Summary
Dieser Artikel konzentriert sich auf die Identifizierung von High-Interaktion zuversichtlich Datensätze zwischen Wirt und Pathogen-Proteine mit einer Kombination aus zwei orthogonal Methoden: Hefe-Zwei-Hybrid von einem High-Throughput-Assay Interaktion in Säugerzellen namens HT-GPCA gefolgt.
Abstract
Erhebliche Anstrengungen wurden versammelt, um groß angelegte umfassende Protein-Protein-Interaktion Netzwerk Karten zu erzeugen. Dies ist maßgeblich auf die Erreger-Wirt-Beziehungen verstehen und wurde im Wesentlichen durch genetische Screenings in Hefe-Zwei-Hybrid-Systemen durchgeführt. Die jüngste Verbesserung der Protein-Protein-Wechselwirkung Erfassung durch einen Gaussia Luciferase-basierte Fragment Komplementierung Assay bietet nun die Möglichkeit, integrative Ansätze notwendig vergleichende interactomic entwickeln konsequent vergleichen Interaktion Profile von Proteinen aus verschiedenen Erreger Stammvarianten gegen einen gemeinsamen Satz von zellulären Faktoren.
Dieses Dokument konzentriert sich insbesondere auf die Nützlichkeit der Kombination von zwei orthogonalen Methoden zur Protein-Protein-Wechselwirkung Datensätzen zu generieren: Hefe Zwei-Hybrid (Y2H) und eine neue Assays mit hohem Durchsatz Gaussia princeps Protein Komplementations-Assay (HT-GPCA) in Säugetierzellen durchgeführt.
nt "> Eine groß angelegte Identifizierung zellulärer Partner eines Erregers Protein wird durch Kreuzen-basierten Hefe-Zwei-Hybrid-Screenings von cDNA-Bibliotheken mit mehreren Erreger Stammvarianten durchgeführt. Eine Teilmenge der interagierenden Partner auf einem High-Vertrauen statistischen Scoring ausgewählt ist weiter validiert in Säugerzellen für paarweisen Interaktionen mit dem ganze Reihe von Varianten Erreger Proteine mit HT-GPCA. Diese Kombination aus zwei komplementären Methoden verbessert die Robustheit der Interaktion Datenmenge und ermöglicht die Durchführung einer strengen vergleichende Analyse Interaktion. Solche vergleichende Interactomics bilden eine zuverlässige und leistungsstarke Strategie zu entziffern irgendwelche Erreger-Wirt-Wechselspiel.Introduction
Die zunehmende Menge an Daten gesammelt, um Protein-Protein-Wechselwirkung Karten erzeugen öffnet Perspektiven weiter zu verstehen Erreger Infektionen. Als globales Verständnis von pathogenen Infektionen beginnt sich abzuzeichnen, bietet es Zugriff auf den Bereich von Störungen durch Erreger Proteine induziert beim Anschließen des menschlichen Proteoms 1. Es bietet damit einen Weg zu verstehen, wie Krankheitserreger die Wirtszelle Maschinen manipulieren. Insbesondere ergab die Zuordnung von mehreren viralen-Wirt-Interaktion Netzwerke dass virale Proteine bevorzugt Zielrechner Proteine, die stark in das Mobilfunknetz angeschlossen sind (Hubs), oder die von zentraler Bedeutung für viele Pfade in einem Netzwerk (Engpässe Proteine) 2-4 sind. Diese Wechselwirkungen können Viren auf wichtige zelluläre Prozesse zu manipulieren, was instrumental zu replizieren und infektiöse Nachkommen. Vergleichende Wechselwirkungen Mapping wurden kürzlich auf verwandten Viren mit dem Ziel, Informationen bezüglich extrahieren durchgeführtPathogenese 4. Darüber hinaus haben Studien der Wirt-Erreger-Interaktionen Landschaft zu viele Krankheitserreger 5 erweitert. Die gezielte Zellfaktoren Identifizierung bietet Einblicke in die Strategien, die von Pathogenen verwendet, um Zellen zu infizieren und ermöglicht den Nachweis von pathogenen Potential Marker.
