Implementering Dynamic Clamp med Synaptic og kunstig conductances i mus retinal ganglion celler

Summary

Denne videoen artikkelen illustrerer de set-up, prosedyrene for å lappe celle organer og hvordan å implementere dynamiske klemme opptak fra ganglion celler i hel-mount mus retinae. Denne teknikken gjør etterforskningen av den nøyaktige bidraget av eksitatoriske og hemmende synaptiske innganger, og deres relative størrelse og timing til neuronal skyter.

Abstract

Ganglieceller er utgangs-nevroner i retina og deres aktivitet reflekterer integrasjon av flere synaptiske innganger som oppstår fra bestemte neurale kretser. Patch clamp teknikker, i spenning klemme og nåværende klemme konfigurasjoner, blir ofte brukt til å studere de fysiologiske egenskapene til nerveceller og å karakterisere sine synaptiske innganger. Selv om anvendelsen av disse teknikkene er svært informativ, utgjør de ulike begrensninger. For eksempel er det vanskelig å kvantifisere hvor de nøyaktige interaksjoner av stimulerende og hemmende innganger bestemme responsen utgang. For å løse dette problemet, har vi brukt en modifisert strømtangsett teknikk, dynamisk klemme, også kalt ledningsevne ^{en klemme, 2, 3} og undersøkt effekten av eksitatoriske og hemmende synaptiske innganger på neuronal oppstemthet. Denne teknikken krever innsprøyting av strøm inn i cellen, og er avhengig av den sanntids tilbakemelding av dens membran potensial på det tidspunktet. Den injected strøm er beregnet ut fra forhåndsbestemte eksitatoriske og hemmende synaptiske conductances, deres reversering potensialer og cellens momentant membran potensial. Detaljer på de eksperimentelle prosedyrer, blir lappen fastspenning cellene for å oppnå en hel-celle-konfigurasjon og anvendelse av den dynamiske klemmen teknikk illustrert i denne video-artikkelen. Her viser vi svarene av mus retinal ganglion celler til ulike ledningsevne kurver hentet fra fysiologiske eksperimenter i kontroll forhold eller i nærvær av narkotika. Videre viser vi bruk av kunstige eksitatoriske og hemmende conductances generert ved hjelp av alfa-funksjoner for å undersøke svarene på cellene.

Introduction

Retina er en nær-gjennomsiktig nervevev som forer baksiden av øyet. Mange studier bruker netthinnen som modell for å undersøke de første trinnene i visuell prosessering og mekanismer av synaptiske signalering. Siden retinal nettverket i hel-mount forberedelse er intakt etter disseksjon, representerer det et ideelt system for å studere synaptiske interaksjoner som sine fysiologiske responser er svært lik den in vivo forhold. Dermed bruker en isolert netthinnen egenskapene til sine nerveceller kan studeres ved hjelp av patch clamp teknikker (for anmeldelser på teknikken, se ^6,9,13). Identifikasjon av den eksakte bidraget av særskilte kretser og nevrotransmittere til ganglion-cellerespons, men er vanligvis hindrede som farmakologiske midler opptrer på forskjellige steder.

Fysiologiske responser av netthinnens nerveceller til lys, naturlig stimulans, kan tas opp med glass pipetter fylt med intracellulær væske. Ved hjelp av patch clamp teknikker, nevrale responser til lys stimulering kan bli registrert som membran potensielle svingninger (strømtang) eller som strømmer (spenning klemme). Ved å holde membranen potensiell på ulike spenninger og implementere en posteriori konduktans analyse, er det mulig å isolere inhiberende og eksitatorisk synaptisk innganger ^5,12. Slike eksperimenter kan utføres i normal bading medium og i nærvær av forskjellige farmakologiske midler for å isolere bidraget fra forskjellige nevrotransmittere og reseptorer for nevronal responser. Et vell av studier fra mange laboratorier preget avhengighet av spiking produksjon og eksitatoriske og hemmende innganger på stimulans egenskaper som størrelse, kontrast, romlige og tidsmessige frekvenser, retning, orientering og andre stimuleringstiltak variabler. Selv om disse eksperimentelle tilnærminger gi informasjon om forholdet mellom pigg-utgang og synaptiske innganger som funksjon av stimulus egenskaper,tolkning av bidraget av spesifikke celletyper og deres synaptiske innganger til celleeksiterbarhet er ikke enkelt. Dette skyldes det faktum at typisk både stimulerende og hemmende innganger variere med stimulus egenskaper og således er det ikke mulig å vurdere den nøyaktige virkningen at endringer i begge disse innganger har på neuronal spiking.

