Summary
Cet article se concentre sur l'identification des ensembles de données d'interaction de haut confiantes entre l'hôte et les protéines pathogènes en utilisant une combinaison des deux méthodes orthogonales: deux hybrides de levure suivie d'un test d'interaction à haut débit dans les cellules de mammifères appelé HT-ACPG.
Abstract
Des efforts importants ont été recueillies pour produire des cartes réseau interactions à grande échelle globale protéine-protéine. Cela est essentiel à comprendre les relations pathogène-hôte et a été essentiellement réalisée par des projections génétiques dans la levure de systèmes à deux hybrides. La récente amélioration de la détection des interactions protéine-protéine par un test de complémentation de fragment luciférase basé Gaussia offre maintenant la possibilité de développer des approches interactomic comparatives d'intégration nécessaires pour comparer rigoureusement les profils d'interaction des protéines de différentes variantes de la souche pathogène contre un ensemble commun de facteurs cellulaires.
Ce document se concentre spécifiquement sur l'utilité de la combinaison de deux méthodes orthogonaux pour générer des ensembles de données d'interaction protéine-protéine: deux hybrides de levure (Y2H) et un nouveau test, test à haut débit Gaussia princeps protéines complémentation (HT-ACPG) réalisée dans les cellules de mammifères.
nt "> Une identification à grande échelle des partenaires cellulaires d'une protéine pathogène est effectuée par base de levure accouplement projections de deux hybrides de banques d'ADNc en utilisant de multiples variantes de souches de pathogènes. Un sous-ensemble de partenaires d'interaction sélectionnés sur un score de haute fiabilité statistique est plus validé dans les cellules de mammifères pour les interactions par paire avec l'ensemble des agents pathogènes les protéines variantes utilisant HT-ACPG. Cette combinaison de deux méthodes complémentaires améliore la robustesse de l'ensemble de données d'interaction, et permet l'exécution d'une analyse de l'interaction comparatifs rigoureux. Ces interactomique comparatifs constituer une stratégie fiable et puissant pour décrypter toute les imbrications pathogène-hôte.Introduction
La quantité croissante de données recueillies pour produire des cartes d'interaction protéine-protéine ouvre des perspectives pour mieux comprendre les infections pathogènes. Comme compréhension globale des infections pathogènes commence à émerger, il donne accès à la gamme des perturbations induites par les protéines pathogènes lors de la connexion du protéome humain 1. Il offre ainsi un moyen de comprendre comment les agents pathogènes manipuler la machinerie de la cellule hôte. En particulier, la cartographie de plusieurs réseaux d'interactions virus-hôte a révélé que les protéines virales cibler préférentiellement les protéines hôtes qui sont fortement connectés dans le réseau cellulaire (hubs), ou qui sont au cœur de nombreux chemins dans un réseau (protéines goulets d'étranglement) 2-4. Ces interactions permettent virus de manipuler les processus cellulaires importants, ce qui est essentiel à reproduire et produire une descendance infectieuse. Interactions cartographie comparée ont été récemment menées sur des virus apparentés dans le but d'extraire des informations relatives àpathogenèse 4. En outre, des études sur la relation hôte-pathogènes interactions paysage ont été étendues à de nombreux agents pathogènes 5. L'identification des facteurs de cellule ciblée donne un aperçu des stratégies utilisées par les agents pathogènes pour infecter les cellules et permet la détection de marqueurs potentiels pathogènes.