Die Hefe-Zwei-Hybrid-System ist die beliebteste Methode, um binäre Interaktionen zu identifizieren, da genetisches Screening ist eine effiziente und empfindliches Werkzeug für High-Throughput-Mapping von Protein-Protein-Interaktionen. Der hier vorgeschlagene Ansatz weiter verbessert einzelnen Y2H Screenings durch die Beurteilung ein Protein aus mehreren Krankheitserregern Stammvarianten, um so den Zugang zu einem vergleichenden Überblick über Pathogen-Wirt-Protein-Protein-Interaktionen. Darüber hinaus liegt eine große Einschränkung der Hefe-Zwei-Hybrid-Screening in einem hohen falsch-negative Rate, da sie etwa 20% der gesamten Wechselwirkungen 6 erholt. Dies bedeutet, dass Interaktionen mit nur einer Teilmenge von patho erkanntgens Varianten könnten Erkennung mit den anderen entgangen sein. Daher werden die einzelnen Partner, die aus allen Zwei-Hybrid-Screenings weiter für die Interaktion mit dem kompletten Sortiment der untersuchten Stämme herausgefordert, vergleichende Interaktion Datensätzen. Da wurde gezeigt, dass die Kombination verschiedener Methoden stark erhöht die Robustheit von Protein-Protein-Wechselwirkung Datensätze 7 wird diese Validierung in Säugetierzellen durch ein neu entwickeltes Protein-Fragment Komplementierung Assay genannt HT-GPCA 8 durchgeführt. Diese Zell-basierte System ermöglicht die Detektion von Protein-Interaktionen durch Komplementierung des Gaussia princeps aufgeteilt Luciferase und wurde entwickelt, um die Kompatibilität mit einem Hochdurchsatz-Format. Dank seiner Lumineszenz-basierten Technologie und deren geringem Hintergrundrauschen mit anderen Fluoreszenz-basierten Assay verglichen, zeigt HT-GPCA eine auffallend hohe Empfindlichkeit.
Insgesamt stellt dieser Ansatz eine effizienteWerkzeug, um eine umfassende Kartierung von Wirt-Pathogen-Zwischenspiele, die den ersten Schritt in Richtung einer globalen Verständnis der Wirtszelle Entführung repräsentiert.
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Protocol
1. Hefe-Zwei-Hybrid-Screenings
- Nehmen Sie die folgenden erforderlichen Lösungen:
- Komplette Synthetic Drop Out (SD): Man löst 26,7 g minimal SD Basis mit Glucose in 1 l Wasser. 2 g der Aminosäure-Mischung wie folgt hergestellt: 2 g Adenin hemisulfate, 2 g Arginin HCl, 2 g Histidin HCl, 2 g Isoleucin, 4 g Leucin, 2 g Lysin HCl, 2 g Methionin, Phenylalanin 3 g, 2 g L -Serin, 2 g L-Threonin, 3 g Tryptophan, Tyrosin 2 g, 1,2 g Uracil, 9 g Valin.
- Selective Drop Out SD-L/-W/-H: SD enthält alle essentiellen Aminosäuren außer den angegebenen (-L:-Leucin;-W:-Tryptophan;-H:-Histidin).
- YPGLU: Für 1 L, Gewicht 10 g Hefeextrakt, 10 g Bacto-Pepton und 20 g Glucose. Komplett mit 25 g Bactoagar für feste Medien.
- YCM: Wie YPGLU, aber pH-Wert auf 4,5 eingestellt.
- Passende und Verbreitung
- Verwendung eingefroren Aliquots von pre-Transformationed Hefestamm Y187 (Paarungstyp α), die eine cDNA-Bibliothek in pACT2 geklont. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch Ausplattieren serielle Verdünnungen auf SD-L-Platten.
- Klonen Sie die Erreger in ORF pGBKT7 Vektor, und verwandeln das rekombinante Plasmid mit einem Standard-Verfahren in Hefestamm AH109 (Paarungstyp a).
- Spread-pGBKT7 transformierten AH109 Hefe auf SD-W Platten. Inkubieren mindestens zwei Tage 30 ° C in einem befeuchteten Inkubator. Die Platten können bei 4 ° C bis zum Zwei-Hybrid-Screening gespeichert werden.
