Summary
此视频文章说明设置，程序，修补细胞组织，以及如何实现动态钳记录整个安装鼠标视网膜神经节细胞的。这种技术允许调查的兴奋性和抑制性突触输入精确的贡献，他们的相对幅度和时机神经扣球。
Abstract
神经节细胞输出的视网膜神经元，他们的活动体现了集成多个突触输入所产生的特定的神经回路。膜片钳技术，在电压钳和电流钳配置，常用来研究神经元的生理特性和表征其突触输入。虽然这些技术的应用是非常翔实，他们带来种种限制。例如，它是难以量化的兴奋性和抑制输入交互操作的精确确定响应输出。为了解决这个问题，我们使用了修改后的电流钳技术，动态钳，也称为电导钳1，2，3，检查的影响兴奋性和抑制性神经元兴奋性突触输入。这种技术需要电流注入到单元格，是依赖于在那个时候，其膜电位的实时反馈。 injecteD电流计算从预定的兴奋性和抑制性突触传导，其反转的潜力和细胞的瞬时膜电位。实验程序的详细信息，说明在这个视频文章膜片钳细胞的动力钳技术，实现了全细胞的结构和就业。这里，我们表明小鼠视网膜神经节细胞的反应的生理实验在控制的条件下或在药物的存在下得到的各种导波形。此外，我们使用人工使用alpha调查反应的细胞的功能产生的兴奋和抑制电导。
Introduction
在视网膜后面的眼睛里，是一个近乎透明的神经组织。许多研究使用视网膜的模型，以探讨视觉处理和突触信号机制的第一步。由于视网膜网络中的整个安装准备解剖后保持不变的，它代表了一个理想的系统研究突触的相互作用，作为其生理反应非常相似， 在体内条件。因此，使用一个孤立的视网膜神经元的特性，可以研究采用膜片钳技术（技术的评论，看到6,9,13）。的识别的确切贡献的具体电路和神经递质的神经节细胞的反应，但是，通常阻碍药理学试剂作用于各种网站。
视网膜神经元的生理反应轻，自然的刺激，可以记录充满了细胞内液与玻璃吸管。使用补丁CL可以记录膜电位的波动（电流钳）或电流（电压钳）放大器技术，神经元对光刺激的反应。通过在不同的电压和实施后验电导分析膜电位，它是未能隔离抑制和兴奋性突触输入5,12。这种类型的实验，可以进行正常沐浴介质中，并在不同的药理剂的存在下，以隔离的贡献不同的神经递质和受体的神经元的反应。从许多实验室的研究特征在于丰富的尖峰输出和兴奋性和抑制输入刺激属性，例如大小，对比度，空间和时间的频率，方向，方位和其他刺激变量的依赖。虽然这些实验方法提供尖峰输出和突触输入功能刺激物业之间的关系的信息，解释特定的细胞类型和细胞的兴奋性突触输入的贡献并不简单。这是由于这样的事实，通常兴奋性和抑制输入随刺激属性，因此，它是无法评估的确切影响，这些输入的变化对神经元扣球。
另一种方法来规避这些限制是开展动态钳记录，这也让个别突触输入输出扣球的贡献的关键评价。动态钳技术允许电流直接注入到单元格，在一个给定的时间依赖于电流注入量的记录，可在那个时候1,2,3（综述见7,14）的膜电位。它是一个修改后的电流钳设置在一个实时记录和下方的单元格的装置，其特征在于，包括专门的硬件，软件之间的相互作用，快速反馈和一台计算机来实现。电流注入到细胞的量的计算。因此，这种方法的优点是可以刺激细胞与电导波形的不同组合，其响应将模仿激活的受体介导的突触输入。例如，注射兴奋性和抑制的一个小点，响应注射兴奋性的一个小点的电导电导响应相比，只提供抑制对细胞响应的影响的信息。同样地，其他的组合生理记录的电导可以共同注入揭示了如何依赖于刺激兴奋性和/或抑制电导的变化会影响尖峰输出。
在我们的研究中，动态钳技术用于演示的相对幅度和时序上的发射性能的视网膜神经节细胞的突触输入的影响。各种电导在控制的条件下或在药理学试剂的存在下得到的生理实验作为输入。此外，人工电导基于阿尔法功能也被用于为了研究如何集成神经元突触输入。因此，这是一个多功能的技术，可以使产生的各种类型的电导生理，药理或计算被注入到相同的神经节细胞，所以这些输入的响应的比较可以。
