Summary
Mikroplaka dayalı işlemler hücre dışı enzim aktivitesi, kolorimetrik veya florometrik analizi için tarif edilmiştir. Bu işlemler yönetilebilir bir süre içinde çevre örneklerin çok sayıda bu tür aktivitenin hızlı analizi için izin verir.
Abstract
Doğal ortamlarında besin döngüsü ve karbon işleme çok mikroorganizmaların serbest hücre dışı enzimlerin aktivitesi ile gerçekleşir. Bu nedenle, bu hücre dışı enzimlerin aktivitesinin ölçülmesi gibi organik madde ayrışma ya da azot ve fosfor gibi mineralizasyon ekosistem seviyesi süreçlerin oranları içine bakış açısı verebilir. Çevresel numunelerde hücre dışı enzim aktivitesi deneyleri, genellikle, yapay kolorimetrik veya florometrik substratlara örnekleri maruz bırakılması ve substrat hidroliz hızı izleme içerir. Burada kısa bir süre içinde örnekleri çok sayıda analizine izin bu işlemler için mikrolevha tabanlı yöntemleri açıklanmaktadır. Örnekler mikro blok mikro ya da derin kuyu 96 oyuklu içinde yapay alt-tabakalar ile reaksiyona girmesine izin verilir ve enzim aktivitesi, daha sonra, tipik bir mikro-Reade kullanılarak elde edilen son ürünün emilim veya floresan ile belirlenirr veya florimetre. Bu gibi yüksek üretim işlemleri uzaysal olarak ayrı bölgelerde veya ekosistemlerin arasında karşılaştırma sağlamak değil, aynı zamanda esasen genel olarak, numune başına gerekli reaktif hacimlerini azaltarak Bu tahlillerin maliyetini azaltmak değil.
Introduction
Bakteri ve mantar gibi mikroorganizmaların hücre dışı enzimlerin üretimi ile kompleks organik bileşiklerin besin ve karbon elde edilir. Bu enzimler, tipik olarak hücre içine alınabilir daha küçük alt-birimler halinde polimerler hidrolize. Bu nedenle, ekolojik bir seviyede, bu mikrobiyal hücre dışı enzimler besin mineralizasyonu ve doğal ortamlarında olarak ortaya çıkan organik madde ayrışımı daha sorumludur. Bu tür sellobiyohidrolaz (CBH) ve β-glukosidaz gibi enzimler mikrobiyal alımı ve asimilasyonu için kullanılabilen bir karbon taban malzeme oluşturur 1,2 Selülozun glukoza hidroliz, katalize etmek için uyum içinde selüloz bozulması ve çalışmaları için önemlidir. Enzim fosfataz organofosfatlar çözünür inorganik fosfat gruplarını, esas olarak fosfat mineralleştirici ve en çok 3 organizmalar ile kullanım için uygun hale serbest bırakır. Örneğin N-acetylglucosaminidase (Nagase) gibi diğer enzimler, importan vardırkitin bozulması t karbon ve mikrobiyal edinimi 4 için kullanılabilir hem de azot yapabilirsiniz.
Doğal ortamlarında mikrobiyal hücre dışı enzim etkinliğinin test edilmesi için prosedürlerin bir yapay p-nitrofenil (p NP) bağlanmış alt-tabakalar, orjinal toprak fosfataz aktivitesi 5 tespit etmek için geliştirilmiş bir yaklaşım kullanılmasıdır. Bu yaklaşım yapay alt-tabaka, uygun bir enzim ile hidrolize edildiğinde serbest renkli bir son ürün, p-nitrofenol, tespit dayanır. P-nitrofenol, daha sonra yaklaşık 400-410 nm'de absorbans ölçümü ile kolorimetrik tayin edilebilir. Bu yöntem, bu yana böyle Nagase 6 gibi diğer enzimleri tespit etmek için uygulanmıştır ve toprak ve sediment 7-9 mikrobik hücre dışı enzim aktivitesi şu an çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır.