Le système double-hybride en levure est la méthode la plus populaire pour identifier les interactions binaires depuis le dépistage génétique est un outil efficace et sensible pour la cartographie à haut débit des interactions protéine-protéine. L'approche proposée ici améliore encore des projections de Y2H individuelles en évaluant une protéine de multiples variantes de souches de pathogènes, offrant ainsi l'accès à une vue d'ensemble comparative des interactions protéine-protéine pathogène-hôte. En outre, une limitation majeure de la levure dépistage double-hybride réside dans un taux de faux négatifs élevés, car il récupère environ 20% du total des interactions 6. Cela implique que les interactions détectées avec seulement un sous-ensemble de pathoGens variantes auraient échappé à la détection avec les autres. Par conséquent, chacun des partenaires issus de toutes les projections de deux hybrides sont rendues encore plus difficiles pour l'interaction avec la gamme complète des souches étudiées, en fournissant des ensembles de données d'interaction comparatifs. Comme il a été démontré que la combinaison de différentes méthodes augmente fortement la robustesse des ensembles de données d'interaction protéine-protéine 7, cette validation est effectuée dans des cellules de mammifères par un essai de complémentation protéique fragment nouvellement développé appelé HT-ACPG 8. Ce système à base de cellules permet la détection des interactions protéine par complémentation de la Gaussia princeps divisé luciférase et a été conçu pour être compatible avec un format à haut débit. Merci à sa technologie luminescence basée et son faible bruit de fond par rapport à d'autres test basé sur la fluorescence, HT-ACPG montre une grande sensibilité frappante.
Dans l'ensemble, cette approche constitue un moyen efficaceoutil pour générer une cartographie complète des imbrications hôte-pathogène, ce qui représente la première étape vers une compréhension globale de la cellule hôte détournement.
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Protocol
1. Levures Examens double-hybride
- Faire les solutions requises suivantes:
- Complete Out Drop synthétique (SD): dissoudre 26,7 g de la base minimale SD avec du glucose dans 1 litre d'eau. Ajouter 2 g de mélange d'acide aminé préparée comme suit: 2 g hemisulfate Adénine, 2 HCl arginine g, 2 HCl histidine g, 2 g Isoleucine, 4 g de leucine, 2 HCl lysine g, 2 g de méthionine, 3 g phénylalanine, 2 g L -sérine, 2 g de L-thréonine, le tryptophane 3 g, 2 g Tyrosine, 1,2 g uracile, 9 g de valine.
- Baisse sélective Out SD-L/-W/-H: SD contenant tous les acides aminés essentiels, sauf celles spécifié (-L:-leucine;-W:-tryptophane;-H:-histidine).
- YPGlu: Pour 1 L, poids 10 g d'extrait de levure, 10 g de Bactopeptone et 20 g de glucose. Complet avec 25 g Bacto agar pour un milieu solide.
- YCM: Idem YPGlu, mais le pH ajusté à 4,5.
- L'accouplement et la diffusion
- Utilisez portions congelées de pré-transformationed Y187 souche de levure (mating type α) contenant une banque d'ADNc cloné dans pACT2. Vérifier la viabilité des cellules en étalant des dilutions en série sur des plaques SD-L.
- Clonage de l'ORF pathogène dans pGBKT7 vecteur, et de transformer le plasmide recombinant utilisant une procédure standard dans AH109 souche de levure (mating type a).
- Propagation pGBKT7 transformées AH109 levure sur des plaques SD-W. Incuber deux jours au moins 30 ° C dans un incubateur humidifié. Les plaques peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'à ce que le dépistage du double hybride.
- Utilisation 3-aminotriazole (3-AT), un inhibiteur compétitif de l'enzyme HIS3, pour contrer le potentiel d'auto-transactivation du gène rapporteur HIS3 par les protéines de l'pathogènes. Effectuer un test d'auto-activation par la détermination de la concentration de 3-AT, ce qui empêche la croissance de la levure transformée pGBKT7 sur des plaques SD-W/-H.
- Seed 30 ml de SD-W avec quelques colonies de pGBKT7 transformé AH109. Incuber 30 heures à 30 ° C avec rotation.
- Seed 200 ml de SD-W avec les 30 mldes AH109 cultures. Incuber avec rotation autour de 20 heures à 30 ° C.
- Incuber décongelé ADNc bibliothèque transformée Y187 dans 20 ml YPGlu, incuber 10 min à 30 ° C avec rotation.
- Centrifugeuse un volume de pGBKT7 transformé AH109 culture correspondant à une quantité équivalente de Y187 cellules de levure viables pendant 5 min à 3500 rpm à 20 ° C. Retirer délicatement le surnageant et remettre le culot dans 10 ml YPGlu.
- Mélanger la levure AH109 remis en suspension avec Y187 bibliothèque contenant. Transférer dans un tube de 50 ml. Centrifuger 5 min à 3500 rpm à 20 ° C, retirer soigneusement le surnageant (fragile granulés).