En alternativ tilnærming til å omgå disse begrensningene er å utføre dynamiske klemme innspillinger, som tillater en kritisk vurdering av bidraget fra enkelte synaptiske innganger til spiking utgang. Den dynamiske klemmen teknikken tillater direkte injeksjon av strøm inn i cellen og mengden av strøm injisert ved et gitt tidspunkt avhenger av den innspilte membranpotensialet på det tidspunktet ^1,2,3 (for gjennomgang, se ^7,14). Det er en modifisert strømtangen oppsett hvor en sanntids tilbakemelding rask interaksjon mellom cellen under innspilling og utstyret bestående av spesialisert maskinvare, programvareog en datamaskin er oppnådd. Mengden av strøm injisert inn i cellen beregnes deretter. Derfor, er fordelen med denne metode at cellen kan stimuleres med forskjellige kombinasjoner av konduktans bølgeformer, og dens reaksjon vil etterligne aktivering av reseptorer som medierer synaptisk innganger. For eksempel gir sammenligning av svar på injeksjon av eksitatoriske og hemmende conductances for en liten flekk med responsen på injeksjon av eksitatoriske ledningsevne for en liten flekk bare informasjon om effekten av hemming på celle respons. Likeledes kan andre kombinasjoner av fysiologisk registrert conductances være co-injiseres for å avsløre hvordan stimulus-avhengige endringer i eksitatoriske og / eller hemmende conductances påvirke pigg utgang.

I vår studie er det dynamiske klemme teknikk som brukes til å demonstrere effekten av den relative amplitude og timing av synaptiske innganger på standplass egenskaper retinal ganglion celler. Ulike conductanceshentet fra fysiologiske eksperimenter i kontroll forhold eller i nærvær av farmakologiske midler ble ansatt som innganger. I tillegg ble det kunstige conductances basert på alfa-funksjoner også brukes for å undersøke hvordan synaptiske innganger er integrert av nerveceller. Dermed er dette en allsidig teknikk som tillater forskjellige typer av konduktans genereres enten fysiologisk, farmakologisk eller beregningsmessig som skal injiseres i den samme ganglion cellen, kan så sammenligning av responser på disse inngangene gjøres.

