Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

A المنهج المقارن لتوصيف المشهد من المضيف الممرض البروتين البروتين التفاعلات

Published: July 18, 2013 doi: 10.3791/50404
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,3, 1
1Unité de Génétique, Papillomavirus et Cancer Humain (GPCH), Institut Pasteur, 2Cellule Pasteur, Université Sorbonne Paris Cité, 3Center for Cancer Systems Biology (CCSB), Harvard Medical School, Department of Cancer Biology, Dana Farber Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

تركز هذه المقالة على تحديد مجموعات البيانات التفاعل ثقة عالية بين المضيف والممرض البروتينات باستخدام مزيج من طريقتين متعامد: الخميرة اثنين الهجين تليها مقايسة تفاعل عالية الإنتاجية في خلايا الثدييات يسمى HT-GPCA.

Abstract

جمعت جهودا كبيرة لتوليد خرائط شاملة واسعة النطاق البروتين البروتين شبكة التفاعل. هذا هو دور أساسي لفهم العلاقات الممرض المضيف وأجريت أساسا عن طريق غربلة وراثية في الخميرة أنظمة هجين اثنين. التحسن الأخير من الكشف عن البروتين البروتين التفاعل من قبل Gaussia جزء المستندة إلى luciferase الفحص تكامل تقدم الآن فرصة لتطوير المناهج interactomic النسبية التكاملية اللازمة لمقارنة بدقة ملامح تفاعل بروتينات مختلفة من المتغيرات سلالة الممرض ضد مجموعة مشتركة من العوامل الخلوية.

وتركز هذه الورقة على وجه التحديد على فائدة الجمع بين طريقتين متعامد لتوليد البروتين البروتين مجموعات البيانات التفاعل: الخميرة اثنين الهجين (Y2H) وفحص جديدة، عالية الإنتاجية Gaussia princeps البروتين مقايسة تكامل (HT-GPCA) التي أجريت في خلايا الثدييات.

NT "يتم تنفيذ> A تحديد نطاق واسع من الشركاء الخلوية من البروتين الممرض عن طريق التزاوج القائم على الخميرة غربلة هجين اثنين من مكتبات [كدنا] باستخدام عدة متغيرات سلالة الممرض. مجموعة فرعية من الشركاء التفاعل اختيارها على التهديف الثقة العالية الإحصائية مزيد التحقق من صحة في خلايا الثدييات للتفاعل الزوج الحكيم مع مجموعة كاملة من المتغيرات الممرض البروتينات باستخدام HT-GPCA. هذا مزيج من اثنين من الطرق التكميلية يحسن متانة ورقة العمل التفاعل، ويسمح للأداء صرامة تحليل التفاعل المقارنة. هذه interactomics المقارنة تشكل استراتيجية موثوق بها وقوية على فك أي interplays الممرض المضيف.

Introduction

كمية متزايدة من البيانات التي تم جمعها لتوليد خرائط التفاعل البروتين البروتين يفتح آفاقا لمزيد من فهم التهابات الممرض. كما الفهم العالمي لالتهابات الممرض تبدأ في الظهور، فإنه يوفر الوصول إلى مجموعة من الاضطرابات الناجمة عن مسببات الأمراض البروتينات عند توصيل بروتيوم الإنسان 1. وبذلك يوفر وسيلة لفهم كيفية التعامل مع مسببات الأمراض آلية الخلية المضيفة. على وجه الخصوص، كشفت رسم الخرائط من عدة شبكات التفاعل الفيروسي المضيف أن البروتينات الفيروسية استهداف تفضيلي البروتينات المضيفة التي ترتبط بشكل كبير في الشبكة الخلوية (المحاور)، أو التي تعتبر أساسية لكثير من المسارات في شبكة (البروتينات الاختناقات) 2-4. هذه التفاعلات تسمح الفيروسات لمعالجة العمليات الخلوية الهامة التي تلعب دورا محوريا لتكرار وإنتاج ذرية المعدية. أجريت المقارنة التفاعلات رسم الخرائط مؤخرا على الفيروسات ذات الصلة بهدف لاستخراج المعلومات المتعلقة4 المرضية. وعلاوة على ذلك، تم توسيع نطاق الدراسات من المضيف مسببات الأمراض تفاعلات المشهد لكثير من مسببات الأمراض 5. يوفر استهدفت خلية عوامل تحديد نظرة ثاقبة لالاستراتيجيات المستخدمة من قبل مسببات الأمراض أن تصيب الخلايا ويسمح الكشف عن علامات العدوى المحتملة.