Orjinal oldu alternatif bir yaklaşımy 10,11 4-metilumbelliferon (MUB) bağlanmış alt-tabakaların kullanan su ortamlarında hücre dışı glukosidaz aktivitesini değerlendirmek için geliştirilmiştir. (4-metilumbelliferon) serbest son ürün yüksek floresan ve 360/460 nm civarında bir uyarım / emisyon ayarına sahip bir flüorometre kullanılarak tespit edilebilir. MUB bağlanmış yapay alt-tabakalar arasında çeşitli p NP-kolorimetrik alt-tabaka prosedürü kullanılarak analiz edilebilir olarak en az bir çok enzim (örneğin, β-glukosidaz, selobiyohidrolaz, Nagase, fosfataz) aktivitesinin fluorometrik ölçümü olanak mevcuttur. Örneğin protein-bozucu lösin aminopeptidaz gibi diğer mikrobik hücre dışı enzimler, 7-amino-4-metilkumarin (COU) bağlanmış alt-tabakalar kullanılarak florometrik olarak analiz edilebilir. MUB-ve çiftler bağlanmış alt tabakalar hem de çeşitli karasal ve su örnekler 12,13 enzim aktivitesini belirlemek için kullanılmıştır.
Önceki çalışmalar descri varkenIBED florometrik ya da kolorimetrik mikro hücre dışı enzim aktivitesi 14 belirlemek için yaklaşımlar, bu tür testleri yapmak için nasıl açık bir bakış açısı için bir ihtiyaç vardır. Burada kolorimetrik p NP-bağlanmış alt-tabakalar yaklaşım kullanılarak topraklar ve sediment ve floresan MUB-bağlanmış alt-tabakalar tekniği kullanılarak, doğal sularda, hücre dışı enzim aktivitesinin analizi için yüksek verimli mikro teknikleri yapılması için işlemleri göstermektedir. Bu enzimler, sırasıyla, karbon, azot, fosfor ve bisiklet bağlı olabilir olarak biz β-glukosidaz, Nagase ve fosfataz etkinliklerinin ölçümü odaklanır. Bununla birlikte, burada açıklanan usuller farklı yapay substratlar kullanılarak diğer hücre dışı enzimler ölçümüne uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Topraklar ve tortulları Ektraselüler Enzim Aktivitesi kolorimetik Analizi
1.. Enzim Aktivitesi Colorimetric Analizleri İçin Yüzey ve Tampon Çözümleri hazırlanması
- 50 ml 0.1 M asetik asit (2.87 ml su içinde 500 ml buzlu asetik asit) karıştırılarak 50 mM asetat tampon (pH 5,0-5,5) hazırlanması 150 ml 0.1 M sodyum asetat ve 200 ml damıtık H2O Gerekirse 0.1 M asetik asit ile 5,0-5,5 'ye ayarlayın.
- Damıtık H2O içinde 1 M sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi hazırlayın
- 50 mM asetat tamponu içinde p NP-bağlanmış alt tabaka çözelti hazırlayın. Fosfataz, 50 mM asetat tamponu içinde 5 mM p NP-fosfat hazırlanması test etmek için, β-glukosidaz 5 mM p NP-β-glukopiranosid hazırlamak tahlil için Nagase 2 mM PNP-β-N-asetilglukosaminid hazırlamak için tahlil. Steril 15 ml veya 50 ml santrifüj tüplerine tüm alt-tabaka solüsyonları hazırlayın. Solutions 2-3 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
2. P NP Konsantrasyon Absorbans dönüştürme bir Standardının Belirlenmesi
- 50 mM asetat tamponu içerisinde p-nitrofenol standart çözeltiler hazırlayın. Konsantrasyonlar mM 0,025-1 arasında olmalıdır.
- Açık bir 96 çukurlu mikrolevhanın her transfer konsantrasyonunun 100 ul üç çoğaltır. Her bir oyuğa, H 2 O damıtılmış 10 ul 1 M NaOH ve 190 ul ekleyin.
- Bir mikrolevha okuyucu kullanılarak 410 nm'de absorbansı.
- 0.3 ile standart eğri Çarp konsantrasyonları 300 ul reaksiyon hacmi başına umol p NP olsun. P NP umol emmeye karşı bir eğri çizilir. Eğrinin eğimi her bir Enzim reaksiyonu p NP umol absorbans ilgili olacaktır dönüşüm faktörü (C) olarak hizmet vermektedir.
3. Enzim Testi yürütmek
- Toprak, bir concentr bir steril 15 ml santrifüj tüpüne test edilecek her numunenin bir bulamaç hazırlamakyaklaşık olarak 1 g / ml -1 50 mM asetat tamponu kullanarak ation. Sediment için, bulamaç kolayca pipettable yapmak için yeterli asetat tamponu ilave edin. Gerekli bulamacın tam hacmi, enzimlerin tahlil sayısına göre değişir, fakat 5 ml 'lik bir minimum tavsiye edilir. Vortex toprak veya tortu her kümeleri dağılana ve nihai hacim dikkat kadar, her bulamaç.