- Mit 3-Aminotriazol (3-AT), einem kompetitiven Inhibitor des HIS3 Enzym, um das Potenzial selbst Transaktivierung des HIS3 Reportergens durch die Erreger 'Proteinen entgegenwirken. Führen Sie eine automatische Aktivierung Test durch die Bestimmung der Konzentration von 3-AT, die das Wachstum von pGBKT7-transformierten Hefezellen verhindert auf SD-W/-H Platten.
- Seed 30 ml SD-W mit wenigen Kolonien pGBKT7 transformierten AH109. Inkubation 30 h bei 30 ° C mit einer Drehung.
- Seed 200 ml SD-W mit 30 mlder AH109 Kulturen. Inkubation mit Drehung um 20 h bei 30 ° C.
- Aufgetaut cDNA-transformierten Y187 in 20 ml YPGLU, Inkubation 10 min bei 30 ° C unter Rotation inkubiert.
- Zentrifuge ein Volumen von pGBKT7 transformierten AH109 Kultur entsprechend einer äquivalenten Menge von lebensfähigen Hefezellen Y187 für 5 min bei 3500 UpM bei 20 ° C. Vorsichtig zurückziehen den Überstand und Pellet in 10 ml YPGLU.
- Mischen Sie die resuspendierten AH109 Hefe mit Y187 enthaltende Bibliothek. Übertragen in einer 50 ml Tube. Zentrifuge für 5 min bei 3.500 rpm bei 20 ° C, vorsichtig zurückziehen Überstand (fragile Pellet).
- Pellet in YPGLU um insgesamt 1,5 ml.
- Spread-Hefe auf 3 YCM-Agar 150 mm Platten, 0,5 ml / Platte. Inkubation 4,5 h bei 30 ° C.
- Sammeln gepaart Hefe YCM Platten durch Abkratzen mit einem Rechen Glas in 10 ml SD-L/-W/-H. Spülen Sie die Platten zweimal mit 5 ml Medium SD-L/-W/-H und Pool.
- Zentrifuge 5 min bei 3.500 rpm, 20° C. Überstand verwerfen und Pellet resuspendieren die Hefe in 5 ml Medium SD-L/-W/-H.
- Verbreiten gepaart Hefe auf 10 Platten (0,5 ml / Platte) von SD-L/-W/-H Agar mit der entsprechenden Konzentration von 3-Aminotriazol (3-AT) in der Auto-Aktivierung Test bestimmt ergänzt. Inkubation bei 30 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre für 6-10 Tage.
- Bestimmen Sie die diploid (2n)-Rate um Paarungseffizienz durch die Verbreitung 250 ul serielle Verdünnungen (10 -4 bis 10 -6) der gesteckten Hefesuspension auf SD-L/-W Platten bewerten. Platten bei 30 ° C für zwei Tage. Graf Kolonien auf SD-L/-W gewachsen, und daraus die gesamte diploide Zahl in der anfänglichen Volumen gepaart Hefe. Melden diploide Zahl lebensfähiger Bibliothek enthaltende Hefe, um den diploiden zu berechnen. Es sollte reichen um 10-25%.
- 6-10 Tage nach Inkubation bei 30 ° C, holen gepaart Hefekolonien in frischen SD-L/-W/-H + 3-AT-Platten. [Tipp: Um die Hefe in einem Schema von 8Gassen von 12 Wells Wiedergabe eines 96-Well-Platte, so dass es einfacher sein wird später für die Sequenzierung]. Lassen Hefekolonien wachsen für 4-5 Tage bei 30 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre.
- Screening von his3 positive Klone durch PCR und Sequenzierung
Das Ziel ist, die PCR zu amplifizieren ORF in den pACT2 Träger Hefekolonien auf selektiven Platten gezüchtet SD-L/-H/-W enthalten.- Legen Sie eine 96-Well-PCR-Platte auf Eis.
- Um Hefezellen lysieren, fügen Sie 50 ul pro Well einer Zymolase 20T Lösung (2,5 mg / ml in 10 mM HEPES-Puffer pH 7.7).