نظام هجين اثنين الخميرة هي الطريقة الأكثر شعبية لتحديد التفاعلات الثنائية منذ الفحص الجيني هو أداة فعالة وحساسة لرسم الخرائط الإنتاجية العالية من البروتين البروتين التفاعلات. النهج المقترح هنا مزيد من يحسن غربلة Y2H الفردية من خلال تقييم البروتين من مسببات الأمراض متعددة المتغيرات سلالة، وبالتالي توفير إمكانية الوصول إلى نظرة شاملة مقارنة الممرض المضيف البروتين البروتين التفاعلات. وعلاوة على ذلك، وجود قيود كبيرة من الخميرة فحص هجين اثنين يكمن في معدل السلبية الكاذبة عالية، لأنه يسترد حوالي 20٪ من مجموع التفاعلات 6. هذا يعني أن التفاعلات مع الكشف عن مجموعة فرعية فقط من المرضيةجينز المتغيرات قد أفلتت من عملية الاكتشاف مع الآخرين. ولذلك، شركاء الفردية الناشئة من كل غربلة هجين اثنين وتحدى مزيد للتفاعل مع مجموعة كاملة من السلالات المدروسة، وتوفير قواعد البيانات التفاعل المقارنة. منذ وقد تبين أن الجمع بين منهجيات مختلفة يزيد بشدة متانة البروتين البروتين التفاعل مجموعات البيانات 7، يتم تنفيذ هذا التحقق في خلايا الثدييات التي وضعت حديثا البروتين شظية فحص تكامل دعا HT-GPCA 8. هذا النظام القائم على الخلية يسمح للكشف عن تفاعلات البروتين بواسطة تكامل من Gaussia princeps تقسيم و luciferase تم تصميمها لتكون متوافقة مع صيغة عالية الإنتاجية. وبفضل تقنيتها القائمة على التلألؤ والضوضاء لها خلفية منخفضة بالمقارنة مع غيرها من مقايسة المستندة إلى الإسفار، HT-GPCA يظهر حساسية عالية لافت للنظر.

وعموما، هذا النهج يشكل كفاءةأداة لتوليد مسح شامل لinterplays المضيف الممرض، الذي يمثل الخطوة الأولى نحو فهم عالمي من الخلية المضيفة الخطف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الخميرة غربلة هجين اثنين

