inkubasjonsperioden. Siden denne fremgangsmåten er avhengig av måling av absorbans, kan til og med tilstedeværelse av noen få spredte jordpartikler i den endelige mikro føre til falske resultater. Høyere sentrifugeringshastighet (> 5000 xg) kan bidra til å redusere dette problemet, men vår erfaring sentrifuger rotorer som godtar mikro vanligvis har roterende grenser under denne terskelen, og blokkene selv kan ikke tolerere mye høyere hastigheter. I hovedsak denne pipettering trinnet krever en kombinasjon av omsorg og fart til å bruke en multi-kanal pipettor å raskt overføre den nødvendige mengden av supernatant fra den dype brønnen blokk til mikro.
Analyser av ekstracellulær enzymaktivitet i vannprøver har hverken behovet for en tørkeperiode og heller ikke sentrifugeringstrinnet, idet sistnevnte fordi både enzym-substrat reaksjon og måling av fluorescensen fra sluttproduktet forekommer i den samme mikroplate. Som sådan er disse enssays er vanligvis raskere, og kan i første omgang synes lettere å kjøre. Men, de har sine egne begrensninger i det, når det er mulig, bør det MUB standard og MUB-koblede substrater ikke utsettes for lys. I vår erfaring, dimming lysene så mye en mulig under pipettering og ruger de mikroplater i mørket (eller dekket med en ugjennomsiktig lokk) er en nødvendighet. Fordi disse assays krever også at platene som skal leses på flere tidspunkter, ofte resulterer dette i behovet for meget hurtig veksling mellom platene ved analysering av flere enzymer samtidig. For eksempel, for å analysen ni vannprøver for aktiviteten av seks enzymer samtidig (dvs. ved hjelp av seks ulike mikroplater), blir det nødvendig å lese en plate hvert 2 min i 1 time for å sikre at hver enkelt plate avleses hvert 10 -15 min (i dette tilfelle, hvert 12. min). Forsiktighet må utvises for å holde styr på den aktuelle plate blir lest, så vel som å sikre at ingen væske er sølt from den plate som den overføres inn i og ut av mikro fluorometer. Når analysere flere enzymer på en gang, er det også viktig å huske på den tiden det tar for mikroplateleser til å faktisk lese plate og å rave lese intervaller tilsvarende. Et siste problem med den fluorescerende assay av ekstracellulær enzymaktivitet i vannprøver er når man arbeider med prøver som er grumset. Vannprøver som inneholder partikler skal ristes før opprinnelig strømme inn pipetten reservoaret og mikset på nytt ved å trekke tilbake og tas ut med pipette før de lastes inn på mikro. Høyere antall partikler i en prøve også vanligvis resulterer i større bråkjøling av det fluorescerende signal, og viktigheten av dempingen kontroller for hver prøve kan ikke understrekes nok.
Mens MUB-og p NP-koblede substrater vanligvis dukker lignende V maks for miljø enzymer, K m verdierkan variere, og enzymer som β-glucosidases og fosfataser kan ha høyere affinitet for MUB-koblede substrater enn sine p NP-linked analoger 14. Derfor MUB-koblede substrater er sannsynlig å være mer sensitive enn de som er knyttet til p NP, noe som tyder på at de ville være et bedre valg å bruke når man måler enzymaktivitet i jord og sedimenter. Men fluorogene sluttprodukt som er målt under MUB analysene er utsatt for potensiell leskende i enkelte jordekstrakter, og fluorescens målingene kan være ustabile over tid 12. Jordsmonn og sedimenter pleier også å ha høyere ekstracellulære enzymaktivitet enn naturlig vann, så den økte følsomheten av fluorometriske MUB-koblede analyser kan tilby litt fordel over de fargemetriske p NP metoder gitt de potensielle problemene med leskende når analysere visse jord. Som en side notat, p NP-koblede substrater og p NP-standarden i seg selv er generelt mer rimegjengelig enn sine MUB kolleger, samt en ekstra begrunnelse for å bruke dersom budsjettmessige begrensninger gjelder.
Kanskje det viktigste aspektet av å være i stand til analysen mikrobiell ekstracellulære enzymaktivitet i akvatiske og terrestriske miljøer er at mens disse teknikkene måle mikrobielle fysiologiske prosesser, disse prosessene har en direkte påvirkning på økosystemnivå transformasjoner av karbon og næringsstoffer. Utbredelsen av organisk materiale dekomponering har vært direkte knyttet til aktiviteten til ekstracellulære cellulaser i sedimenter 18,19, slik at raske målinger av enzymaktiviteten potensielt lette fastsettelse av momentant in situ nedbrytningsrater i miljøprøver. Ved hjelp av høy gjennomstrømming mikro tilnærminger åpner for samtidig måling av enzymaktivitet i større antall prøver enn mer typiske enkelt tube tilnærminger, slik at variasjon i enzymaktivitet (og i forlengelsen i økosystem nivå prosesser) i response til faktorer som dybde 20 eller miljømessige forstyrrelsene 9,21 kan bli undersøkt. Tilsvarende analyser av enzymer involvert i næringssyklus, slik som fosfatase og Nagase, kan gi innsikt i næringsbegrensning i bestemte omgivelser, for eksempel, den relative betydningen av organisk fosfor og organisk nitrogen i løpet av jord utvikling 8..
Fordi enzymaktivitet har blitt målt i miljøprøver i over tretti år, er sammenligninger mellom studier ved hjelp av avanserte meta-analyser nå blitt mulig. Slike studier tyder på at, på global skala, enzym aktivitet, og derfor priser av organisk materiale nedbrytning og næringsmineralisering, er knyttet til pH, substrat tilgjengelighet, og nærings støkiometri 17. Samtidig, har bruken av en mikroplate-basert protokoll startet for å tillate analyse av fine skala mønstre på enzymaktivitet ved hjelp av geostatistiske kartleggingsteknikker 22
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Finansiering for deler av dette arbeidet ble gitt av ulike kilder, inkludert United States Department of Agriculture Spesifikk samarbeidsavtale 58-6408-1-595 og National Science Foundation (award 1049911).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers | ||
References
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
- Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
- Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
- Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
- Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
- Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
- Hoppe, H. -G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
- Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
- Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
- Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
- Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
- Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
- Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
- Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).