Protocol

En. Generell Set Up and Tissue Forberedelse

1. Hold musen i mørket i 30 min (tar sikte på å redusere stress nivået). Mens du venter, kan du forberede en L av ekstracellulært løsning. Først oppløses 1,9 g natrium-bikarbonat i en halv liter av Milli-Q vann. Dens pH-verdien holdes ved 7,4 ved å boble med 95% _O2 og 5% _CO2. Fem minutter senere, oppløses 8,8 g av Ames-medium i 100 ml av Milli-Q vann, tilsett til den natrium-bicarbonatløsning, ble topp opp til en L med Milli-Q vann og bland godt. Hold denne løsning carboxygenated for resten av forsøket.
2. Ta 250 ml av carboxygenated Ames Medium og sette opp væsken reperfusion systemet i elektrofysiologisk oppsett. Holde løsningen carboxygenated.
3. Jevnt smøre et tynt lag av vakuum smørefett på bunnen av kammeret perfusjon. Forsegle den med en cover slip og sørg for at den er lufttett. Ta en liten mengde smøremiddel (~ 2 mm i diameter) og plassere den på toppen ognedre ender av kammeret. Disse kulene vil holde rutenettet (platina ramme stressede med tanntråd) på plass og hindre at det å trykke for hardt på netthinnen. Fix kammeret på plattformen og justere begge åpningene.
4. Dyret er først anestisert med isofluran i 2 min, og deretter avlivet ved cervikal dislokasjon. Raskt fjerne øynene med et par små saks (skovler), vask grundig med carboxygenated ekstracellulær væske i et lite beger, og deretter plassere i en petriskål fylt med carboxygenated ekstracellulær væske.
5. Under disseksjonsmikroskop, gjør en innsetting hull i hornhinnen (~ 2 mm fra kanten) ved hjelp av en 19-gauge nål. Gjenta for det andre øyet. Dette er viktig og bør være raske til å tillate oksygenopptaket både retinae. Fjern en hornhinnen med en liten par iris saks ved å kutte parallelt med kanten. Deretter fjerner iris og linsen med et par fine tang. Gjenta for det andre øyet. Overfør ett øye cup i en beholder som inneholdercarboxygenated ekstracellulært løsning.
6. Med en skalpell blad, kuttet ett øye cup i halv, for å være i stand til å flate ut hel-mount og å få to hele-mounts per netthinnen. Nøye skille netthinnen fra pigment epitel ved hjelp av en sløv dissekere sonde eller ved å trekke det forsiktig av. Når frittliggende, netthinnen er relativt gjennomsiktig. Legg merke til den konvekse overflaten er fotoreseptorer side. Den konkave overflaten er ganglion-celler side og det kan feste seg til seg selv på grunn av tilstedeværelsen av klebrig glasslegemet.
7. Med et par fine tang, hold kanten av frittliggende retinal vev nær ora serrata og ta tak i ora serrata med et annet par fine tang, dra den mot midten av netthinnen. Dette er en delikat prosess og kan ta noen forsøk. Hvis de lykkes, blir ora serrata, ciliary kropp og glasslegemet fjernet av denne prosessen, og krumningen av netthinnen er redusert (dvs. flatere).
8. Trimme kantene, og deretter overføre den til perfusjon kammer med ganglieceller vendt opp. Hold vev på plass ved å plassere risten fettet baller. Plasser gjenværende vev med det andre øyet kopp for senere bruk. Lignende prosedyrer for retinal disseksjon er beskrevet i Middleton og Protti ¹⁶ og Pottek et al. ^17..
9. Monter innspillingen kammer under en oppreist mikroskop. Umiddelbart sette opp den kontinuerlige perfusjon av netthinnen med carboxygenated ekstracellulær løsning (35,5 ° C) med en hastighet av 3-5 ml / min. Kontroller at jording elektroden er på plass.
10. Festet til mikroskopet er et digitalt kamera som tillater visualisering av vev. Hele settet sitter over en luft tabellen (støtdemping) og inne i et Faraday-bur (blokker eksterne statiske og ikke-statiske elektriske felt).
11. Slå av lyskilden (infrarød,> 850 nm) og med en 40X objektiv, bringe sitt fokus på cellen likene av ganglion celler. Finn det sentrale området av hel-mount til registding.
12. Tine en frossen hetteglass med K ⁺ baserte intracellulære løsning (300 ul, pH = 7,4) som inneholder (i mm) K-gluconate: 140, HEPES acid: 10, MgCl _2: 4.6, ATP-Na ^+: 4, GTP-Na ⁺ : 0,4 og EGTA: 10. Alle reagenser kjøpt fra Sigma-Aldrich.