  1. جعل الحلول المطلوبة التالية:
    1. كاملة التسرب الاصطناعية (SD): ذوب 26.7 غرام من الحد الأدنى من قاعدة SD مع الجلوكوز في 1 لتر من الماء. إضافة 2 غرام من خليط الأحماض الأمينية أعدت على النحو التالي: 2 غرام hemisulfate الأدينين، 2 ز أرجينين حمض الهيدروكلوريك، 2 غرام الحامض الأميني حمض الهيدروكلوريك، 2 ز آيسولوسين، 4 ز يسين، ليسين حمض الهيدروكلوريك 2 ز، ز 2 الميثيونين، 3 ز فينيلالاناين، 2 ز L -سيرين، 2 ز L-ثريونين، تريبتوفان 3 ز، ز 2 التيروسين، 1.2 غرام يوراسيل، 9 ز حمض أميني أساسي.
    2. قطرة انتقائية طعام SD-L/-W/-H: SD تحتوي على كل الأحماض الأمينية الأساسية ما عدا تلك المحددة (-L: لوسين؛-W: تريبتوفان؛-H:-الحامض الأميني).
    3. YPGLU: للحصول على 1 لتر، الوزن 10 غ من خلاصة الخميرة، و 10 غرام من Bacto ببتون و 20 غرام من الجلوكوز. مع استكمال 25 ز Bacto أجار لوسائل الإعلام الصلبة.
    4. YCM: نفس YPGLU ولكنه عدل الرقم الهيدروجيني إلى 4.5.
  2. التزاوج ونشر
    1. استخدام مأخوذة المجمدة من قبل التحويلإد Y187 سلالة الخميرة (نوع التزاوج α) تحتوي على مكتبة [كدنا] المستنسخة في pACT2. تحقق بقاء الخلية بواسطة الطلاء التخفيفات المسلسل على لوحات SD-L.
    2. استنساخ ORF الممرض إلى pGBKT7 ناقلات، وتحويل البلازميد المؤتلف باستخدام إجراء القياسية إلى AH109 سلالة الخميرة (نوع التزاوج أ).
    3. انتشار pGBKT7-حولت AH109 الخميرة على لوحات SD-W. احتضان يومين على الأقل 30 درجة مئوية في حاضنة مرطب. ويمكن تخزين لوحات في 4 درجات مئوية حتى فحص هجين اثنين.
    4. استخدام 3-aminotriazole (3-AT)، المانع التنافسية للانزيم HIS3، للتصدي ل-transactivation الذاتي المحتملة من الجين مراسل HIS3 من البروتينات ومسببات الأمراض. إجراء اختبار لصناعة السيارات في التنشيط من خلال تحديد تركيز 3-AT، والذي يمنع نمو الخميرة pGBKT7-تحولت على لوحات SD-W/-H.
    5. البذور 30 ​​مل من SD-W مع قليل من المستعمرات pGBKT7-حولت AH109. احتضان 30 ساعة عند 30 درجة مئوية مع التناوب.
    6. البذور 200 مل من SD-W مع مل 30من AH109 الثقافات. احتضان مع دوران حوالي 20 ساعة عند 30 درجة مئوية.
    7. احتضان إذابة [كدنا] مكتبة حولت Y187 في 20 مل YPGLU، احتضان 10 دقيقة عند 30 درجة مئوية مع التناوب.
    8. أجهزة الطرد المركزي وبلغ حجم التداول pGBKT7-حولت AH109 الثقافة المقابلة لمبلغ مساو من خلايا الخميرة قادرة على البقاء Y187 لمدة 5 دقائق في 3،500 دورة في الدقيقة في 20 درجة مئوية. سحب بعناية طاف و resuspend بيليه في 10 مل YPGLU.
    9. خلط معلق AH109 الخميرة مع Y187 مكتبة تحتوي على. نقل في أنبوب مل 50. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 3،500 دورة في الدقيقة عند 20 درجة مئوية، سحب بعناية طاف (بيليه الهشة).
    10. بيليه resuspend في YPGLU للحصول على ما مجموعه 1.5 مل.
    11. الخميرة انتشار إلى 3 YCM آجار 150 ملم لوحات، و 0.5 مل / لوحة. احتضان 4.5 ساعة عند 30 درجة مئوية.
    12. جمع الخميرة تزاوج من لوحات YCM عن طريق كشط مع كوب أشعل النار في 10 مل من SD-L/-W/-H. شطف لوحات مرتين مع 5 مل SD-L/-W/-H المتوسطة وبركة.
    13. أجهزة الطرد المركزي 5 دقائق عند 3،500 دورة في الدقيقة، 20° C. تجاهل طاف و resuspend الخميرة بيليه في 5 مل SD-L/-W/-H المتوسطة.
    14. نشر الخميرة تزاوج إلى 10 لوحات (0.5 مل / لوحة) من آجار SD-L/-W/-H تستكمل مع التركيز المناسب من 3 aminotriazole (3-AT) المحددة في اختبار لصناعة السيارات في التنشيط. احتضان عند 30 درجة مئوية في جو مرطب لل6-10 أيام.
    15. تحديد (2N) معدل مضاعفا من أجل تقييم كفاءة التزاوج من خلال نشر 250 ميكرولتر من التخفيفات المتسلسلة (10 -4 إلى 10 -6) لتعليق الخميرة تزاوج على لوحات SD-L/-W. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة يومين. عد المستعمرات نمت على SD-L/-W، واستدلال على إجمالي عدد مضاعفا الحالي في حجم الأولي من الخميرة تزاوج. الإبلاغ عن هذا العدد مضاعفا لعدد قابلة للحياة الخميرة تحتوي على مكتبة لحساب معدل مضاعفا. يجب أن تتراوح حوالي 10-25٪.
    16. بعد 6-10 أيام الحضانة عند 30 درجة مئوية، واختيار المستعمرات الخميرة تزاوج في SD-L/-W/-H الطازجة + 3-AT لوحات. [تلميح: النظام الخميرة في مخطط 8الممرات من 12 بئرا استنساخ 96 لوحة جيدا بحيث انه سيكون من الاسهل بعد ذلك في التسلسل]. اسمحوا مستعمرات الخميرة تنمو لمدة 4-5 أيام عند 30 درجة مئوية في جو مرطب.
  3. فحص من HIS3 الحيوانات المستنسخة إيجابية من قبل PCR وتسلسلها
    والهدف هو PCR تضخيم ORF الواردة في pACT2 ناقلات من مستعمرات الخميرة نمت على لوحات SD-L/-H/-W انتقائية.
    1. وضع 96 لوحة جيدا PCR على الجليد.
    2. إلى ليز خلايا الخميرة، إضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من حل 20T Zymolase (2.5 ملغ / مل في 10 ملي HEPES العازلة الرقم الهيدروجيني 7.7).
    3. resuspend بلطف مستعمرة واحدة لكل بئر.
    4. احتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
    5. وضع لوحة مرة أخرى على الجليد. إضافة 50 ميكرولتر من الماء المقطر لكل بئر. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
    6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 3،500 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية.
    7. PCR تضخيم 10 ميكرولتر للكشف عن إدراج باستخدام بادئات الصلب كلا الجانبين من ORF المستمدة من [كدنا] في pACT2 ناقلات. البروتوكول هو زاللاعب Iven لتضخيم من 96 مستعمرات الخميرة هي lysed مع البلمرة ExTaq. تحضير مزيج التالية: 525 ميكرولتر العازلة 10X ExTaq، 420 ميكرولتر dNTPs مزيج (2.5 ملم)، 10.5 ميكرولتر التمهيدي إلى الأمام (1 ميكروغرام / ميكرولتر)، 10.5 ميكرولتر عكس التمهيدي (1 ميكروغرام / ميكرولتر)، 31.5 ميكرولتر ExTaq (5 U / ميكرولتر ) و3202.5 ميكرولتر H 2 0. توزيع 40 ميكرولتر من مزيج لكل بئر في 96 لوحة جيدا PCR. إضافة 10 ميكرولتر من الخميرة هي lysed لكل بئر. أداء التضخيم على النحو التالي: 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم 35 دورات في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 72 درجة مئوية لمدة 4 دقائق، وتنتهي مع 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. تشغيل 3 ميكرولتر من المنتجات PCR على agarose هلام 1.2٪ للكشف عن الحيوانات المستنسخة إيجابية PCR. لاحظ أن استخدام المسبقة الصب 96 كذلك ينصح الاغاروز المواد الهلامية.
      [نصيحة: يمكنك خزنها لوحة في -20 درجة مئوية لمدة بضعة أشهر، وإعادة استخدامها لPCR جديدة]
    8. تسلسل شظايا PCR تضخيم المعزولة من الحيوانات المستنسخة HIS3 إيجابية. إجراء تحليل لتحديد انفجار الخلوية ORF. التحالفات انخفاض الثقة (E قيمة وGT؛ 10 -10، والهوية <80٪، وطول الببتيد <20 الأحماض الأمينية) يتم التخلص منها وكذلك frameshifted وسابق لأوانه كودون إيقاف تحتوي على متواليات.