- Remettre le culot en YPGlu pour obtenir un total de 1,5 ml.
- levure de propagation à 3 YCM-Agar plaques de 150 mm, 0,5 ml / plaque. Incuber 4,5 heures à 30 ° C.
- Recueillir levure accouplé à partir de plaques YCM en grattant avec un verre de râteau dans 10 ml de SD-L/-W/-H. Rincer les plaques deux fois avec 5 ml de milieu SD-L/-W/-H et la piscine.
- Centrifuger 5 min à 3500 rpm, 20° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 levure moyen SD-L/-W/-H ml.
- Étaler la levure accouplé à 10 plaques (0,5 ml / plaque) d'agar SD-L/-W/-H complétées avec la concentration appropriée de 3-aminotriazole (3-AT) déterminé dans le test d'auto-activation. Incuber à 30 ° C dans une atmosphère humidifiée pour 6-10 jours.
- Déterminer le taux de diploïdes (2n), afin d'évaluer l'efficacité de l'accouplement en étalant 250 ul de dilutions en série (10 -4 à 10 -6) de la suspension de levure accouplées sur des plaques de SD-L/-W. Incuber les plaques à 30 ° C pendant deux jours. Compter les colonies cultivées sur SD-L/-W, et en déduire le nombre diploïde totale présente dans le volume initial de levure accouplés. Signaler ce nombre diploïde de viable nombre de levure bibliothèque contenant de calculer le taux diploïde. Il devrait se situer autour de 10-25%.
- 6-10 jours après incubation à 30 ° C, prélever des colonies de levures accouplées à SD-L/-W/-H frais + 3-AT plaques. [Astuce: pour la levure dans un schéma de 8voies de 12 puits reproduisant une plaque de 96 puits de sorte qu'il sera plus facile ensuite pour le séquençage]. Laissez colonies de levures se développent pendant 4-5 jours à 30 ° C dans une atmosphère humidifiée.
- Dépistage de his3 clones positifs par PCR et séquençage
L'objectif est d'amplifier par PCR l'ORF contenue dans les pACT2 vecteurs de colonies de levures cultivées sur des plaques de SD-L/-H/-W sélectifs.- Mettez une plaque à 96 puits PCR sur la glace.
- Pour lyse des cellules de levure, ajouter 50 ul par puits d'une solution 20T zymolase (2,5 mg / ml dans 10 mM de tampon HEPES pH 7,7).
- Resuspendre doucement une colonie par puits.
- Incuber 15 minutes à 37 ° C et 15 min à 95 ° C.
- Mettez la plaque arrière sur la glace. Ajouter 50 ul d'eau distillée par puits. Bien mélanger par pipetage de haut en bas.
- Centrifuger pendant 5 min à 3500 rpm et 4 ° C.
- Amplifier par PCR de 10 ul de détecter une insertion en utilisant des amorces de recuit les deux côtés de l'ORF dérivés d'ADNc dans des vecteurs PACT2. Le protocole est gompte tenu de l'amplification de 96 colonies de levures lysées avec le ExTaq polymérase. Préparer le mélange suivant: 525 pi de tampon 10X ExTaq, 420 pl dNTP mix (2,5 mM), 10,5 ul Forward Primer (1 pg / pl), 10,5 ul amorce inverse (1 pg / pl), 31,5 ul ExTaq (5 U / pl ) et 3202,5 pi H 2 0. Distribuer 40 ul du mélange par puits dans une plaque PCR 96 puits. Ajouter 10 ul de levure lysée par puits. Effectuer une amplification comme suit: 94 ° C pendant 3 min, puis 35 cycles à 94 ° C pendant 30 sec, 60 ° C pendant 1 min, 72 ° C pendant 4 min, et se terminent par 72 ° C pendant 7 min. Exécuter 3 ul des produits de PCR sur un gel d'agarose à 1,2% pour détecter des clones positifs à la PCR. Notez que l'utilisation préfabriqué 96 et des gels d'agarose est recommandé.