- Yeniden girdap her bulamaç ve hemen, 96-çukurlu derin kuyu blok (Şekil 1) üzerine, altı kuyu her birine 150 ul pipetle. Bu süspansiyon içinde kir partikülleri tutmak için iyice ve sık sık girdap önemlidir. Bir alt-tabaka bir kontrol olarak hizmet etmek için boş blok başına en az iki kuyu bırakın. Not: Toprak çamurlar ipuçları tıkama eğilimi olarak önce pipetle için makas ile pipet ipuçları ucunu klibi. Denenecek her bir enzim için, bir 96-yuvalı blok hazırlayın.
- Bir pipet rezervuar içine asetat tamponu, yaklaşık 5 ml dökün ve l için 150 ul tampon eklemek için bir 8 kanallı pipet kullanınast Her numunenin iki kuyu (bu örnek tamponu kontroller olacaktır) ve iki alt-tabaka kontrol havuzlarını (Şekil 1)
- Bir pipet rezervuara uygun p NP-alt-tabaka çözeltisi, yaklaşık 10 ml dökün ve (Şekil 1) her bir numune ilk dört kuyu ve iki alt-tabaka kontrol kuyuları için alt-tabaka çözeltisi 150 ul eklemek için bir 8 kanallı pipet kullanın. Reaksiyon kısa zamanda substrat çözeltisi ilave edilir olarak başlar olarak zaman unutmayın.
- 0.5-4 saat boyunca oda sıcaklığında (22 ° C) inkübe edin. Tam Kuluçka süresi aktivitesi örneklerde seviyesi ve analiz edilecek enzim bağlı olarak değişir. Nagase ve diğer enzimler> 2 saat inkübasyon süresi gerektirir, oysa en toprak ve tortular için, fosfataz ve β-glukosidaz, 0.5-1.5 saat arasında bir bekleme süresi gerektirir.
- Deneyleri absorbansı okumak için mikroplakalarda net 96-iyi hazırlamak kuluçka iken. (Örneğin, her bir E için her bir blok için bir derin bölmeli mikroplaka hazırlanmasınzyme) deneye tabi tutuldu. Pipet 10 ul 1 M NaOH ile mikrolevhanın her oyuğuna damıtılmış su 190 ul. Not: NaOH enzimatik reaksiyonu yavaşlatır ve reaksiyon sırasında ortaya çıkan p NP rengini artırır pH yükseltir.
- İnkübasyondan sonra, kir partikülleri peletleştirmek için 5 dakika boyunca 2,000-5,000 xg'de 96 oyuklu blok santrifüj.
- Pelet önlemek için dikkatli olmak, her bir kuyunun 100 ul çekilme için bir çok kanallı pipet kullanın, ve hazırlanan açık 96-kuyu mikrolevhadaki iyi gelen transfer.
- Mikrotabak okuyucu açın ve gerekli yazılımları kurmak. 410 nm'de absorbansı. Belirli bir oyuk absorbansı, plaka okuyucusu doğrusal saptama sınırının üzerinde, su ve yeniden ölçüyle ki kuyu 1:01 seyreltin edin. Absorbans hala çok yüksek ise, deney daha kısa bir kuluçka süresi ile tekrar edilmelidir.
4. Numune kuru kütlesinin belirlenmesi
- Her sampl pipetle 1 ml önceden tartılmış bir alüminyum tava içine e bulamaç.
- 48 saat için bir 75 ° C kurutma fırınında kurutulur ve tartılır. Bulamacın 1 ml toprak ve tortu kuru kütlesi elde etmek için bu değerden tencerenin ağırlığını çıkarın. Enzim deneyinde de her bir göze ilave 150 ul numune kuru kütlesi belirlemek için 0.15 'lik bir faktör ile çarpın.
5. Kuru Toprak Kitle veya Sedimentin başına Enzim Aktivitesi hesaplama
- Numune deney emiliminden numune kontrol absorbansı çıkartılmasıyla her numunenin absorbansı son hesaplayın. Alt-tabaka kontrol yüksek absorbans varsa (yaklaşık> 0.060), daha sonra da bu çıkarın.