2. Patching Cell Bodies of retinal ganglion celler

1. Første brannen polere endene av borosilikat kapillær glass tubing, deretter trekke dem med et glass microelectrode avtrekker med to varmetrinn (motstand: 5-8 MΩ).
2. Legg 3 mL av Lucifer Yellow (endelig konsentrasjon 0,2%) til den intracellulære løsningen, bland godt, og sentrifuger det. Deretter overfører den øverste 85% av løsningen til en 1 ml sprøyte, koble den til en 0,22 mikrometer f Ilter enhet, deretter til en 30 G gjenbrukbare kanyle. Oppbevares i kjøleskap.
3. Fest glass pipette, av lignende tips størrelse som de som brukes for opptak, i holderen og flytte den under mikroskopet ved hjelp av en micromanipulator. Under et 40X objektiv, sakte lavere pipetten inntil den gjør en liten fordypning på overflaten av den indre begrensende membran. Nøye fremme pipette fremover til den fanger en liten mengde av vev, og deretter flytte den oppover og / eller sidelengs for å rive et lite hull for å eksponere cellen likene av ganglion celler. Jo mindre hull jo høyere grad av integritet av retinal nettverket vedlikeholdes. Hvis ønskelig, sulforhodamine 101 (SR101, 0.5 - 1 mm) kan legges til det ekstracellulære medium å merke ødelagte nerveceller ved hjelp av fluorescens mikroskopi ^15.
4. Fyll opp en ren pipette med 8-10 ul av intracellulær løsning. Sett den inn i holderen festet til forsterkeren hode scenen og sørge for at klorerte sølvkloridelektrode er under vann. Kasser dersom smuss og / eller luftbobler er / er til stede.
5. Slå på alt utstyr. Vi brukte en EPC 8 patch clamp forsterker kontrollert av PatchMaster å oppnå hel-celle opptak i spenning klemme configurasjon. Legg merke til at andre forsterkere som lar dagens klemme opptak i rask modus kan også brukes. Anvende og opprettholde overtrykk i pipetten løsning. Velge en celle med en storcellet kropp, slik det er mest sannsynlig en ganglion celle i stedet for en fortrenges amacrine celle eller en glial cell. Sakte senke pipettespissen slik at det er å lage en liten fordypning på overflaten av membranen, stoppe og slippe trykket. Umiddelbart senke holder potensial til - 60 mV. Når en gigaseal (GΩ) oppnås mellom dem, suge forsiktig for å bryte membranen for å oppnå en hel-celle patch clamp konfigurasjon. Denne prosedyren er en delikat trinn, hvis for mye negativt trykk påføres, er forbindelsen blir utett, hvis for lite, forblir membranen intakt.
6. Over tid vil Lucifer gult fylle cellen, som tillater visualisering av cellens morfologi. Hvis stabil, bør dette oppsettet vare 30 min eller mer.

3. Opptak av ganglion celler Bruke Dynamic Clamp

1. Først, en strøm-spenning test (fra - 75 til + 35 mV hver 10 mV) utføres ved hjelp PatchMaster. Fortsett til senere tester bare hvis en stor Na ⁺ strøm (> 1 nA) er til stede. Merk at i sjeldne tilfelle der en fordrevne amacrine celle er lappet, i så fall, vil ikke svare med tog av aksjonspotensialer til påfølgende aktuelle injeksjoner.
2. Åpen LabVIEW og utføre tilpasset skriftlig Neuroakuma program, legg deretter ulike ledningsevne kurver. Sett gjenta nummeret til 8 (6-8 for statistisk formål). Sett reversering potensialer av eksitatoriske og hemmende conductances på 0 og - 75 mV hhv. Velg ett matchende par av eksitatoriske og hemmende conductances for testing. Eksitatoriske ledningsevne trace (i grønt) og hemmende konduktans trace (i rødt) vil vises i nedre panelet.
3. Gå tilbake til PatchMaster velger strømtangsett modus, og umiddelbart bytte forsterkeren til "CC + Comm RASK" strømtang modus. Denne modusen gjør det mulig å accurately følge raske endringer i membranpotensialet. Hvis en god forsegling mellom membran og pipette opprettholdes, liten / ingen kompensasjon er nødvendig, ellers vil opptaket ikke vare lenge. I Neuroakuma, trykk på "record"-knappen. Den cellulær respons (vanligvis med en phasic utbrudd av aksjonspotensialer, figur 1A) vil vises på den øvre panel. Injisere strøm inn i cellen med lav skalering av conductances først, hvis lite / ingen respons er observert, øke den i små doser før det gir en sterk reaksjon. Overdreven dagens injeksjon kan drepe cellen. Når testene er fullført, velg et par nye konduktans kurver, gjenta det over for alle par av fysiologiske og kunstig conductances. De fysiologiske strømmene (I) injisert i sanntid er basert på:
   I (t) = G _Exc (t) x (V _m (t) - V _Eks) + G _inh (t) x (V _m (t) - V _inh)