[Astuce: plaque peut être conservé à -20 ° C pendant quelques mois et réutilisée pour une nouvelle PCR] - Séquencer les fragments amplifiés par PCR isolés de HIS3 clones positifs. Effectuer une analyse de BLAST pour identifier cellulaire ORF. Alignements faible confiance (E & valeurgt; 10 -10, identité <80%, longueur peptide <20 acides aminés) sont rejetés ainsi que frameshifted et codon stop prématuré contenant des séquences.
2. Bâtiment matrice pour HT-ACPG
HT-ACPG est un test basé sur des cellules de mammifères où les deux protéines pathogènes et l'hôte sont exprimés transitoirement fusionné avec des fragments complémentaires de la scission Gaussia princeps luciférase. Lors de l'interaction des partenaires, cette enzyme est reconstitué en permettant la mesure de son activité enzymatique. L'intensité de l'interaction est donc déduit un ratio de Luminescence normalisé (voir ci-dessous et la figure 1)
- Sélection des partenaires de la cellule hôte
- Sélectionnez protéines qui sont identifiés plus de trois fois dans les projections Y2H pour une validation supplémentaire dans les cellules de mammifères pour augmenter la confiance des données 9.
- Ajouter partenaires d'interaction connues des protéines pathogènes comme positive contrôles.
- Transférer dans des vecteurs compatibles HT-ACPG
- Cloner chaque protéine ORF pathogène dans un vecteur pSPICA-N2 pour générer des protéines pathogènes avec des acides aminés 110 à 185 des princeps Gaussia humanisés luciférase soudés à leur extrémité N-terminale (fusions de protéines GL2-pathogène).
- Amplifier par PCR protéine cellulaire ORF directement à partir des clones positifs Y2H ou de l'ORF autres ressources (ORFéome humain http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) et de les transférer dans des vecteurs pSPICA-N1 pour générer des protéines fusionnés à l'extrémité N-terminale avec les acides aminés 18-109 de humanisé Gaussia princeps luciférase (fusions de protéines GL1-hôte).
[Astuce: Pour le clonage à grande échelle, le système de clonage Gateway est recommandé. Dans ce cas, pour l'amplification PCR, utiliser des amorces conçues pour contenir des sites compatibles Gateway]. - Séquence tous les vecteurs d'expression. Séquences de la pSPICA-N1-N2 et pSPICApeut être trouvée dans la référence 8.
Notez que les constructions de plasmide peut être inversée, c'est à dire les protéines pathogènes dans pSPICA-N1 et accueil protéine dans pSPICA-N2.
3. High-Throughput Gaussia princeps luciférase-Based Assay de complémentation protéique (HT-ACPG)
- La transfection cellulaire
- cellules 293T de semences à 350.000 cellules / ml de DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), sans antibiotique. Distribuer 100 pl / puits dans des plaques de culture stériles blanches. Ne pas dépasser 10 plaques en une seule expérience. Laissez cellules se développent pendant 24 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2.
[Astuce:. Depuis les plasmides pSPICA contiennent une origine SV40, l'utilisation de cellules 293T permet leur réplication dans les cellules transfectées et donc conduit à la surexpression des deux fragments de luciférase] - Le lendemain, transfecter des cellules à l'aide de n'importe quel protocole de transfection approprié. Notez que pour certains réactifs de transfection, le numbre de cellules ensemencées peut être adapté. Utilisez 100 ng par puits à la fois l'agent pathogène et hôte ORF des constructions plasmidiques. Co-transfect 10 ng par puits d'une de CMV-luciférase Firefly plasmide pour normaliser l'efficacité de la transfection. Chaque point est testé en triple.
[Astuce:. Mélanges d'ADN peuvent être effectuées la veille de la transfection et conservés à -20 ° C avec des joints adhésifs] - Transfert mélange de transfection pour les plaques de cellules 293T culture. Attention à déposer délicatement le mélange de l'ADN sur les cellules, comme 293T ne sont pas fortement adhérent et se détachent facilement du fond du puits. Incuber dans un incubateur de culture cellulaire pour 24-30 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- cellules 293T de semences à 350.000 cellules / ml de DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), sans antibiotique. Distribuer 100 pl / puits dans des plaques de culture stériles blanches. Ne pas dépasser 10 plaques en une seule expérience. Laissez cellules se développent pendant 24 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- La lyse des cellules et Gaussia dosage de la luciférase
- Laver les cellules avec du PBS (100 pl / puits). Ajouter 40 tampon de lyse 1X Rénilla ul. Incuber pendant 30 min à température ambiante sous agitation.