- Umol hr -1 g kuru kütle -1 denklemden enzim aktivitesi hesaplayın:
Enzim aktivitesi, son emme / (C x inkübasyon süresi x numune kuru kütle)
Doğal Sularda Ektraselüler Enzim Aktivitesi Floresan Analizi
Enzim Aktivitesi Florimetrik Analizleri için tle "> 1. Yüzey, Standard Hazırlama ve Tampon Çözümleri- Steril ve fizyolojik olarak uygun bir alt-tabakanın eritilerek MUB bağlanmış alt-tabakalar (örneğin, 4-MUB-β-glukopiranosid, 4-MUB-fosfat, 4-MUB-N-asetil-β-D-glükozaminit) 200 uM solüsyonları hazırlayın (otoklav) damıtılmış steril 15 ml veya 50 ml santrifüj tüplerine H2O. Işık dahil değildir ve kullanım öncesinde buzdolabı içinde depolamak için bir alüminyum folyo içinde tüpler sarın. Bu şekilde depolandığında Elyaf en azından 1 hafta için kararlı olmalıdır.
- Steril damıtılmış H2O içinde 100 uM 4-metilumbelliferon 'lik bir stok solüsyonu yaparak MUB standardı hazırlayın Mağaza kehribar veya folyo sarılı şişede buzdolabında. Kullanılmadan hemen önce, enzim tahlilleri için 10 uM çalışan bir solüsyonun hazırlanması için steril, H2O içine 1/10 ile 100 uM stok solüsyonu seyreltik.
- NaHCO <8.4 g çözülerek 100 mM bikarbonat tamponu içinde bir stok çözelti hazırlayınsub> 3 1 LH 2 O ve otoklav içine. Enzim deneyleri için 5 mM bir çalışma çözeltisi oluşturmak için gerekli gibi steril H2O içine bu stok solüsyonu 1/20 seyreltin.
2. 96-Well siyah bir mikroplakanın ilgili düzenleme Su Örnekleri
- Şekil 2'de gösterilen örnekte, aşağıdaki her bir enzim için bir mikrotabla düzenleyin. Yeterli çoğaltma, standartlar ve kontrol sağlayan, bu işlem, bir 96 oyuklu siyah bir mikroplakanın üzerinde dokuz su örnekleri için, tek bir enzimin aktivitesini tahlil unutmayın.
- Bir pipet rezervuar içine ilk numunenin yaklaşık olarak 5 ml dökün ve mikro-(ler) in ve sütun 1 içindeki bütün gözlere içine ul pipette200 için bir 8 kanallı pipet kullanın. Kullanılmış pipet ipuçları atın ve sütunları 1-9 doldurmak için her su numunesi için gerektiği gibi tekrarlayın.
3. Örnek kurma, Standart, Söndürme ve Yüzey Kontrolleri
- Standart numuneler, hesaba kontrolleri ayarlayıns, alt-tabaka ve numuneler ile aynı siyah bir mikroplakanın (Şekil 2) üzerinde su verme.
- Örnek kontrol numunesi, su ve bikarbonat tampon içeren ve aktivite hesaplamalarda kullanılan değil, deney süresi boyunca tutarlılık okuma gösterecektir. Söndürme kontrol numunesi, su ve floresan etiket standart bir miktarı oluşur ve numune su içinde floresans kırınım ölçmek için kullanılır. Alt-tabaka ve alt-tabaka, standart kontrol-bağlanmış ya da standart floresan etiket, sırasıyla, ve bikarbonat ya da tampon maddesi oluşur.
- Temiz bir pipet rezervuar içine 5 mM bikarbonat tamponu içinde yaklaşık olarak 5 ml dökün. Pipet mikro kuyulara tampon maddesi 50 ul 1 satırlar 9 arasındaki D ve E, iki örnek başına numune kontrol kuyuları çoğaltmak oluştururlar. Değişim pipet uçları o satırlar 10 ile 12 kuyu bikarbonat tampon 200 ul transfer A ve H.
- Li karartma veya kapatarak ortam ışıklarını azaltınFloresan standart olarak ghts ışığa karşı hassastır.
- Temiz bir pipet rezervuara 10 uM 4-metilumbelliferon yaklaşık olarak 5 ml dökün. Pipet mikro kuyulara 50 ul Row H 1 ile 12 arasındaki ve kuyulara satırlar G ve F olarak 1 ile 9 arasındaki bir örnek için söndürme kontrol ve genel olarak standart üç kontrol çoğaltır oluştururlar. Karanlıkta mikroplağı koymayın veya Mub ışık bozulmasını azaltmak için opak kapak ile kapatın ya.
- Florometrede açın ve set-up tabakayı eklemeden önce okumaya hazır olması için gerekli yazılımları. Not: Bazı florimetre ampuller 3 dakika veya daha fazla bir ısınma süresi gerekebilir.