2. بناء مصفوفة لHT-GPCA

HT-GPCA هو فحص الثدييات المستندة إلى الخلايا حيث يتم التعبير عن كل من البروتينات الممرض والمضيف عابر تنصهر إلى شظايا التكميلية للانقسام Gaussia princeps وسيفيراز. على التفاعل بين الشركاء، يتم تشكيل هذا الانزيم مما يتيح قياس نشاطها الأنزيمي. وهكذا استنتج شدة التفاعل من نسبة التلألؤ تطبيع (انظر أدناه) والشكل (1)

  1. اختيار الشركاء الخلية المضيفة
    1. تحديد البروتينات التي يتم تحديدها أكثر من ثلاث مرات في فحوصات Y2H لمزيد من التحقق من صحة في خلايا الثدييات لزيادة الثقة البينات 9.
    2. إضافة المعروف شركاء التفاعل من بروتينات الممرض كما positiهاء الضوابط.
  2. نقل إلى ناقلات متوافقة HT-GPCA
    1. استنساخ كل الممرض بروتين ORF في ناقلات pSPICA-N2 لتوليد بروتينات الممرض مع الأحماض الأمينية 110-185 من princeps Gaussia أنسنة تنصهر وسيفيراز في N-محطة (اندماج بروتين GL2 الممرض) الخاصة بهم.
    2. PCR تضخيم بروتين ORF الخلوية مباشرة من الحيوانات المستنسخة إيجابية Y2H أو من موارد أخرى ORF (ORFeome الإنسان http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) ونقلها إلى نواقل pSPICA-N1 لتوليد بروتينات تنصهر في N-محطة مع الأحماض الأمينية 18-109 من أنسنة Gaussia princeps وسيفيراز (اندماج بروتين GL1-المضيف).
      [نصيحة: للحصول على استنساخ على نطاق واسع، فمن المستحسن نظام الاستنساخ عبارة. في هذه الحالة، لPCR التضخيم، استخدم الاشعال مصممة لتحتوي على مواقع متوافقة بوابة].
    3. تسلسل جميع ناقلات التعبير. متواليات من pSPICA-N1-N2 وpSPICAيمكن العثور عليها في إشارة 8.

لاحظ أن يبني البلازميد يمكن المقلوب، أي البروتينات مسببات الأمراض في pSPICA-N1 والبروتين المضيف في pSPICA-N2.