- Vorsichtig resuspendieren eine Kolonie pro Vertiefung.
- Inkubieren 15 min bei 37 ° C und 15 min bei 95 ° C.
- Setzen Sie die Platte wieder auf Eis. In 50 ul destilliertem Wasser pro Vertiefung. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren.
- Zentrifuge für 5 min bei 3.500 rpm und 4 ° C.
- PCR amplifizieren 10 ul eines Einsatzes unter Verwendung der Primer Annealing beiden Seiten des ORF von cDNA in pACT2 abgeleitete Vektoren zu detektieren. Das Protokoll ist gIven zur Amplifikation von 96 lysierte Hefe Kolonien mit dem ExTaq Polymerase. Bereiten Sie die folgende Mischung: 525 ul 10x ExTaq Puffer, 420 ul dNTPs Mix (2,5 mm), 10,5 ul Forward Primer (1 ug / ul), 10,5 ul Reverse Primer (1 ug / ul), 31,5 ul ExTaq (5 U / ul ) und 3202,5 ul H 2 0. Verteilen Sie 40 ul der Mischung pro Vertiefung in einer 96-Well PCR-Platte. In 10 ul lysierte Hefe pro Vertiefung. Für die Amplifikation wie folgt: 94 ° C für 3 min, dann 35 Zyklen bei 94 ° C für 30 sec, 60 ° C für 1 min, 72 ° C für 4 min, und am Ende mit 72 ° C für 7 min. Lauf 3 ul der PCR-Produkte auf einem 1,2% Agarosegel der PCR-positive Klone zu detektieren. Beachten Sie, dass mit pre-cast 96 gut Agarosegelen empfohlen.
[Tipp: Platte kann bei -20 ° C für ein paar Monate gelagert werden und für neue PCR wieder verwendet] - Sequence die PCR-Fragmente aus HIS3 positive Klone isoliert. Führen Sie eine BLAST-Analyse der zellulären ORF zu identifizieren. Low-Vertrauen Ausrichtungen (E & Wertgt; 10 -10, Identität <80%, Peptidlänge <20 Aminosäuren) werden verworfen sowie frameshifted und vorzeitiges Stopp-Codon Sequenzen enthält.
2. Matrix Gebäude für HT-GPCA
HT-GPCA eine Säugerzelle-basierten Test, bei dem beide Erreger und Wirt transient exprimierte Proteine fusioniert sind, um komplementäre Fragmente des geteilten Gaussia princeps Luciferase. Nach Interaktion der Partner wird dieses Enzym rekonstituiert so das Maß der Enzymaktivität. Die Wechselwirkung Intensität wird so von einer normalisierten Lumineszenz-Wert (siehe unten und Abbildung 1) abgeleitet
- Auswahl der Wirtszelle Partner
- Wählen Proteine, die mehr als drei Mal in den Y2H Screenings zur weiteren Validierung in Säugerzellen identifiziert werden, um die Datenmenge Vertrauen 9 erhöhen.
- In bekannten Interaktionspartner der Erreger Proteine als positive Kontrollen.
- Übertragen in HT-GPCA kompatiblen Vektoren
- Klonen jeden Erreger Protein ORF in einer pSPICA-N2 Vektor um Erreger Proteine mit Aminosäuren 110-185 der humanisierten Gaussia princeps Luciferase an ihrem N-Terminus (GL2-Pathogen-Protein-Fusionen) fusioniert zu generieren.
- PCR amplifizieren zelluläre Protein ORF direkt von den Y2H positive Klone oder aus anderen Quellen ORF (Human ORFeome http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) und sie in pSPICA-N1-Vektoren, Proteine am N-Terminus fusioniert mit erzeugen die Aminosäuren 18 bis 109 der humanisierte Gaussia princeps Luciferase (GL1-Host-Protein-Fusionen).
[Tipp: Für großangelegte Klonen, die Gateway-Klonen wird empfohlen. In diesem Fall für die PCR-Amplifikation, verwenden Primer entwickelt, um Gateway-kompatible Websites enthalten]. - Sequence alle Expressionsvektoren. Sequenzen des pSPICA-N1-N2 und pSPICAkönnen in Bezug 8 gefunden werden.