- Temiz bir pipet rezervuarına uygun MUB bağlanmış alt-tabaka (örneğin, 4-MUB-fosfat) yaklaşık 5 ml dökün. Her numune için üç suret tahlilleri alt-tabaka ve üç kontrol oluşturmak üzere 1 satırlar B ve C, 1 ile 9 Sıra A 12 ile mikro kuyulara 50 ul pipet ve kuyu içine bir 12 kanallı bir pipet kullanın. Immediately 4.1, kayıt floresan adıma geçin.
4. Kayıt Floresan
- Hemen mikroplakaya ilave edilmesinden sonra alt-tabaka ilk floresans okunur. Floresan okuduktan sonra, ya oda sıcaklığında (22 ° C) de inkübe mikroplak koyu veya MUB ışık bozulmasını azaltmak için bir opak bir kapak ile kapatıldı.
- Bir su numune içinde maksimum potansiyel enzim aktivitesini ölçmek için gerekli olan kuluçka süresi numune içindeki enzim konsantrasyonuna bağlı olacaktır. Tahlil tamamlanmadan önce bu bilinmeyen olduğu için, mikro birden fazla zaman adım okunmak üzere olacaktır. Belirli enzimler için çok yüksek bir aktiviteye sahip numuneler, 10 dakika önce, tepe olsa da tipik olarak, 1 saat boyunca 10-15 dakika aralıklarla okuma, birçok enzim için kabul edilebilir.
- En az 1 saat süre ile belirlenen aralıklarla mikrotablada floresan okuma. Mikrolevha kapalı tutmak için emin veya okuma arasındaki karanlıkta oluns.
5. Su hacmi başına Enzim Aktivitesi hesaplama
- Ilk numune floresan (kuyu D ve E), ortalama ortalama son numune floresan (kuyular AC), ortalama standart floresan (kuyu H10-11), ve ortalama kontrol floresan söndürülmesi (kuyu: Her bir zaman aralığı her bir numune için hesaplanır FG).
- Her bir zaman aralığı için, nmol saat enzim aktivitesinin hesaplanması -1 mi -1 denklemle:
Enzim aktivite = (örnek floresan demek - ilk örnek floresan ortalama) / (() hr zaman (x) 0.2 ml (standart floresan) x ortalama / kontrol floresan gidermek ortalama (standart floresan / 0.5 mol) x ortalama)
- Her zaman adımı için hesaplanan etkinlik değerleri inceleyin. En yüksek etkinliği olan zaman aşama son potansiyel aktiviteyi belirlemek. Etkinlik değerleri artmaya devam ederse daha sonra zaman adımları gerekli olabilir; aktivite değerleri Throug düşersemhout çalıştırmak tabii ki, o kısa zaman adımlarla yeniden çalıştırın. Final aktivite tabaka tüketilen saat -1 -1 ml nmol'ü olduğunu ancak saat -1 L -1 umol olarak ifade kadar ölçeklendirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Topraklar ve su çökeltiler genellikle bağlı mikrobiyal toplulukları (biyofilm) parçacıkların yüzeyi üzerinde artan bir sonucu olarak, hücre dışı enzim etkinliğinin kayda değer bir düzeyde vardır., Bu etkinliği, bir üçüncü yüzey tortu elde edilen partikül büyüklüğüne bağlı olarak değişir kadar 3: Şekil kuzey Mississippi, ABD'de sipariş akışı. Bir önceki çalışmada bu akımdan tortu partikülleri üzerinde bakteri topluluklarının kendi toplum yapısının moleküler analizine göre üç ayrı gruba ayrılabilir göstermiştir: 0.063 mm parçacıklar, 0.125 üzerinde olanlar, 0.25 ve 0.5 mm parçacıklar üzerinde olanlar, ve bu 1 15 mm parçacıklar. Hücre dışı enzim aktivitesinin kalıpların analizi bu sonucu desteklemektedir; fosfataz (Şekil 3A) ile, 0.125, 0.25 ve 0.5 mm parçacıklar üzerinde benzer olan, ancak p NP-bağlanmış tabaka tekniği ile ölçüldüğünde, 1 ve 0,063 mm fraksiyonları üzerinde çok daha yüksek. Oörneğin β-glukosidaz (Şekil 3B) ve Nagase (Şekil 3C) ve orada enzimler, en iyi parçacıkları üzerinde benzer tepe gösterir, ancak, farklı enzimler farklı çevre dağılımları gösterebilir ve bu gibi olabilir, dikkat çeken, 1 mm parçacıkları üzerinde artmamıştır Bu tahlil kullanılarak açıklanacaktır. Nispeten düşük bir hata çubukları, farklı çevre örnekleri karşılaştırırken sediment enzim aktivitesinin kolorimetrik tahlilleri, yeniden üretilebilir ve istatistiksel analize müsaittirler olduğunu göstermektedir.