- Économisez 10 pi de lysats de cellules dans un autre plat blance pour le dosage ultérieur de l'activité de la luciférase de luciole. Conserver à 4 ° C ou bien à -20 ° C avec joint d'étanchéité.
- Mesurer l'activité Gaussia sur les 30 pi restants de lysats de cellules en ajoutant 100 ul de réactif de dosage de la luciférase Renilla et de comptage luminescence pendant 10 secondes avec un luminomètre. Dosage d'une plaque de 96 puits prend environ une demi-heure. Effectuer la mesure avec des extraits de cellules fraîches depuis la congélation ou à long terme peut affecter l'activité Gaussia interaction médiée.
- Mesure de l'activité Firefly
- Mesurer l'activité Firefly sur le économisé 10 pi de lysats de cellules en ajoutant 50 pl de Firefly réactif de dosage de la luciférase et de comptage luminescence pendant 10 sec. Dosage d'une plaque de 96 puits prend environ une demi-heure. [Astuce: Le dosage de la luciférase Firefly peut être effectuée le lendemain sur les lysats congelés.]
- Calculs de NLR
- Pour surveiller l'interaction, estimer un rapport de Luminescence normalisé (NLR) pour chaque paire pathogène-hôte. Pour ce faire, il faut diviser l'activité de luminescence Gaussia normalisée détectée en présence de l'agent pathogène et les deux protéines de l'hôte par la somme des activités mesurées dans les puits de contrôle (figure 1 d'après la référence 8). Le NLR valeur seuil pour les interactions positives a été estimée à environ 3,5 8.
- L'analyse des données
- Effectuer classification hiérarchique utilisant le paquet statistique R. Tout d'abord, grouper les données de NLR dans des catégories, puis calculer un dendrogramme d'interaction en utilisant la méthode de liaison complète. Visualiser cettedendrogramme avec JavaTreeView 10. Calculez la distance entre dendrogramme de l'interaction et de l'arbre phylogénétique en utilisant un coefficient de corrélation de Pearson.
- Pour générer des réseaux d'interaction, sélectionnez les interactions positives de l'ensemble de données HT-ACPG et utiliser le logiciel Cytoscape 1. Extraire les degrés des protéines de l'hôte et tracer leur distribution pour accéder aux dynamiques locales réseau. Réseaux pathogènes hôte peuvent être superposées à la Interactome hôte de fournir une évaluation de l'impact global des protéines pathogènes dans le réseau cellulaire de l'hôte.
- Extraire le GO (Gene Ontology) termes associés aux facteurs cellulaires ciblés avec la base de données bioinformatiques DAVID 12 pour évaluer l'enrichissement fonctionnel de l'ensemble de données.
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Representative Results
Une des grandes forces de HT-ACPG réside dans sa sensibilité élevée, comme en témoigne l'évaluation des taux négatifs faux positifs et faux pour la protéine E2 du VPH dans la figure 2 (adapté de la référence 13). Pour déterminer le taux de faux négatifs, les interactions connues de E2 de HPV16 ont été évalués par HT-ACPG (figure 2A). Quatre des 18 interactions n'ont pas été récupérés (correspondant à un taux de faux négatifs de 22%). Les interactions faux positifs ont été mesurées à 5,8% en utilisant 12 du VPH protéines E2 contre un ensemble aléatoire de protéines cellulaires (figure 2B). En outre, la forte spécificité de la méthode est mise en évidence dans la figure 2C montre qu'une mutation ponctuelle unique connus pour interférer avec E2 liant à son compagnon de cellule BRD4 anéantit le rapport de NLR (figure 2C).