Beachten Sie, dass Plasmidkonstrukte umgekehrt werden kann, dh Erreger Proteine in pSPICA-N1-und Host-Protein in pSPICA-N2.
3. High-Throughput Gaussia princeps Luciferase-Based Protein Komplementierung Assay (HT-GPCA)
- Zelltransfektion
- Seed 293T-Zellen bei 350.000 Zellen / ml von DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), die kein Antibiotikum. Verteilen Sie 100 ul / Vertiefung in sterile weiße Kultur Platten. Nicht mehr als 10 Platten in einem einzigen Experiment. Lassen Zellen für 24 h wachsen bei 37 ° C mit 5% CO 2.
[Tip:. Da die pSPICA Plasmide einen SV40 enthalten, ermöglicht die Verwendung von 293T-Zellen, die die Replikation in transfizierten Zellen und führt so zu Überexpression der beiden Luciferase-Fragmente] - Am folgenden Tag, transfizierbaren Zellen unter Verwendung eines geeigneten Transfektionsprotokoll. Beachten Sie, dass für bestimmte Transfektionsreagenzien, die nuahl von Zellen ausgesät müssen möglicherweise angepasst werden. Mit 100 ng pro Vertiefung sowohl der Erreger und Wirt ORF Plasmidkonstrukte. Co-Transfektion von 10 ng pro Vertiefung einer von CMV-Glühwürmchenluciferase Plasmid für Transfektionseffizienz zu normalisieren. Jeder Punkt wird in dreifacher Ausführung getestet.
[Tip:. DNA Mischungen können den Tag vor der Transfektion durchgeführt werden und bei -20 ° C mit Klebedichtungen] - Übertragen Transfektionsgemisch zu den Platten kultivierten 293T-Zellen. Seien Sie vorsichtig, um sanft die Hinterlegung der DNA-Gemisch auf die Zellen, wie 293T nicht stark haftend und leicht aus dem Boden des Bohrlochs zu lösen. Inkubation in einer Zellkultur-Inkubator für 24-30 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Seed 293T-Zellen bei 350.000 Zellen / ml von DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), die kein Antibiotikum. Verteilen Sie 100 ul / Vertiefung in sterile weiße Kultur Platten. Nicht mehr als 10 Platten in einem einzigen Experiment. Lassen Zellen für 24 h wachsen bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Zelllyse und Gaussia Luciferase Dosierung
- Waschen der Zellen mit PBS (100 ul / well). In 40 ul 1X Renilla Lysepuffer. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur unter Rühren.
- Sparen Sie 10 ul Zelllysaten in einem anderen weißen plate für die nachfolgende Dosis der Firefly-Luciferase-Aktivität. Lagerung bei 4 ° C oder alternativ bei -20 ° C mit Dichtung.
- Messen Sie die Gaussia Aktivität auf den verbleibenden 30 ul Zelllysaten durch Zugabe von 100 ul Renilla Luciferase Assay-Reagenz und Zählen Lumineszenz für 10 sec mit einem Luminometer. Dosierung einer 96-Well-Platte dauert etwa eine halbe Stunde. Führen Sie eine Messung mit frischem Zellextrakten seit Einfrieren oder Langzeitlagerung Interaktion vermittelte Gaussia Aktivität beeinflussen können.
- Messung der Firefly-Aktivität
- Messen Sie die Firefly-Aktivität auf die gespeicherte 10 ul Zelllysaten durch Zugabe von 50 ul Firefly Luciferase Assay-Reagenz und Zählen Lumineszenz für 10 sec. Dosierung einer 96-Well-Platte dauert etwa eine halbe Stunde. [Tipp: Die Dosierung der Firefly Luciferase durchgeführt am Tag nach der auf gefrorenen Lysate werden.]
- NLR Berechnungen
- Um die Interaktion zu überwachen, schätzen eine normalisierte Lumineszenz Ratio (NLR) für jedes Pathogen-Wirt-Paar. Um dies zu tun, teilen die normierte Gaussia Lumineszenz-Aktivität in Anwesenheit von Erreger und Wirt-Proteine durch die Summe der Aktivitäten in Kontroll-Wells gemessen (Abbildung 1 von 8 Referenz angepasst) erkannt. Die NLR cut-off Wert für positive Wechselwirkungen wurde geschätzt auf rund 3,5 8 sein.