Doğal sular topraklar veya sedimanlar g başına yapmak daha ml başına daha düşük hücre dışı enzim aktivitesine sahip olma eğilimindedir. Bu nedenle, bu MUB-bağlı substratlar kullanılarak florometrik olarak test edilmelidir. Enzimler fosfataz (Şekil 4A) aktivitesi, β-glukosidaz (Şekil 4B) ve Nagase (Şekil 4C) sığ bir gölde derinliği ile nasıl değiştiğini gösterir Şekil 4 kuzey Mississippi, ABDA. lake (Boondoggle Lake) fosfataz (Şekil 4A), nispeten yüksek bir aktivite ile önerilmektedir besin zayıf 16, mikroorganizmaların, organik bileşiklerden fosfat elde etmek amacıyla üretmek bir enzim olarak bilinir. Aktivitesi 100 cm örneğinde yükseltilmiş iken tahlil enzimlerin her üç için, su yüzeyinin (0 cm) ve 50 cm derinlik toplanan numuneler, benzer bir etki göstermiştir. Bu örnek, esas olarak suda tortu arabiriminden alınmış ve numune içinde tortu parçacıkların mevcudiyeti muhtemel özellikle β-glukosidaz ve Nagase için, bu örnekte görülen daha yüksek aktivite için hesap edildi. P NP alt-tabakalar ile olduğu gibi, düşük hata çubukları da sadece üç suret okumaları, MUB substratlar kullanılarak fluorometrik tahliller tekrarlanabilirliği yüksek olduğunu göstermektedir.
Şekil 4, Şekil 3 tane için olanlar ise tüketilen substratın nmol'e içinde olduğuna dikkatbirim başına boyutu (mi başına veya g ya da per) benzer olsa da, alt-tabakanın tüketilen umol içindedir. Bu toprak ve çökeltiler doğal sularda daha yüksek hücre dışı bir aktivite gösterdi (Şekil 3 'de her bir özel enzim faaliyetlerinin yaklaşık olarak Şekil 4'te eşdeğer enzimin faaliyetlerine göre 10-100x daha yüksek) sahip olma eğilimi olduğunu vurgulamaktadır. Ayrıca MUB bağlanmış alt-tabaka tekniği ve su örneklerinde hücre dışı enzim faaliyetini incelemek için bu tekniği kullanarak gerekliliği artan etkisi gösterilmektedir.
Şekil 1. Kolorimetrik p NP-bağlanmış s kullanarak lekeleri ve tortu hücre dışı enzim aktivitesinin analizi için 96-iyice derin sağlam blok için önerilen düzeniubstrate tekniği. her biri iyi bir örnek çalışma, örnek kontrol ya da alt-tabaka kontrolü olup olmadığına bağlı olarak örnek harç, alt-tabaka çözeltisi, veya asetat tamponu oluşan 300 ul bir toplam almak gerekir.
Şekil 2. Fluorometrik MUB-bağlanmış tabaka tekniği kullanılarak su örneklerinde hücre dışı enzim aktivitesinin analizi için mikro 96 oyuklu siyah önerilen düzeni. Dokuz numuneler plaka (A) sekiz kuyu kaplayan her biri dikey olarak düzenlenebilir. Bu sekiz kuyular örnek çalışması, numune kontrolleri için kullanılan ve kalan kuyuları yüzey kontrolleri ve MUB standartlarına (B) için kullanılır ise kontrolleri gidermek edilir.
Şekil 3,. Kuzeyinde Mississippi, ABD'de küçük bir akım toplanan yüzey tortu parçacıkların farklı boyutlarda Hücre dışı enzim aktivitesi. Her bir partikül boyutu fraksiyonu fosfataz (A), β-glukosidaz (B) 'nin aktivitesi için tahlil, Nagase ve (C) takip ediyordu p NP-kolorimetrik alt-tabaka prosedür. Etkinlik tortu -1 umol alt-tabaka tüketilen saat -1 g kuru kütle bildirilmiştir ve parçacık büyüklüğü fraksiyonu başına üç suret okumanın ortalama (+ SE) 'dir.