Konduktans (G i NS) kan være synaptic eller kunstig. Stimulerende og hemmende synaptiske konduktans kurver ble samlet inn fra tidligere eksperimenter utført av Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen og Solomon (upubliserte resultater) som svar på ulike visuelle stimuli i kontroll forhold og i nærvær av tetrodotoxin (TTX, 1 mm) . Kunstig ledningsevne kurver ble modellert ved hjelp av en alfa-funksjonen. V _m (i mV) er den innspilte membranpotensialet. G _exc og G _inh representerer eksitatoriske og hemmende conductances henholdsvis mens V _exc og V _inh representerer reversering potensialene av eksitatoriske og hemmende conductances henholdsvis. Klokken er ti ms. Samplingsfrekvensen er 40 kHz.
Jeg _s = I ₀ (t / α) ^e-αt

Ligningen over er en alpha-funksjonen (I ₀ = maksimal strøm, 1 / α = tid til maksimal (sek ^-1) av strøm). Stigningstiden og desintegrasjonstid av den synaptiskestrøm er diktert av α ^4.. Den eksitatoriske konduktans var uendret mens den latens av inhiberende konduktans ble endret, noe som reduserer dens forsinkelse i forhold til angrep av eksitasjon (figur 2D).

4. Etter innspillingen nøye trekke pipetten slik at cellen kroppen forblir intakt. Umiddelbart løse vev i 4% paraformaldehyd i 30 min, etterfulgt av tre 10 min vaskinger med 0,1 M fosfatbuffer. Kjøle og utføre antistoffarging neste dag eller innen en uke.

4. Antistoffarging Against Lucifer Yellow Fylt retinal ganglion celler

1. Antistoffarging mot Lucifer Yellow fylt ganglion celler ved romtemperatur (primær anti-Lucifer Yellow kanin IgG (fortynning = 1:10.000) i fem dager, på den sjette dagen, overnatting farging med sekundær geit anti-kanin IgG (fortynning = 1:500 )). Fukt montere netthinnen i Fluorescent Sikrer Media. Dekk slip og forsegle med spiker polish.
2. Ta konfokale bilder av cellemorfologi ved hjelp av et Leica Spec-II konfokalmikroskop (figur 1B). Tilstedeværelsen av en axon tillater bekreftelse av gangliecellene.

Representative Results

Bidraget fra ulike kilder til hemmende innganger til ganglion celle responser er demonstrert gjennom anvendelse av ulike ledningsevne kurver. Disse kurver ble oppnådd med stimuli av forskjellig lystetthet i normal tilstand og i nærvær av TTX, en spennings-Na ^{+-kanal-blokker} som blokkerer aksjonspotensialet generasjon kun i et subsett av inhibitoriske retinale internevroner. Figur 2A viser en representativ reaksjon på injeksjon av stimulerende og hemmende konduktans bølgeformer registrert som svar på stimulering med en liten svart flekk på en grå bakgrunn i normale forhold. Når konduktansen bølgeformer oppnådd med en svart flekk av forskjellig størrelse i nærvær av TTX ble injisert i den samme celle, ble bare en svak reaksjon observert (figur 2B).

Figur 2C illustrerer dermed responsene til en annen celle ganglion til injeksjon av ulike par avledningsevne kurver der forholdet mellom kontroll stimulerende og hemmende ledningsevne ble manipulert (G _exc: G _INH forholdstall: 01:00-01:02). Det er klart at den reaksjon i cellen reduseres ettersom nivået av inhibering ble økt. Derfor manipulere balansen mellom eksitasjon og hemming tillater kvantifisering av deres innvirkning på neuronal utgang.

Vi har også testet effekten av å endre den relative timing mellom eksitasjon og hemming på nevrale responser. Som illustrert på figur 2D, ble dermed responsene til en annen celle ganglion redusert som Latensen til inhiberende konduktans ble redusert, noe som viser at styrken på responsen er avhengig av tiden for dens synaptiske innganger.