- Datenanalyse
- Führen hierarchisches Clustering unter Verwendung der R-Statistik-Paket. Erstens, die Gruppe NLR Daten in Kategorien, berechnen dann eine Interaktion mit Dendrogramms die komplette Verknüpfung Verfahren. Visualisieren Sie dieseDendrogram mit JavaTreeView 10. Berechnen Sie den Abstand zwischen Interaktion Dendrogramm und phylogenetische Baum mit einem Pearson Korrelationskoeffizient.
- Um die Interaktion Netzwerke generieren, wählen Sie die positiven Wechselwirkungen von der HT-GPCA Datenmenge und verwenden Sie die Software Cytoscape 1. Extrahieren Sie den Grad der Host-Proteine und zeichnen ihre Verteilung auf die lokale Dynamik Netzwerk zugreifen. Host-Erreger Netzwerke können an den Host interactome überlagert werden, um eine Beurteilung der globalen Auswirkungen der Erreger Proteine in den Host zellulären Netzwerk bereitzustellen.
- Entpacken Sie die GO (Gene Ontology) Begriffe mit den gezielten zellulären Faktoren mit dem DAVID Bioinformatik Datenbank 12, um die funktionelle Bereicherung des Datensatzes beurteilen verbunden.
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Representative Results
Eine große Stärke von HT-GPCA liegt in seiner hohen Empfindlichkeit, durch die Bewertung der falsch-positiven und falsch negativen Ergebnisse für die HPV E2-Protein in Abbildung 2 (nach Lit. 13) dargestellt. Um die falsch-negative Rate zu bestimmen, wurden von bekannten Wechselwirkungen von HPV16 E2 von HT-GPCA (2A) beurteilt. Vier von 18 Wechselwirkungen wurden nicht wiederhergestellt (entspricht einer 22% falsch-negative Rate). Die falsch positive Interaktionen wurden gemessen, um 5,8% unter Verwendung von 12 HPV E2-Proteine gegen einen zufälligen Satz von zellulären Proteinen (2B) sein. Darüber hinaus ist die starke Spezifität des Verfahrens in 2C hervorgehoben, und dass eine einzige Punktmutation bekanntermaßen mit E2-Bindung an Zellen Partner BRD4 stören die NLR Verhältnis (2C) vernichtet.
Diese groß angelegte vergleichende interactomic Ansatz wurde kürzlich erfolgreich auf drei frühen pro angewendetProteine der humanen Papillomaviren (HPV): E2, E6 und E7, die aus unterschiedlichen Genotypen Vertreter der HPV natürliche Vielfalt in Tropismen und Pathologien 13,14. Für jede der frühen Proteine, hierarchische Clusterbildung der Interaktion Profile meist HPV rekapituliert Phylogenie, beweisen die Robustheit des Ansatzes und die Relevanz der Interaktion Datensätze (Abbildung 3 von Artikeln 13 und 14 angepasst). Es kann verwendet werden, um spezifische Virus-Wirt-Interaktion Profile mit pathologische Züge korrelieren, wodurch Hinweise auf die Beteiligung von viralen Proteinen in der Pathogenese werden. Genotyp-spezifische Wechselwirkungen können extrahiert werden, was möglicherweise zu Tropismus oder pathogenen Biomarker wie in Abbildung 4 für die E6-Proteine von HPV (Abbildung 4 aus Lit. 14 angepasst) gezeigt entsprechen.
Darüber hinaus können funktionelle Erkenntnisse aus solchen groß angelegten Analysen entstehen. Zum Beispiel, in dem interactomic Studieder HPV E2-Proteinen, die funktionelle Analyse Anreicherung führte zur Identifizierung einer prominenten Familie aus der zellulären Transkriptionsfaktoren, im Einklang mit der Hauptaufgabe der E2 als viralen Transkriptionsfaktor. Es zeigte auch einen unerwarteten funktionale Ausrichtung des intrazellulären Transport Maschinen, die Eröffnung neuer Perspektiven für die Rolle von E2 in HPV 13 Pathogenese.