3. عالية الإنتاجية Gaussia princeps البروتين luciferase المراسل القائم على الفحص التكملة (HT-GPCA)

  1. ترنسفكأيشن الخلية
    1. البذور 293T الخلايا 350،000 في خلية / مل من DMEM مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) بدون المضادات الحيوية. توزيع 100 ميكرولتر / جيد في لوحات ثقافة عقيمة بيضاء. لا يتجاوز 10 لوحات في تجربة واحدة. اسمحوا تنمو الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2.
      [تلميح: منذ البلازميدات pSPICA تحتوي على أصل SV40، واستخدام الخلايا 293T يسمح تكرارها في الخلايا transfected وبالتالي يؤدي إلى overexpression من اثنين شظايا وسيفيراز]
    2. في اليوم التالي، Transfect الخلايا باستخدام أي بروتوكول ترنسفكأيشن مناسبة. لاحظ أن لبعض الكواشف ترنسفكأيشن، ونوmber من المصنف الخلايا قد تضطر إلى أن تتكيف. استخدام 100 نانوغرام لكل بئر من كل من الممرض والمضيف ORF يبني البلازميد. شارك في 10 نانوغرام بالنقل لكل بئر من ألف من CMV-luciferase يراعة البلازميد لتطبيع لكفاءة ترنسفكأيشن. يتم اختبار كل نقطة في ثلاث نسخ.
      [تلميح: يمزج الحمض النووي لا يمكن أن يؤديها قبل يوم ترنسفكأيشن وتخزينها في -20 درجة مئوية مع الأختام لاصق]
    3. نقل مزيج ترنسفكأيشن إلى لوحات من الخلايا 293T مثقف. كن حذرا أن تودع بلطف مزيج الحمض النووي على الخلايا، كما 293T ليست ملتصقة بقوة وفصل بسهولة من أسفل البئر. احتضان في ثقافة الخلية الحاضنة لمدة 24-30 ساعة عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2.
  1. تحلل الخلايا وGaussia جرعة وسيفيراز
    1. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني (100 ميكرولتر / جيد). إضافة 40 ميكرولتر 1X العازلة تحلل Renilla. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض.
    2. وفر 10 ميكرولتر من الخلية لست في بلات أبيض آخره لجرعة لاحقة من luciferase النشاط اليراع. تخزينها في 4 درجة مئوية أو بدلا من ذلك عند درجة حرارة -20 درجة مئوية مع الختم.
    3. قياس النشاط Gaussia على 30μl المتبقية من الخلية لست بإضافة 100 ميكرولتر من Renilla وسيفيراز كاشف الفحص والفرز التلألؤ لمدة 10 ثانية مع luminometer. جرعة من 96 لوحة جيدا يستغرق حوالي نصف ساعة. أداء قياس مع مقتطفات خلية جديدة منذ التخزين التجميد أو على المدى الطويل قد تؤثر على نشاط Gaussia التفاعل بوساطة.
  1. قياس النشاط اليراع
    1. قياس النشاط اليراع على حفظ 10 ميكرولتر من الخلية لست بإضافة 50 ميكرولتر من luciferase يراعة كاشف الفحص والفرز التلألؤ لمدة 10 ثانية. جرعة من 96 لوحة جيدا يستغرق حوالي نصف ساعة. [نصيحة: الجرعة من luciferase يراعة لا يمكن أن يؤديها في اليوم التالي على لست] المجمدة.]
  1. الحسابات NLR
      Gaussia واليراع luciferase النشاط للحصول على تطبيع Gaussia قيمة التلألؤ مع مراعاة الكفاءة ترنسفكأيشن وبقاء الخلية. حساب متوسط ​​من ثلاث مكرارت.
    1. لرصد التفاعل، تقدير نسبة التلألؤ تطبيع (NLR) لكل زوج الممرض المضيف. للقيام بذلك، تقسيم تطبيع نشاط التلألؤ Gaussia الكشف في حضور كل من الممرض والبروتينات المضيف على مجموع الأنشطة قياس التحكم في الآبار (الشكل 1 مقتبس من المرجع 8). وقد قدرت قيمة NLR وقف انتاج المواد الانشطارية للتفاعل إيجابي لتكون نحو 3.5 8.
  1. تحليل البيانات
    1. أداء المجموعات الهرمية باستخدام حزمة الإحصائية R. أولا، مجموعة البيانات NLR إلى فئات، ثم احتساب dendrogram التفاعل باستخدام طريقة الربط كاملة. تصور هذاdendrogram مع JavaTreeView 10. حساب المسافة بين dendrogram التفاعل وشجرة النشوء والتطور باستخدام معامل ارتباط بيرسون.
    2. لتوليد شبكات التفاعل، حدد التفاعلات الإيجابية من مجموعة البيانات HT-GPCA واستخدام البرنامج Cytoscape 1. استخراج درجة من البروتينات المضيفة ورسم توزيعها للوصول إلى الديناميات المحلية الشبكة. شبكات المضيف مسببات الأمراض يمكن فرضه على interactome المضيفة لتوفير تقييم للأثر العالمي للبروتينات الممرض في الشبكة الخلوية المضيف.
    3. استخراج GO (علم الوجود الجينات) حيث يرتبط مع العوامل الخلوية المستهدفة مع قاعدة البيانات المعلوماتية الحيوية DAVID 12 لتقييم والإثراء الوظيفي من مجموعة البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إحدى نقاط القوة الرئيسية للHT-GPCA تكمن في حساسية عالية، كما يتضح من تقييم معدلات الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة للE2 بروتين فيروس الورم الحليمي البشري في الشكل 2 (مقتبسة من مرجع 13). لتحديد معدل سلبية كاذبة، تم تقييم التفاعلات المعروفة من E2 من HPV16 بواسطة HT-GPCA (الشكل 2A). لم تسترد أربعة من أصل 18 التفاعلات (المقابلة لمعدل السلبية الكاذبة 22٪). تم قياس التفاعلات الإيجابية الكاذبة لتكون 5.8٪ باستخدام فيروس الورم الحليمي البشري 12 البروتينات E2 ضد مجموعة عشوائية من البروتينات الخلوية (الشكل 2B). وعلاوة على ذلك، يتم تمييز خصوصية قوية من أسلوب في الشكل 2C تبين أن طفرة نقطة واحدة معروفة لتتداخل مع E2 الربط إلى شريك خليتها BRD4 يقضي على نسبة NLR (الشكل 2C).