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Protocol
1。一般设置和组织准备
- 按住鼠标在黑暗中30分钟（旨在减少其压力水平）。在等待时，准备外液1升。首先Milli-Q水半升碳酸氢钠1.9克溶解。通过鼓入95％O 2和5％CO 2，它的pH值保持在7.4。五分钟后，溶解8.8克艾姆斯中等Milli-Q水100毫升，加入碳酸氢钠溶液，Milli-Q水1升，拌匀。保持本方案的carboxygenated实验的其余部分。
- 艾姆斯中carboxygenated 250毫升，并成立了流体灌注系统在电设置。保持解决方案carboxygenated。
- 均匀地涂抹一层薄薄的真空脂灌注室的底部上。密封盖玻片，并确保它是不透气的。取少量润滑脂（〜2毫米的直径），并将其定位在顶部和底端室。这些球将举行电网（铂框架串成的牙线）到位，并防止它在视网膜上按太硬。修复室的平台上，并对齐两个开口。
- 第一异氟醚麻醉，持续2分钟，然后颈椎脱臼处死动物。快速消除眼睛用一双小剪刀（弯叶片），彻底清洗与carboxygenated细胞外液小烧杯中，然后放置在一个充满与carboxygenated细胞外液的培养皿。
- 解剖显微镜下，用19号针头在角膜上的插通孔（〜2 mm从边缘）。重复另一只眼睛。这一重要步骤，应该是迅速允许双方视网膜氧合。删除一个角膜虹膜剪一双小平行切割边缘。接下来，取出一双细镊子的光圈和镜头。重复另一只眼睛。一只眼杯转移到烧杯中含有细胞外液carboxygenated。
- 用手术刀刀片，切到一半，一只眼杯能够扁平化的整个安装，并获得两个全坐骑每视网膜。小心地分离视网膜色素上皮细胞，用钝的解剖探头轻轻拉动它。一旦脱离，视网膜是相当透明的。请注意的是凸面侧的光感受器。的凹面是神经节细胞侧，它可能会粘在粘玻璃体液的存在下。
- 一双细镊子，保持分离的视网膜组织接近的边缘锯齿缘，抢锯齿缘，另一对细镊子，在视网膜的中心向外拉出。这是一个微妙的过程，可能需要几分钟的尝试。如果成功的话，锯齿缘，睫状体和玻璃体液过程去除的，和在视网膜的曲率减小（ 即平坦）。
- 修剪的边缘，然后将其转移到每神经节细胞融合室朝上。保持组织到位，通过放置在网格上的油脂球。将剩余的组织与其他眼杯以供以后使用。视网膜剥离中描述的类似程序，米德尔顿和16普罗蒂Pottek 等 17。
- 录音室安装一个堂堂正正的显微镜下。立即成立的视网膜与carboxygenated细胞外液中（35.5℃）的速率为3 - 5毫升/分钟的连续灌注。确保接地电极地方。
- 连接到显微镜是一种数码相机，允许可视化的组织。整套起来坐在上面的空气表（减震）和一个法拉第笼（块外部静态和非静态电场）内。
- 打开光源（红外，850纳米）和40X的目标，将其集中到神经节细胞的胞体。寻找中心区的整个安装RECOR小丁。
- 解冻冷冻小瓶中K +的细胞内液（300微升，pH值= 7.4）含有（以mM）K-葡糖酸：140，HEPES酸：10，MgCl 2的4.6，ATP-Na的+：4，GTP-钠+ ：0.4和EGTA：10。所有试剂购自Sigma-Aldrich公司。
2。修补视网膜神经节细胞的胞体
- 第一把火擦亮硼硅玻璃毛细管管的两端，然后拉他们两个加热步骤（电阻：5 - 8MΩ）用玻璃微电极拔轮器。
- 加入3微升路西法黄河（终浓度为0.2％），细胞内的解决方案，拌匀，离心。接着，最高的85％的溶液转移到1 ml注射器，将它连接到0.22μm的f ILTER单元，然后到30 G的可重复使用的皮下注射针。冷藏。