Insgesamt sind die vergleichenden Studien mit den interatomaren HPV frühen Proteine durchgeführt erheblich verbessern das Verständnis der Pathogenese HPV durch Korrelation spezifischen Wechselwirkungen Profile phänotypische Unterschiede.
Abbildung 1. Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit HT-GPCA. Beide Erreger und Wirt Proteine werden zu einer verschmolzen inactive Hälfte des Gaussia princeps Luciferase (GL2 GL1 und Teile, jeweils). Wenn die Proteine interagieren, eine Luciferaseaktivität ist durch die Nähe der beiden Hälften des Enzyms induziert. Die restaurierte Gaussia Luciferaseaktivität von einer normalisierten Lumineszenz Ratio (NLR) wird berechnet als auf der rechten. Abbildung aus Lit. 8 angepasst dargestellt. Klicken Sie hier um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. HT-GPCA Eigenschaften. (A) 18 Interaktionen aus der Literatur, die die E2-Protein von HPV16 und zelluläre Proteine extrahiert wurden von HT-GPCA getestet, um die falsch-negative Rate mit diesem T verbunden schätzen echnik. Der NLR-Verhältnis als einem Farbverlauf (Heatmap) mit einer Skala von schwarz (keine Interaktion) bis blau (starke Wechselwirkung) leuchtet vertreten. Vier bekannte Wechselwirkungen wurden nicht wiederhergestellt (rote Pfeile), was eine grobe Schätzung der falsch-negative Rate um 22%. (B) 12 HPV E2-Proteine wurden mit 10 zufällig ausgewählten zellulären Proteinen, entsprechend einer priori negative Wechselwirkungen getestet, um die Rate falsch-positiver der HT-GPCA, die um 5,8% erzielt bestimmen. (C) Die Interaktion zwischen dem BRD4 zelluläre Protein und HPV16 oder HPV18 E2-Proteinen ist bekannt, dass an den Aminosäuren I73 und I77 bzw. abhängen. Wenn diese Aminosäuren mutiert sind, fällt die HT-GPCA NLR mit einem 5-time Rückgang zeigt eine hohe Spezifität der Nachweis von Interaktionen. Abbildung aus Lit. 13 angepasst. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 3. Vergleich zwischen experimentellen Interaktion basierende Dendrogramme und HPV Stammbäumen. Die Stammesgeschichte der HPV auf der frühen Proteine E2 (A), E6 (B) oder E7 (C)-Sequenzen basieren auf der linken Seite der einzelnen Graphen dargestellt. Interaction Dendrogramme wurden durch hierarchisches Clustern der Wechselwirkungsprofile jedes Proteins erhalten und auf der rechten Seite dargestellt. Eine signifikante Übereinstimmung wurde zwischen beiden Baumarten beobachtet, mit ähnlichen Häufung der pathologischen Typen (farbige Rechtecke), Nachweis der Relevanz der Interaktion Datensätzen. Abbildung von Referenzen 13 und 14 angepasst. Klicken Sie hier, um größere Bild zu sehenure.
Abbildung 4. Schematische Darstellung der E6 wichtigsten zellulären Targets. Zellulären Targets wurden basierend auf der Wechselwirkung Intensität sortiert und gruppiert nach interagierenden HPV-Typ. Diese Darstellung ermöglicht die Identifizierung spezifischer Biomarker wie FADD, die nur in Wechselwirkung mit den E6 Proteine der onkogenen HPV. Solche Targeting muss entscheidend sein für die krebserzeugende Eigenschaft aller onkogenen HPV und somit ein guter Kandidat, um entweder als Surrogat-Marker für HPV-Infektion oder als therapeutisches Ziel verwendet werden. Abbildung aus Lit. 14 angepasst.