Cette approche interactomic comparative à grande échelle a été récemment appliquée avec succès à trois précoce proprotéines des virus du papillome humain (VPH): E2, E6 et E7 provenant de différents génotypes représentatifs de la diversité naturelle du VPH dans les tropismes et les pathologies 13,14. Pour chacune des protéines précoces, le regroupement hiérarchique des profils d'interaction principalement récapitule HPV de phylogénie, prouvant la robustesse de l'approche et la pertinence des ensembles de données d'interaction (Figure 3 adapté des références 13 et 14). Il peut être utilisé pour corréler des profils spécifiques d'interaction virus-hôte avec des traits pathologiques, donnant ainsi des indices de l'implication des protéines virales dans la pathogenèse. Interactions génotype-spécifiques peuvent être extraites, qui correspondent potentiellement à tropisme ou pathogènes biomarqueurs comme le montre la Figure 4 pour les protéines E6 de HPV (figure 4 après la référence 14).
En outre, des idées fonctionnelles peuvent émerger de ces analyses à grande échelle. Par exemple, dans l'étude de interactomicle HPV E2 protéines, l'analyse de l'enrichissement fonctionnel conduit à l'identification d'une éminente famille composée des facteurs de transcription cellulaires, en ligne avec le rôle principal de E2 comme un régulateur transcriptionnel viral. Il a également révélé un ciblage fonctionnel inattendu de la machinerie de trafic intracellulaire, ouvrant de nouvelles perspectives pour le rôle de E2 à HPV pathogenèse 13.
Globalement, les études inter-atomiques comparatifs effectués avec les protéines précoces de HPV améliorer considérablement la compréhension de la pathogenèse HPV en corrélant profils d'interactions spécifiques aux différences phénotypiques.
Figure 1. L'identification des interactions protéine-protéine en utilisant HT-ACPG. Tant pathogène et hôte protéines sont fusionnées à une AINCdemi-tive de la Gaussia princeps luciférase (parties GL2 et GL1, respectivement). Lorsque les protéines sont en interaction, une activité luciférase est induite par la proximité des deux moitiés de l'enzyme. L'activité luciférase Gaussia restauré est calculée à partir d'un pourcentage de Luminescence normalisé (NLR), comme indiqué sur la droite. Figure adaptée de la référence 8. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Caractéristiques HT-ACPG. (A) 18 interactions extraites de la littérature impliquant la protéine E2 de HPV16 et protéines cellulaires ont été testés par HT-ACPG afin d'estimer le taux de faux négatifs associés à ce t echnique. Le rapport NLR sont représentées par un dégradé de couleur (carte de chaleur) avec une échelle allant du noir (pas d'interaction) à la lumière (interaction forte) bleu. Quatre interactions connues n'ont pas été récupérés (flèches rouges) donnant une estimation approximative du taux de faux négatifs autour de 22%. (B) 12 HPV protéines E2 ont été testés avec 10 protéines cellulaires choisis au hasard, correspondant aux a priori les interactions négatives, afin de déterminer le taux de faux positifs de la HT-ACPG, qui a marqué autour de 5,8%. (C) L'interaction entre la protéine cellulaire BRD4 et HPV16 ou HPV18 protéines E2 est connu pour dépendre des acides aminés I73 et I77 respectivement. Lorsque ces acides aminés sont mutés, le HT-ACPG NLR baisse avec une diminution de 5-en démontrant une grande spécificité de la détection des interactions. Figure adaptée de référence 13. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Comparaison entre les dendrogrammes interaction basés expérimentales et le VPH arbres phylogénétiques. La phylogénie des HPV basé sur les protéines début E2 (A), E6 (B) ou E7 (C) les séquences sont représentées sur la gauche de chaque graphique. dendrogrammes d'interaction ont été obtenus par classification hiérarchique des profils d'interaction de chaque protéine et sont représentés sur la droite. Une congruence significative n'a été observée entre les deux types d'arbres, avec le regroupement similaire des types pathologiques (rectangles de couleur), ce qui prouve la pertinence des ensembles de données d'interaction. Figure adaptée de références 13 et 14. Cliquez ici pour agrandir la figureure.