- 修复玻璃吸管，用于录音的那些类似的针尖大小，在其持有人，并在显微镜下移动使用micromanipula器。 40X的目标下，慢慢地降低吸移管，直到它使一个小凹坑内界膜的表面上。吸管小心地向前推进，直到它捕获的少量组织，然后将它向上和/或侧身撕了一个小洞，露出神经节细胞的胞体。孔越小，较高的程度的视网膜网络的完整性被保持。如果需要，磺基若丹明101（SR101 0.5 - 1μM）可以被添加到细胞外介质的标签损伤的神经元，通过使用荧光显微镜15。
- 填补了一个干净的吸管8 - 细胞内液的10微升。把它插入到连接到放大器的头阶段的持有人，并确保氯化氯化银电极被淹没。丢弃，如果灰尘和/或气泡/本。
- 打开所有的设备上。我们使用的EPC 8膜片钳放大器实现全细胞记录由PatchMaster控制电压钳CON成形。需要注意的是，也可以用其他的放大器，使在快速模式下的电流钳记录。应用内液和保持正压。选择一个单元格与胞体较大，所以最有可能的，它是一个，而不是一个流离失所的无长突细胞或神经胶质细胞，神经节细胞。慢慢地降下移液管尖，所以使膜的表面上的一个小的凹坑，停止，并释放压力。立即降低保持电位 - 60毫伏。一旦gigaseal（GΩ）和被实现它们之间，轻轻一吸，打破膜实现全细胞膜片钳。本程序是一个细致的步骤，如果过分施加负压，则连接变成漏水，如果太少，膜保持完整。
- 随着时间的推移，荧光黄将填充单元格，允许可视化的细胞的形态。如果稳定的话，这种设置应持续30分钟或更多。
3。神经节细胞的录音使用DYNAMIC型夹
- 首先，在电流 - 电压测试（从 - 75到+35 mV的每10毫伏）使用PatchMaster执行。只有当大的Na +电流（> 1 NA）是目前继续后面的测试。请注意修补流离失所的无长突细胞在罕见的场合，在这种情况下，不会回应列车的动作电位，随后注入电流。
- 打开LabVIEW和执行自定义的书面Neuroakuma程序，然后加载各种电导波形。设置重复次数为8（6 - 8作统计用途）。兴奋性和抑制电导的可逆电位设置在0 - 75毫伏。选择一个配对的兴奋和抑制的电导测试。兴奋电导跟踪（绿色）和抑制电导曲线（红色）将出现在下部面板。
- 转到回PatchMaster，选择电流钳模式，并立即切换放大器“CC +通讯FAST”电流钳模式。此模式允许符合urately遵循快速的膜电位变化。如果保持良好的密封膜之间和吸管，小/无补偿是必要的，否则，记录将不会持续很长时间。在Neuroakuma，按下“记录”按钮。细胞反应（通常是阶段性突发的动作电位， 图1A）将出现在面板上。进入细胞内注入电流低缩放电导第一，如果很少/没有反应观察，以较小的增量增加，直到它产生了强烈的反响。过大的电流注入可以杀死细胞。一旦测试完成后，选择一个新的对的电导波形，重复上述所有对生理和人工电导。注射实时的生理电流（I）的基础上：
I（T）= G EXC（T）×（V M（T） - V EXC）+ G INH（T）×（V M（T） - V INH）
可能是SY电导（G在NS）naptic或人工。兴奋性和抑制性突触传导波形采集从以前的实验进行普罗蒂，马哥孛罗迪，黄，Vonhoff，阮和所罗门（结果未显示）在控制条件下，以不同的视觉刺激和存在河豚毒素（TTX，1微米） 。人工导波形为蓝本使用阿尔法函数。 V M（毫伏）是记录膜电位。 ĝEXC和G INH分别表示兴奋和抑制电导，而V EXC和V INH代表逆转兴奋性和抑制电导潜力。时间吨毫秒。采样率是40千赫。
I S = 0（T /α）E-αT
上面的方程为α的函数（I 0 =最大电流，1 /α=峰值时间（秒-1）的电流）。的上升时间和衰减时间的突触电流，取决于α4。兴奋性电导抑制电导延时是不变的，而进行了修改，降低其延迟相励磁（ 图2D）的发病。