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Discussion
Unabhängig, Hefe-Zwei-Hybrid-und Säugetierzellen Interaktionsassays wie GST-Pulldown, LUMIER oder Mappit, haben sich als effektive Werkzeuge, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen sein, aber durch die hohe Rate der falsch-positiven und falsch-negativen beschränkt Wechselwirkungen mit diesen Techniken 15 verbunden. Darüber hinaus ist Beweis wächst, dass die Kombination von orthogonal Verfahren erhöht die Zuverlässigkeit der erhaltenen Wechselwirkung Datensatz 7. Die jüngste Entwicklung der HT-GPCA hier beschriebene Technik hat nicht nur die Empfindlichkeit der Erfassung binärer Protein-Protein-Wechselwirkung in Säugerzellen verbessert, sondern auch die Möglichkeit, eine große Menge von Wechselwirkungen auf einmal verarbeiten angeboten.
Die hier beschriebene Strategie zur Verbesserung der Reichweite einzelner Y2H Screenings durch Sondieren Wechselwirkungen mehrerer Stammvarianten. Außerdem Wiederholungsprüfung Wechselwirkungen mit einer orthogonal Nachweismethode bietet strengere vergleichende Interaktionention Datensätze, durch die Überwindung Einschränkungen und Flucht Artefakte inhärenter Teil des Zwei-Hybrid-Methodik. In der Tat, da HT-GPCA erfolgt in Säugerzellen sind die post-translationale Modifikationen und natürliche subzelluläre Lokalisation der Proteine unberührt. Unser Ansatz kann somit in einem einzigen Schritt Interaktion Karten, die verbessert werden, wenn zu denen in erster Linie auf Hefe-Zwei-Hybrid für die Interaktion sensing 4 basierend verglichen werden produzieren.
An diesem Punkt, obwohl, empfehlen wir es vorsichtig, wenn das Studium trans-Membranproteine, da der Nachweis von Wechselwirkungen auf die Lokalisation der Gaussia Fragmente auf beiden Seiten der Membran abhängen kann. In diesen Fällen kann es notwendig sein, die Gaussia Fragmente in der C-terminalen Ende von einem oder beiden Partnern zu verschmelzen. Darüber hinaus könnte die Luciferase-Expression durch eine Vielzahl von Parametern wie Transfektionseffizienz und die Zellzahl beeinflusst werden. Deshalb möchten wir empfehlen follAufgrund der Normalisierung Verfahren im Protokoll Abschnitt beschrieben, um zu berücksichtigen, experimentellen Variationen nehmen.
Durch die Verwendung von geordneten Arrays von ORF von der zunehmenden Sammlung des Human ORFeome genommen sehen wir einen Punkt in der nahen Zukunft, wo HT-GPCA könnte direkt als Screening-Verfahren verwendet werden. Dies sollte zunächst drastisch verbessern das Screening Berichterstattung seit Jedes Protein-Paare dann getestet werden würde, und zweitens sollte es erleichtern die Automatisierung. Allerdings sollte ein drastischer Hochdurchsatz Expansion dieses Assays durch die Entwicklung eines in vitro-HT-GPCA Assay mit in vitro Expressionssystemen auf die menschliche Zelle Extrakten gebracht werden. Hieraus können Protein-Protein-Interaktionen in einer kontrollierten Umgebung zu überwachen biochemischen.
Schließlich sind die kommenden Entwicklungen zu erwarten, um die Visualisierung von komplexen vermittelte Lumineszenz in lebenden Zellen zu verbessern. In diesem Fall könnte die HT-GPCA seinzur dynamischen Wechselwirkungen in Zusammenhang mit dem Zusatz von Medikamenten oder komplexe Inhibitoren wodurch Live-Überwachung der Unterbrechung einer Wechselwirkung zu detektieren.
Insgesamt stellt dieser Ansatz eine effiziente Gliederung für alle Studien von Pathogen-Wirt-Wechselwirkungen und wir spüren, dass vergleichende Analysen interactome konnte einen soliden Rahmen bieten, um Mikrobe Entführung von Wirtszellen zu verstehen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch Mittel aus dem Institut Pasteur und durch Zuschüsse aus dem Ligue nationale contre le Cancer (Zuschüsse R05/75-129 und RS07/75-75), der Vereinigung pour la Recherche sur le Cancer (Zuschüsse ARC A09 / unterstützt 1/5031 und 4867) und die Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 und 026 01 ANR09 MIEN). MM war ein Empfänger einer MENRT Gemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
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