وقد تم تطبيق هذا النهج interactomic النسبية على نطاق واسع في الآونة الأخيرة بنجاح لثلاثة محترفين في وقت مبكرالبروتينات من فيروس الورم الحليمي البشري (HPV): E2، E6 E7 ومنشؤها من ممثل المورثات مختلفة من فيروس الورم الحليمي البشري التنوع الطبيعي في tropisms والأمراض 13،14. لكل من البروتينات في وقت مبكر، والتجميع الهرمي للملامح التفاعل معظمها يجمل فيروس الورم الحليمي البشري نسالة، مما يثبت مدى متانة هذا النهج وملاءمة من مجموعات البيانات التفاعل (الشكل 3 مقتبسة من المراجع 13 و 14). ويمكن استخدامه لربط ملامح التفاعل في استضافة فيروس محددة مع الصفات المرضية، وبالتالي إعطاء أدلة على تورط البروتينات الفيروسية في المرضية. ويمكن استخراج التفاعلات الوراثي محددة، والتي يحتمل أن تتوافق مع tropism أو الممرضة المؤشرات الحيوية كما هو مبين في الشكل (4) لE6 البروتينات من فيروس الورم الحليمي البشري (الشكل 4 مقتبس من مرجع 14).

وعلاوة على ذلك، يمكن للرؤى الفنية الخروج من هذه التحليلات على نطاق واسع. على سبيل المثال، في دراسة interactomic منفيروس الورم الحليمي البشري E2 البروتينات، التحليل والإثراء الوظيفي أدى إلى التعرف على عائلة بارزة تتمثل في عوامل النسخ الخلوية، وذلك تمشيا مع الدور الأساسي للE2 كمنظم النسخي الفيروسية. وكشف أيضا استهداف وظيفية غير متوقع من آلات الاتجار داخل الخلايا، وفتح آفاق جديدة لدور E2 في فيروس الورم الحليمي البشري المرضية 13.

وعموما، فإن الدراسات المقارنة interatomic يؤديها مع البروتينات في وقت مبكر HPV تحسن كثيرا من الفهم من فيروس الورم الحليمي البشري المرضية عن طريق الربط بين التفاعلات ملامح محددة إلى الاختلافات المظهرية.