Şekil 4. Üç dif alındığı su içinde hücre dışı enzim aktivitesiferent derinlikleri (0, 50, ve 100 cm) kuzey Mississippi sığ göl, ABD. su fosfataz (A), β-glukosidaz (B) 'nin aktivitesi için tahlil, Nagase ve (C)-alt-tabakanın MUB takip ediyordu florometrik prosedürü. Etkinlik su -1 nmol alt-tabaka tüketilen h -1 ml bildirilmiştir ve örnek başına üç suret okumanın ortalama (+ SE) 'dir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toprak ve tortular mikrobiyal hücre dışı enzimlerin çeşitli aktivitesini belirlemede besin mineralizasyon ve organik madde işleme 17 oranlarında yararlı açılımlar sağlayabilir. Ancak, toprak kendi nem düzeyleri değişebilir, bu nedenle toprak kuru ağırlık aktivitesi standart önemlidir. Bu sadece enzim aktivitesinin ölçülmesi dışında (tipik haliyle iki gün) ek bir kuruma adımı gerektirir. Bu nedenle, ani sonuçlar yakın sağlamak su örneklerdeki enzim aktivitesi deneyleri aksine, toprak ve sedimanlarda enzim aktivitesinin güvenilir deneyler, birkaç gün sürebilir. Bazı zeminlerde, hatta kurutma prosedürü ötesinde ek kül adım (500 ° C'de, tipik olarak 2 saat) gerektiren, organik madde veya külsüz kuru kütlesinin gramı başına etkinliği ifade etmek daha uygun olabilir. Ne olursa olsun, toprak ya da çökelti enzim aktivitesi, kolorimetrik deneyinde en kritik adım kuyulu blok f gelen süpernatan kesilmesidirİnkübasyon süresinin sonunda, santrifüj ollowing. Bu prosedür absorbans ölçülerek dayanır, çünkü son mikrotablada birkaç sokak toprak parçacıklarının varlığı bile sahte sonuçlara yol açabilir. Yükseköğretim santrifüj hızları (> 5,000 xg) bu sorunu azaltmaya yardımcı, ama mikroplakalar kabul bizim deneyim santrifüj rotor genellikle bu eşiğin altına dönme sınırları var, ve bloklar kendilerini çok daha yüksek hızlarda tahammül olmayabilir olabilir. Aslında, bu özel pipetleme adımı hızla mikroplaka için kuyulu bloktan süpernatan gerekli miktarı aktarmak için bir çok kanallı bir pipet kullanın için bakım ve hızının bir arada gerektirmektedir.
Enzim-substrat reaksiyonu ve son ürünün floresans ölçümleri, her iki aynı mikro-ortaya çıkabilmesi nedeniyle su örneklerinde hücre dışı enzim aktivitesi deneyleri, bir kuruma süresi ihtiyacını ne de santrifüj adımı, ikincisi de sahiptir. Gibi, bu a gibissays genellikle daha hızlı ve başlangıçta çalıştırmak için kolay görünebilir. Ancak, mümkün, MUB standart ve MUB bağlantılı yüzeyler ışığına maruz kalmamalı, o kendi sınırlamaları vardır. Bizim tecrübelerimize göre, pipetleme sırasında olduğu kadar bir olası ışıkları karartma ve karanlık (ya da opak bir kapak ile örtülü) olarak mikroplakalara kuluçka bir zorunluluktur. Bu deneyler, aynı zamanda birden fazla zaman noktalarında okunacak plakaları gerekli olduğundan, aynı anda birden fazla enzimler tahlil zaman, bu genellikle levhalar arasında çok hızlı bir geçiş için ihtiyacı ile sonuçlanır. Örneğin, aynı zamanda (örneğin, altı farklı mikro kullanarak) altı enzim aktivitesi için dokuz numune su tahlil edilmesi için, bu her levha 10, her okunur sağlamak için bir plaka, 1 saat boyunca her 2 dakikada bir okumak için gerekli hale gelir -15 dakika (bu durumda, her 12 dakika). Care okunan özel bir levhanın takip etmek için, hem de hiç bir sıvı ileri geri dökülmüş olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidirBu ve dışına mikro florometre aktarılır olarak plaka m. Kerede birden fazla enzimleri tahlil yaparken, akılda microplaka okuyucusu aslında plaka okuma ve buna göre aralıklarla okuma sendeleyip için geçen zaman tutmak için de önemlidir. Bulanık olan örnekler ile çalışırken su örneklerinde hücre dışı enzim aktivitesi flüoresan deneyi ile son bir husustur. Asılı parçacıkları içeren su numuneleri, pipet rezervuar içine dökülmeden önce çalkalandı ve daha önceki mikroplak üzerine yüklenen için pipet ile çekilerek ve çıkarma ile yeniden karıştırılmalıdır. Bir numunede partikül Daha yüksek sayılar ayrıca tipik floresan sinyali daha fazla su verme ile sonuçlanır, ve her numune için soğutma kontrol önemi yeterli vurguladı olamaz.