- 录制完成后，仔细收回移液器，所以胞体保持完好。立即固定在4％多聚甲醛固定30分钟，随后由3个10分钟，用0.1M磷酸缓冲液洗涤组织。冷藏及以下的一天或一个星期内进行抗体染色。
4。对路西法黄河填充视网膜神经节细胞的抗体染色
- 抗体染色对路西法黄河充满神经节细胞在室温下（主抗路西法黄河兔IgG（稀释= 1:10000）五天第六天，染色继发的羊抗兔IgG（1:500稀释过夜））。湿摩视网膜荧光保留媒体。盖玻片密封与钉子polish。
- 径使用规格-II的Leica共聚焦显微镜（ 图1B）的共聚焦图像细胞形态的影响。轴突的存在下，使神经节细胞的确认。
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Representative Results
不同来源的神经节细胞的反应的抑制性输入的贡献表现通过应用各种电导波形。这些波形不同的亮度得到的刺激，在正常条件下和在TTX，电压门控Na +通道阻断剂的存在下，仅在一个子集，抑制视网膜中间块动作电位的产生。 图2A示出了有代表性的反应注射兴奋和抑制电导波形记录在刺激反应，在正常情况下在灰色背景上一个小黑点。当电导有一个黑色斑点的大小不同的波形在TTX的存在下，分别注入相同的单元格，只有微弱的反应，观察（ 图2B）。
图2C示出另一个神经节细胞的反应，注射各种对电导波形之间的比例控制的兴奋和抑制电导（G EXC：G INH比：1:0〜1:2）被操纵。的响应的细胞减少，被抑制的程度增加，这是明确的。因此，操纵兴奋和抑制之间的平衡，允许其对神经元的输出进行量化。
我们还测试了兴奋和抑制神经元的反应变化之间的相对时间的效果。 图2D中所示，不同的神经节细胞的反应减少的延迟抑制电导降低，表明响应的强度取决于它的突触输入的定时。
图2。神经节细胞兴奋（绿色痕迹注射）和抑制（红色痕迹）响应电导实验进行了控制条件（A），浴后应用河豚毒素（TTX，B）得到的波形。 （C）响应另一个各种电导波形对神经节细胞兴奋电导（G EXC）和抑制电导（G INH）之间的比率发生了变化，从1:0到1:2。的抑制程度增加，降低细胞的响应。 （D）相同水平的变化抑制发病的激发的神经节细胞的响应。 ΔT表示发病的抑制和兴奋的电导之间的时间差。作为延迟抑制减少，响应吨他细胞变得较弱。 点击这里查看大图
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Discussion
这里，我们表明的使用，动态钳位评估的兴奋和抑制视网膜神经节细胞的输出的比值和相对定时的影响。动态钳利用计算机模拟引入生理记录或人工活体神经元的突触传导到。这种方法提供了一个互动的工具，通过它可以修改和电导注入神经元计算其影响神经元的反应。能够得到电导波形的视觉刺激实验中，用于激活光感受器的控制条件和药理学试剂的存在下在特定的细胞或电路隔离的贡献。注射不同组合的这些电导波形的显示他们的贡献，扣球输出。动态钳记录的使用也使操纵的背景噪声水平，根据不同的光适应的天气下，可能会发生纳秒。此外，电导波形也可以产生突触输入的模型，如α功能，也突触输入电压依赖性（ 即 NMDA受体），以及电压门控离子通道或电耦合的细胞。因此，比较各种条件之间打开了巨大的可能性，了解不同的突触神经元的反应和神经网络的信号处理机制的贡献。这是重要的备注，即使当不同类型的神经节细胞的表达明显不同的电压门控通道的类型和密度，我们发现，突触电导整合的结果是一致的各种细胞类型。因此，类似的兴奋性和抑制电导比和定时的变化反映在响应，虽然尖峰频率，尖峰之间的时间间隔和根据细胞类型（数据未示出）变化的适应性能。