الشكل 1
الشكل 1. تحديد البروتين البروتين التفاعلات باستخدام HT-GPCA. وتنصهر كل من الممرض والبروتينات المضيف إلى INACنصف TIVE من Gaussia princeps وسيفيراز (أجزاء GL2 وGL1، على التوالي). عندما البروتينات والتفاعل، وبفعل النشاط وسيفيراز من القرب من كل شطر من الانزيم. يتم احتساب Gaussia luciferase النشاط استعادة من نسبة التلألؤ تطبيع (NLR) كما هو موضح على اليمين. الشكل مقتبس من مرجع 8. اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. خصائص HT-GPCA. (A) تم اختبار 18 التفاعلات المستخرجة من المؤلفات التي تنطوي على البروتين E2 من HPV16 والبروتينات الخلوية التي كتبها HT-GPCA من أجل تقدير معدل السلبية الكاذبة المرتبطة بهذا ر echnique. يتم تمثيل نسبة NLR كما تدرج اللون (خريطة الحرارة) مع مقياس من الأسود (دون تفاعل) للضوء (التفاعل القوي) باللون الأزرق. لم تسترد أربعة التفاعلات المعروفة (الأسهم الحمراء) إعطاء تقدير تقريبي للمعدل السلبية الكاذبة حول 22٪. (B) تم اختبار فيروس الورم الحليمي البشري 12 البروتينات E2 مع 10 البروتينات الخلوية اختار عشوائيا، الموافق بداهة التفاعلات السلبية، من أجل تحديد معدل إيجابية كاذبة من HT-GPCA، الذي سجل حوالي 5.8٪. (C) ومن المعروف أن التفاعل بين البروتين الخلوي BRD4 وHPV16 أو HPV18 البروتينات E2 تعتمد على الأحماض الأمينية I73 I77 وعلى التوالي. عندما يتم تحور هذه الأحماض الأمينية، وHT-GPCA NLR يسقط مع انخفاض 5 مرة مما يدل على خصوصية عالية للكشف عن التفاعلات. الشكل مقتبس من المرجع 13. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

jove_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" دائما "> الشكل (3)
الشكل (3). مقارنة بين dendrograms القائم على التفاعل التجريبية وأشجار النشوء والتطور فيروس الورم الحليمي البشري. يتم تمثيل نسالة من فيروس الورم الحليمي البشري استنادا إلى البروتينات E2 في وقت مبكر (A)، E6 (B) أو E7 (C) متواليات على الجهة اليسرى من كل رسم بياني. تم الحصول على dendrograms التفاعل من قبل المجموعات الهرمية من ملامح التفاعل بين كل بروتين ويتم تمثيل على اليمين. ولوحظ وجود تطابق كبير بين كلا النوعين شجرة، مع المجموعات المماثلة من الأنواع المرضية (المستطيلات الملونة)، مما يثبت مدى ارتباط مجموعات البيانات التفاعل. الشكل مقتبس من المراجع 13 و 14. انقر هنا لعرض أكبر التينلدى عودتهم.

الشكل 4
الشكل 4. التمثيل التخطيطي للE6 أهداف الخلوية الرئيسي. تم فرز الأهداف خلوية تعمل على أساس شدة التفاعل ومجمعة وفقا لنوع التفاعل فيروس الورم الحليمي البشري. هذا التمثيل يسمح تحديد المؤشرات الحيوية محددة مثل FADD، الذي يتفاعل فقط مع E6 البروتينات من فيروس الورم الحليمي البشري أنكجنيك. يجب أن يكون مثل هذا الاستهداف حاسمة بالنسبة لسمة مسرطنة من جميع أنكجنيك فيروس الورم الحليمي البشري وبالتالي يشكل مرشحا جيدا لاستخدامه إما كمؤشر بديل للعدوى فيروس الورم الحليمي البشري أو كهدف العلاجية. الشكل مقتبس من المرجع 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بشكل مستقل، الخميرة اثنين والهجين والثدييات المقايسات التفاعل، مثل GST المنسدلة، LUMIER أو MAPPIT، أثبتت أنها أدوات فعالة للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات، لكنها محدودة من ارتفاع معدل الكاذبة الإيجابية والسلبية الكاذبة التفاعلات المرتبطة مع هذه التقنيات 15. وعلاوة على ذلك، أدلة متزايدة على أن الجمع بين أساليب متعامد يزيد من موثوقية مجموعة البيانات التي تم الحصول عليها التفاعل 7. التطور الأخير من تقنية HT-GPCA الموصوفة هنا قد تحسن ليس فقط حساسية للكشف عن ثنائي التفاعل البروتين البروتين في خلايا الثدييات، لكنها لم تقدم أيضا إمكانية التعامل مع كمية كبيرة من التفاعلات في آن واحد.

الاستراتيجية الموصوفة هنا يحسن التغطية من العروض Y2H الفردية التي تحقق التفاعل بين المتغيرات سلالة متعددة. وعلاوة على ذلك، إعادة الاختبار التفاعلات مع طريقة الكشف متعامد يتيح التفاعلات المقارنة الصارمةمجموعات البيانات نشوئها، عن طريق التغلب على القيود والهروب التحف الأصيلة للمنهجية هجين اثنين. في الواقع، منذ HT-GPCA يحدث في خلايا الثدييات، والتعديلات بعد متعدية وتوطين التحت خلوية الطبيعية من البروتينات تتأثر. وبالتالي يمكن أن نهجنا في إنتاج واحد خرائط التفاعل الخطوة التي تحسنت بالمقارنة مع تلك التي تستند في المقام الأول على الخميرة اثنين الهجين للتفاعل الاستشعار 4.