Figur 1. (A) Eksperimentell satt opp i skjematisk form. Et digitalt kamera brukes til å visualisere celle likene av ganglion celler for å lappe klemme dem (venstre skjerm). Svar av hver celle til ulike aktuelle injeksjoner ble først registrert, forsterkes og deretter vises på høyre skjerm. Legg merke til at en tilbakekoblingssløyfe er også satt opp mellom datamaskinen og cellen slik at membranpotensial (V) for cellen ved et gitt eksempel brukes til å beregne den strøm (I) som skal injiseres. (B) Det morfologi av en ganglion celle visualisert under en Leica Spec-II konfokalmikroskop etter opptak og immuncytokjemisk farging. Endelige bildet ble produsert ved hjelp ImageJ etter å ha kollapset i en bunke med bilder. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Svar av en ganglion celle til injeksjon av eksitatoriske spor (grønne) og hemmende (røde spor) konduktans bølgeformer oppnådd fra eksperimenter utført i kontroll-forhold (A) og etter bad anvendelse av tetrodotoxin (TTX, B). (C) Svar av en annen ganglion celle til ulike par av konduktans bølgeformer. Forholdet mellom eksitatoriske konduktans (G _exc) og hemmende konduktans (G _inh) ble endret 01:00-01:02. Ettersom graden av inhibering økte, var responsen av cellen reduseres. (D) Svar av en ganglion celle til samme nivå av magnetisering i hvilken utbruddet av inhibering ble variert. AT representerer tidsforskjellen mellom begynnelsen av inhiberende og eksitatoriske konduktans. Ettersom forsinkelsen av inhibering ble redusert, responsen av Than celle ble svakere. Klikk her for å se større figur

Discussion

Her viser bruken av dynamisk klemme for å bedømme innflytelsen av forholdet og relative tidspunkt for eksitasjon og hemming på retina-ganglion celle utgang. Dynamisk klemme gjør bruk av datasimulering til å innføre fysiologisk innspilte eller kunstig synaptiske conductances i levende nerveceller. Denne metoden gir et interaktivt verktøy der conductances kan endres og injiseres i nevroner for å beregne sin innflytelse på nevrale responser. Konduktans bølgeformer kan fås fra eksperimenter hvor visuelle stimuli benyttes for å aktivere fotoreseptorer i kontroll forhold og i nærvær av farmakologiske midler for å isolere bidraget av spesifikk celle eller kretser. Injeksjon av ulike kombinasjoner av disse ledningsevne kurver avslører deres bidrag til spiking utgang. Bruken av dynamiske klemme opptak muliggjør også manipulering av bakgrunnsstøy, som kan finne sted under forskjellige lys-tilpasning conditio ns. Videre kan konduktans bølgeformer også genereres fra modeller av synaptiske innganger, såsom alfa-funksjoner, og også for synaptiske innganger med spenning avhengighet (dvs. NMDA-reseptorer), så vel som for spenningsstyrte ionekanaler eller elektrisk koplede celler. Derfor sammenligninger gjøres mellom ulike tilstander åpne opp enorme muligheter til å forstå bidrag av forskjellige synaptiske mekanismer til nevrale responser og signalbehandling i nevrale nettverk. Det er viktig å bemerke at selv om forskjellige typer av celler uttrykker ganglion tydelig forskjellige typer og intensiteten spenningsstyrte kanaler, har vi funnet at resultatene av integrasjonen av synaptiske konduktans var konsistente over celletyper. Således ble endringer i forholdet av og tidspunktet for stimulerende og hemmende conductances likeledes reflektert i de responser selv spikefrekvens, inter-pigg intervaller og tilpasning egenskaper varierte med celletype (data ikke vist).

ove_content "> Selv dynamisk klemme gir mange fordeler, er det noen begrensninger iboende til teknikk (for gjennomgang, se ^7). En viktig en er at konduktans injeksjon i soma kanskje ikke nøyaktig representere synaptiske innganger mediert av reseptorer og kanaler som er spesifikt fordelt langs membranen av dendrittiske prosesser, og eventuelle ikke-lineære interaksjoner som kan oppstå i dendritter. Dermed kan conductances distalt injeksjonsstedet bli simulert bare ca. Selv dynamisk klemme ble vellykket anvendt til dendritter i pyramideformet celler gjør firedoble hel- celle opptak ^8, utelukker den morfologiske kompleksiteten i ganglion celle dendrittiske prosesser en realistisk simulering av den romlige fordelingen av synapser ved å gjøre dendrittiske innspillinger. Tilnærmingen som presenteres her bruker konduktans kurver beregnet fra somatiske spenning-klemme eksperimenter som også er avhengige av en punkt-kilde elektrode og forutsetter lineære interaksjoner mellom spenAtory og hemmende innganger, en antagelse allment akseptert i samfunnet. Dermed disse studiene gir vesentlig informasjon om effekter av endringer i synaptiske conductances på neuronal integrering på nivået av soma og axon hillock.