Figure 4. Représentation schématique des principales cibles cellulaires E6. Les cibles cellulaires ont été triés en fonction de l'intensité de l'interaction et regroupés selon interagissant type de HPV. Cette représentation permet l'identification de biomarqueurs spécifiques tels que FADD, qui interagit seulement avec les protéines E6 de HPV oncogènes. Ce ciblage doit être crucial pour le caractère cancérogène de tous les HPV oncogènes et constitue donc un bon candidat pour être utilisé comme marqueur de substitution pour l'infection au VPH ou comme cible thérapeutique. Figure adaptée de référence 14.
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Discussion
Indépendamment, la levure deux essais d'interaction hybrides et les mammifères, comme la TPS déroulant, LUMIER ou MAPPIT, se sont avérés être des outils efficaces pour détecter les interactions protéine-protéine, mais sont limitées par le taux élevé de faux positifs et de faux négatifs interactions associés à ces techniques 15. En outre, les preuves sont de plus en plus que la combinaison de méthodes orthogonales augmente la fiabilité de l'ensemble de données d'interaction obtenu 7. Le développement récent de la technique HT-ACPG décrit ici a non seulement amélioré la sensibilité de détection de l'interaction binaire protéine-protéine dans les cellules de mammifères, mais a également offert la possibilité de gérer une grande quantité d'interactions à la fois.
La stratégie décrite ici permet d'améliorer la couverture des projections de Y2H individuels en sondant les interactions des multiples variantes de contrainte. Par ailleurs, un nouveau test interactions avec une méthode de détection orthogonale fournit Interac comparatifs rigoureuxtion des ensembles de données, en surmontant les limites et s'échapper artefacts inhérents à la méthode du double hybride. En effet, depuis le HT-ACPG a lieu dans les cellules de mammifères, les modifications post-traductionnelles et la localisation subcellulaire des protéines naturelles ne sont pas affectés. Notre approche permet ainsi de produire en une seule carte d'interaction d'étape qui sont améliorées par rapport à celles principalement basée sur deux hybrides de levure pour l'interaction de détection 4.
A ce stade, même si, nous vous recommandons d'être prudent lors de l'étude des protéines transmembranaires, depuis la détection d'interactions peut dépendre de la localisation des fragments Gaussia part et d'autre de la membrane. Dans ces cas, il pourrait être nécessaire de fusionner les fragments Gaussia à l'extrémité C-terminale de l'un ou des deux partenaires. En outre, l'expression de la luciférase pourrait être influencée par de nombreux paramètres tels que l'efficacité de la transfection et le nombre de cellules. Par conséquent, nous recommandons fortement Follen raison de la procédure d'étalonnage, décrite dans la section de protocole afin de tenir compte des variations expérimentales.
En utilisant des réseaux ordonnés de ORF tirés de la collection croissante de l'ORFeome humaine, nous prévoyons un point dans un proche avenir où HT-ACPG pourrait être utilisé directement comme méthode de dépistage. Cela devrait d'abord améliorer considérablement la couverture du dépistage puisque chaque paires de protéines seraient ensuite testés, et la seconde, elle devrait faciliter l'automatisation. Cependant, une expansion plus drastique à haut débit de cet essai devrait être portée par le développement d'un test in HT-ACPG vitro en utilisant des systèmes d'expression in vitro à base d'extraits de cellules humaines. Cela devrait également permettre de surveiller les interactions protéine-protéine dans un environnement biochimique contrôlée.
Enfin, les évolutions à venir devraient permettre d'améliorer la visualisation de luminescence complexe médiée dans les cellules vivantes. Dans ce cas, le HT-ACPG pourrait êtreutilisé pour détecter les interactions dynamiques dans le cadre de l'addition de la drogue ou d'inhibiteurs complexes permettant ainsi la surveillance en direct de l'interruption d'une interaction.
Dans l'ensemble, cette approche constitue un aperçu efficace pour toutes les études de l'interaction pathogène-hôte et nous pensons que les analyses comparatives interactome pourraient fournir un cadre solide pour comprendre microbe détournement de cellules hôtes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par des fonds de l'Institut Pasteur et par des subventions de la Ligue Nationale contre le Cancer (subventions R05/75-129 et RS07/75-75), l'Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC subventions A09 / 1/5031 et 4867), et l'Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 et 026 01 ANR09 MIEN). MM a été récipiendaire d'une bourse MENRT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
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