MUB-ve p-NP bağlantılı yüzeyler genellikle çevresel enzimler, K m değerleri için benzer V max değerlerini gösterirkenfarklı olabilir ve bu gibi β-glukosidazlar ve fosfatazlar gibi enzimler kendi p NP-bağlantılı analogları 14 daha MUB-bağlanmış alt-tabakalar için daha yüksek bir afiniteye sahip olabilir. Bu nedenle, MUB bağlantılı yüzeyler onlar toprak ve tortular enzim aktivitesini ölçerek kullanmak için daha iyi bir seçim olacağını göstermektedir p NP ile bağlantılı olanlar daha duyarlı olması muhtemeldir. Ancak MUB deneyleri sırasında ölçülür fluorogenik son ürün bazı toprak özleri potansiyel söndürmeye tabidir ve floresan okumaları üzerinde 12 kararsız olabilir. Topraklar ve tortulları da doğal sularda daha yüksek hücre dışı enzim aktiviteye sahip olma eğilimindedir, bu nedenle florometrik MUB bağlantılı tahlillerin artmış duyarlılık belirli toprakları analiz ederken söndürülmesi ile olası sorunları verilen kolorimetrik p NP yöntemlerine göre biraz avantaj sunabilir. Bir yan not, p NP-bağlantılı yüzeylerde ve p NP standart olarak kendisi genellikle daha afforda vardırOnların MUB muadillerine göre ble, onların kullanımı için ek bir neden bütçe kısıtlamaları uygulamak durumunda.
Belki sucul ve karasal ortamlarda mikrobiyal hücre dışı enzim aktivitesini tahlil edememek en önemli yönü bu teknikler mikrobiyal fizyolojik süreçleri ölçmek ise, bu süreçlerin karbon ve besin ekosistem düzeyinde dönüşümler üzerinde doğrudan bir etkiye sahip olmasıdır. Enzim etkinliğinin hızlı ölçümler potansiyel çevre örneklerinde in situ ayrışma oranlarının anlık belirlenmesini kolaylaştırmak ve böylece, organik madde doğrudan ayrışma oranları, tortu 18,19 hücre dışı selülaz aktivitesi ile bağlantılı olmuştur. Yüksek verimli mikro yaklaşımlar kullanılarak daha tipik bir tek tüp yaklaşımlara göre örneklerin daha fazla sayıda enzim aktivitesinin ölçümü için aynı anda izin verir, enzim aktivitesi bu varyasyon kadar (ve ekosistem seviye süreçlerinde uzantısı) respBöyle derinlik 20 veya çevresel tedirginlikler 9,21 gibi faktörlere onse incelenebilir. Benzer şekilde, fosfataz ve Nagase gibi besin bisiklet katılan enzimlerin, deneyler, toprak gelişiminin 8 sırasında organik azot, örneğin, belirli ortamlarda organik fosfor göreli önemini besin sınırlama içgörü sağlayabilir.
Enzim aktiviteleri otuz yıldır çevre örneklerinde ölçülmüştür Çünkü, gelişmiş meta-analizler kullanılarak çalışmalar arasında karşılaştırma artık mümkün hale gelmektedir. Bu tür çalışmalar, organik madde ayrışması ve besin mineralizasyon küresel ölçekte, enzim aktivitesi ve bu nedenle fiyatla, pH, substrat kullanılabilirlik ve besin stoikiometriye 17 bağlı olan, öneririz. Aynı zamanda, bir mikro-tabanlı protokol kullanımı jeoistatistiksel haritalama teknikleri 22 kullanılarak enzim aktivitesi ince ölçekli desen analiz edilmesine izin verir başladı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu işin yönleri için finansman Tarım Amerika Birleşik Devletleri Bölümü Özel Kooperatif Anlaşması 58-6408-1-595 ve Ulusal Bilim Vakfı (ödül 1.049.911) dahil olmak üzere çeşitli kaynaklar tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers | ||
References
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
- Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
- Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
- Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
- Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
- Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
- Hoppe, H. -G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
- Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
- Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
- Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
- Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
- Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
- Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
- Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).