Våre eksperimenter ikke gjenskape fysiologiske responser som også rekruttere spenningsstyrte conductances i ganglion celle dendritter. Dette kunne imidlertid også oppnås ved å endre modellen ligningene slik at den nåværende injiserte omfatte dendrittiske conductances og kabel effekter basert på en flerkammer-modell (som beskrevet i ^7).

En annen begrensning er at aktivitet-avhengige endringer som endrer nerveaktivitet, dvs. endringer i intracellulær kalsium eller andre budbringere som utløses av aktivering av membran kanaler eller reseptorer ikke er gjengitt i disse dynamiske klemme innspillinger. Selv om vår modell ikke forholde seg til det nivået av kompleksitet som kan være specific for enkelte celletyper, ble simuleringer som involverer en kalsium basseng og kalsium tilstrømningen til dette bassenget i sanntid basert på spenningsvariasjoner av den innspilte nervecellen implementert ^10.

Selv om en samplingsfrekvens på 10 kHz ville nøyaktig følge tidsforløpet av aksjonspotensialer, våre innspillinger i stedet brukt en samplingsfrekvens på 40 kHz. Denne høyere samplingsfrekvens er nødvendig for å opprettholde stabiliteten i systemet og å tillate realistiske og svært nøyaktig opptak (for gjennomgang se ^11).

Den eksperimentelle metode som er beskrevet her ikke krever å holde retina mørk-tilpasset. Konduktans bølgeformer oppnådd fra mørk-tilpasset retinae i fysiologiske betingelser ble anvendt for å beregne den aktuelle som skal injiseres inn i cellen, på denne måten den aktuelle injiserte etterlignet fysiologisk stimulering med lys. Ikke desto mindre ville det fremdeles være mulig å holde vevet mørk-tilpasset og således være i stand til compare svarene til conductance injeksjon med dem for lys stimulering. I dette tilfellet, fysiologiske egenskapene til ganglion celler (respons polaritet, dvs. ON, OFF eller ON-OFF, romlig og tidsmessig frekvens følsomhet, retning selektivitet, etc.) kunne klassifiseres før påføring av ulike konduktans bølgeformer å vurdere hvorvidt injeksjon av conductances fra en bestemt celletype har ulike effekter avhengig av celletype de brukes til.

Totalt sett anser vi at dynamisk klemme er en svært kraftig teknikk for å bidra til å avsløre samspillet mellom eksitatoriske og hemmende synaptiske innganger som genererer neuronal utgang, for å undersøke hvilken rolle ulike spenningsstyrte conductances i nevronal utløsning, samt å teste hypoteser om synaptiske mekanismer . Anvendelsen av denne teknikken i netthinnen er spesielt nyttig, som de synaptiske innganger på flere ganglion celletyper har vært grundig karakterisered som en funksjon av den fysiologiske stimuli. På samme måte kan denne tilnærmingen gir innsyn i funksjon av nevronale kretser i andre områder av det sentrale nervesystemet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic	Pharmachem
Ames Medium with L-Glutamate (Powder)	Sigma-Aldrich
Potassium Gluconate, Anhydrous	Sigma-Aldrich
HEPES Sodium salt	Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)	Sigma-Aldrich
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)	Invitrogen
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml	Invitrogen
Fluorescent Preserving Media	BioFX Laboratories Inc.
Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)	Warner Instruments	64-0794
Single Stage Glass Micr–lectrode Puller	Narishinge Japan	Model PP-830
Minipuls 2	Gilson
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit	Millipore Corporation	SLGV004SL
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G	Smith Nephew (Australia)
Single Inline Solution Heater	Warner Instruments	Model SH-27B
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Olympus Stereomicroscope SZ61	Olympus Corporation
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective	Olympus Corporation
0-30 V 2.5 A DC Power Supply	Dick Smith Electronics	Q1770
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool	Jenoptik
Micromanipulator MP-225	Sutter Instrument Company
Patch Clamp Amplifier EPC 8	HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System	HEKA Elektronik
Computer: DELL	Dell Corporation