动态钳ove_content“>虽然有许多优点，也有一些固有的局限性的技术（审查，见7），是一个主要的该电导注射苏摩可能不能准确地代表突触介导的受体和通道，是专门分布，因此，沿膜的树枝状突起，和任何非线性的相互作用，可以发生在树突远端注射部位的电导，可以模拟仅约为动态钳虽然成功地应用到锥体细胞的树突做四倍全细胞记录8，神经节细胞的树突状形态的复杂过程做树突状录音的突触的空间分布。排除了逼真的模拟，这里介绍的方法使用自体细胞电压钳实验，也依赖于一个点源电极电导波形计算假设之间的非线性相互作用令人振奋atory和抑制性输入，在社会上被广泛接受的假设。因此，这些研究提供整合神经突触电导水平的胞体和轴突岗变化的影响的重大信息。我们的实验并不进行复制，在神经节细胞树突招聘电压门控的电导的生理反应。然而，这也可以通过修改模型方程，使注入的电流包括树突状电导和电缆的影响的基础上的多隔室模型（7中所描述的）来实现。
另一个限制是，修改神经元的反应活性依赖的变化，在膜通道或受体的激活引起的细胞内钙离子或第二信使的变动， 即不被再现，在这些动态钳记录。虽然我们的模型不处理该级别的复杂性，这可能是S涉及钙池和钙离子内流，这个池的实时根据记录神经元上的电压波动模拟一些细胞类型pecific，已成功实施了10。
即使为10 kHz的采样率，准确地跟随动作电位的时间过程，我们的录音，而不是使用的采样速率为40 kHz。这种更高的采样率是必需的，以维持稳定的系统中，并允许现实的和高度精确的记录（综述见11）。
这里所描述的实验方法不需要保持暗适应视网膜。电导暗适应视网膜在生理条件下，从得到的波形被用来计算电流被注入到细胞中，以这种方式，注入的电流与光模仿生理刺激。尽管如此，仍然可以保持组织的暗适应，因此，可以为c将响应ompare电导注入光刺激。在这种情况下，神经节细胞的生理特性（响应极性， 即 ON，OFF或ON-OFF，空间和时间的频率灵敏度，方向选择性等）可以被分类的各种电导波形的应用程序之前，以评估是否注射从一个特定的细胞类型中的电导有不同的效果，这取决于它们所应用到的信元类型。
总体而言，我们认为，动力钳是一种非常强大的技术之间的相互作用，兴奋性和抑制性突触输入，产生神经元的输出，有助于揭示神经元放电的作用，在不同的电压门控电导以及测试假设突触机制。在视网膜这种技术的应用是特别有用的，因为几种类型的神经节细胞的突触输入到已经彻底表征d由于生理刺激的函数。同样，这种方法可以提供洞察在其他领域的中枢神经系统的神经回路的功能。
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Disclosures
所有的程序首先由悉尼大学动物护理伦理委员会批准，然后按照澳大利亚守则的护理和使用动物用于科学目的的指引（澳大利亚国家卫生和医学研究理事会进行）。
Acknowledgments
这项工作是支持的澳大利亚研究理事会（ARC DP0988227）和生物医学研究计划资助的生物医学科学学科，悉尼大学。设备膜片钳放大器是由EPC 8的启动资金从悉尼大学生物医学科学学科。从Rebecca L.库珀从悉尼大学生物医学科学学科的基础和启动基金的资金购买设备InstruTech产品立8 +8的数据采集系统。我们想感谢匿名审稿人，他们有见地的建议和意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Micr–lectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation | ||
References
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