في هذه المرحلة على الرغم من، نود أن نوصي الحرص عند دراسة البروتينات عبر الغشاء، منذ الكشف عن التفاعلات قد تعتمد على توطين شظايا Gaussia على جانبي الغشاء. في هذه الحالات، يمكن أن يكون ضروريا لدمج شظايا Gaussia في نهاية C-محطة من واحد أو كلا الشريكين. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتأثر التعبير وسيفيراز من قبل العديد من المعلمات مثل كفاءة ترنسفكأيشن وعدد الخلايا. ولذلك، فإننا نوصي بشدة الفلبسبب الإجراء تطبيع الموضحة في قسم البروتوكول من أجل أن تأخذ في الاعتبار الاختلافات التجريبية.

باستخدام صفائف بأمر من ORF مأخوذة من مجموعة متزايدة من ORFeome الإنسان، ونحن نتوقع نقطة في المستقبل القريب حيث HT-GPCA يمكن أن تستخدم مباشرة كوسيلة فحص. هذا ينبغي أولا تحسين جذري في التغطية الفرز منذ عندئذ سيتم اختبار كل أزواج البروتين، وثانيا، ينبغي أن تسهل الأتمتة. ومع ذلك، يجب أن يقدموا أكثر جذرية توسع إنتاجية عالية من هذا الاختبار من خلال تطوير في المختبر HT-GPCA فحص باستخدام نظم في التعبير المختبر يعتمد على مقتطفات الخلية البشرية. يجب أن هذا أيضا تمكين لمراقبة البروتين البروتين التفاعلات الكيميائية الحيوية في بيئة تسيطر عليها.

وأخيرا، ومن المتوقع حدوث تطورات المقبلة لتحسين التصور من التألق معقدة بوساطة في الخلايا الحية. في هذه الحالة، يمكن أن يكون HT-GPCAتستخدم للكشف عن التفاعلات الدينامية في سياق بالإضافة المخدرات أو مثبطات معقدة ما يسمح بمراقبة حية للتعطيل التفاعل.

في كل شيء، هذا النهج يشكل مخطط فعالة لأية دراسات من التفاعل الممرض المضيف ونحن نرى أن تحليلات interactome المقارنة يمكن أن توفر إطارا متينا لفهم ميكروب خطف الخلايا المضيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل في جزء من التمويل من معهد باستور ومن المنح المقدمة من الدوري الفرنسي الوطني مناهضة جنيه السرطان (منح R05/75-129 وRS07/75-75)، والرابطة من أجل الديمقراطية بحوث السرطان سور جنيه (منح ARC A09 / 1/5031 و4867)، والوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR07 MIME 009 02 وANR09 سحنة 026 01). كان MM المستفيدة من زمالة MENRT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast strains Clontech
Minimal SD base US biological D9500
Amino acids Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Acros organics 264571000
Zymolase Seikagaku 120491
DMEM Gibco-Life Technologies 31966
Fetal bovine serum BioWest S1810
Phosphate buffer Saline (PBS) Gibco-Life Technologies 14190
Penicillin-Streptomycin Gibco-Life Technologies 15140
Trypsin-EDTA Gibco-Life Technologies 25300
Renilla luciferase assay Promega E2820
White culture plate Greiner Bio-One 655083
96-wellPCR plates 4titude 4t-i0730/C
Incubator (30 °C) Memmert
Incubator (37 °C) Heraeus
Luminometer Berthold Centro XS-LB 960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
  2. Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
  3. de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
  4. Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
  5. Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
  6. Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
  7. Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
  8. Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
  9. Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
  10. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
  11. Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
  12. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
  13. Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
  14. Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
  15. Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).

Tags

علم المناعة، العدد 77، علم الوراثة، علم الأحياء الدقيقة، الكيمياء الحيوية، علم الأحياء الجزيئي، علم الأحياء الخلوي، الهندسة الطبية الحيوية، والعدوى، بيولوجيا السرطان، علم الفيروسات، والتفاعلات المضيف الممرض، والتفاعلات المضيف الممرض، والتفاعل البروتين البروتين، وفحص عالية الإنتاجية، التلألؤ والخميرة هجين اثنين، HT-GPCA، شبكة، البروتين، والخميرة، والخلية، والثقافة
A المنهج المقارن لتوصيف المشهد من المضيف الممرض البروتين البروتين التفاعلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muller, M., Cassonnet, P., Favre,… More

Muller, M., Cassonnet, P., Favre, M., Jacob, Y., Demeret, C. A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (77), e50404, doi:10.3791/50404 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter