Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Published: July 18, 2013 doi: 10.3791/50404
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

Abstract

מאמצים משמעותיים נאספו ליצירת מפות רשת אינטראקציה בין חלבונים מקיפות בקנה מידה גדולה. זו היא סייעה להבין את יחסי פתוגן-מארחים ולמעשה בוצעה על ידי הקרנות גנטיות בשמרים שתי מערכות היברידיות. השיפור האחרון של זיהוי אינטראקציה בין חלבונים על ידי assay שלמת בר מבוסס לוציפראז Gaussia מציע כעת את ההזדמנות לפתח גישות interactomic השוואתיות אינטגרטיביים הדרושים על מנת להשוות בקפדנות פרופילי אינטראקציה של חלבונים מגרסות זן פתוגן שונים נגד מערך משותף של גורמים הסלולר.

מאמר זה מתמקד באופן ספציפי את השירות של שילוב של שתי שיטות מאונך ליצירת מערכי נתונים אינטראקציה בין חלבונים: שמרי שני היברידי (Y2H) ובדיקה חדש, assay תפוקה גבוהה Gaussia Princeps חלבון שלמה (HT-GPCA) שבוצע בתאי יונקים.

NT "> זיהוי בקנה מידה גדול של שותפים הסלולר של חלבון הפתוגן מבוצע על ידי הזדווגות מבוססת שמרי הקרנות שתי היברידיות של ספריות cDNA באמצעות גרסאות זן פתוגן מרובות. משנה של שותפים באינטראקציה שנבחרו על ניקוד ברמת הוודאות גבוהה הוא סטטיסטי נוסף תוקף בתאי יונקים לאינטראקציות חכמות זוג עם המערך השלם של חלבוני גרסאות פתוגן באמצעות HT-GPCA. זה שילוב של שתי שיטות משלימות משפר את חוסנו של מערך יחסי הגומלין, ומאפשר ביצועים של ניתוח השוואתי אינטראקציה מחמירה. interactomics השוואתי כאלה מהווה אסטרטגיה אמינה וחזקה לפענח כל interplays הפתוגן-מארח.

Introduction

הכמות הולכת והגדלה של נתונים שנאספו כדי ליצור מפות אינטראקציה בין חלבונים פותחת אופקים כדי להבין עוד יותר זיהומי הפתוגן. ככל שהבנה הגלובלית של זיהומי פתוגן מתחילה להתגלות, הוא מספק גישה למגוון של הפרעות הנגרמות על ידי חלבוני גורמי מחלה בעת חיבור proteome האנושי 1. זה ובכך מציע דרך כדי להבין איך לתפעל את מכונות פתוגנים התא המארחת. בפרט, המיפוי של מספר רשתות אינטראקציה ויראלי-מארחות גילה כי חלבונים נגיפיים מעדיפים למקד חלבונים מארחים שהם מאוד מחוברים ברשת הסלולרית (רכזות), או שהם מרכזיים בנתיבים רבים ברשת (חלבוני צווארי בקבוק) 2-4. אינטראקציות אלה מאפשרים לוירוסים כדי לתפעל תהליכים תאיים חשובים, אשר היא סייע לשכפל ולייצר צאצאים מדבקים. מיפוי אינטראקציות השוואתי שנערכו לאחרונה על וירוסים הקשורים במטרה לחלץ מידע ביחס לפתוגנזה 4. יתר על כן, מחקרים של הנוף מארח פתוגנים האינטראקציות שהורחבו לפתוגנים רבים 5. זיהוי הגורמים ממוקד התא מספק תובנות האסטרטגיות בשימוש על ידי פתוגנים להדביק תאים ומאפשר זיהוי של סמנים פתוגניים פוטנציאליים.

המערכת דו היברידי השמרים היא השיטה הפופולרית ביותר לזיהוי אינטראקציות בינאריים מאז סריקות גנטיות היא כלי יעיל ורגיש למיפוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות בין חלבונים. הגישה מוצעת כאן עוד יותר משפר את הקרנות Y2H בודדות על ידי הערכת חלבון של גרסאות זן פתוגנים רבות, המספק גישה לסקירה השוואתית של אינטראקציות בין חלבונים הפתוגן-מארחים וכך. יתר על כן, מגבלה עיקרית של הקרנת שתי היברידי שמרים טמון בשיעור שגוי שלילי גבוה, מאחר שהוא מתאושש כ -20% מאינטראקציות סה"כ 6. משמעות הדבר הוא כי אינטראקציות עם אותרו רק קבוצת משנה של פתיוגרסאות גנס אולי חמקו מזיהוי עם האחרים. לכן, שותפים בודדים המתעוררים מכל ההקרנות של שתי ההיברידיות מאותגרים עוד יותר לאינטראקציה עם מגוון רחב של זנים למדו מלא, ומספקים מערכי נתונים השוואתיים אינטראקציה. מאז שהוכיח כי שילוב מתודולוגיות שונות מגביר משמעותי את החוסן של מערכי נתונים אינטראקציה בין חלבונים 7, אימות זה מבוצעת בתאי יונקים ידי assay שלמת חלבון שבר חדש שפותח בשם HT-GPCA 8. מערכת מבוססת תא זה מאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון על ידי שלמה של Princeps Gaussia לפצל לוציפראז ותוכנן כך שיתאים לפורמט תפוקה גבוהה. הודות לטכנולוגיה המבוססת על הארה שלה ורעש הרקע הנמוך שלה בהשוואה לassay הקרינה מבוססת אחרים, HT-GPCA מציג רגישות גבוהה להפליא.

באופן כללי, גישה זו מהווה יעילהכלי ליצירת מיפוי מקיף של interplays מאכסן לפתוגן, המייצג את הצעד הראשון לקראת הבנה גלובלית של התא המארח חטיפה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שתי הקרנות היברידיות-שמרים

  1. הפוך את פתרונות הדרושים הבאים:
    1. מתוך סינטטי מלא בגלילה (SD): לפזר 26.7 גרם של בסיס SD מינימאלי עם גלוקוז ב1 ליטר של מים. הוסף 2 גרם של תערובת חומצת אמינו מוכנה כדלקמן: hemisulfate 2 גרם אדנין, 2 גרם ארגינין הידרוכלוריד, 2 גרם היסטידין HCl, 2 גרם Isoleucine, 4 גרם לאוצין, 2 גרם ליזין הידרוכלוריד, 2 גרם מתיונין, 3 גרם פנילאלנין, 2 גרם L -סרין, אורציל 2 גרם L-תראונין, 3 גרם טריפטופן, טירוזין G 2, 1.2 גר ', 9 גרם Valine.
    2. זרוק סלקטיבית מתוך SD-L/-W/-H: SD המכיל כל חומצות אמינו חיוניות, למעט אלו שצוינו (-L:-אוצין;-W:-טריפטופן;-H:-היסטידין).
    3. YPGLU: עבור 1 ליטר, במשקל 10 גרם של תמצית שמרים, 10 גרם של Bacto Peptone ו20 גרם של גלוקוז. השלם עם 25 גרם אגר Bacto לתקשורת מוצקה.
    4. YCM: כמו YPGLU, אבל מותאם לרמת חומציות 4.5.
  2. הזדווגות ומתפשט
    1. השתמש aliquots הקפוא של טרום ההתמרהזן אד Y187 שמרים (הזדווגות הסוג α) המכיל ספריית cDNA המשובטת בpACT2. בדקו כדאיות תא על ידי ציפוי דילולים סדרו על צלחות SD-L.
    2. לשכפל ORF הפתוגן לתוך pGBKT7 וקטור, ולהפוך את פלסמיד רקומביננטי באמצעות הליך סטנדרטי לזן שמרי AH109 (סוג הזדווגות).
    3. מורחים pGBKT7-שינו AH109 שמרים על צלחות SD-W. דגירה לפחות יומיים 30 ° C בחממת humidified. ניתן לאחסן צלחות על 4 מעלות צלזיוס עד להקרנת שתי ההיברידית.
    4. השתמש 3-aminotriazole (3-AT), מעכב תחרותי של אנזים HIS3, כדי לנטרל את transactivation עצמי הפוטנציאל של גן הכתב HIS3 על ידי החלבונים של פתוגנים. בצע בדיקה אוטומטי הפעלה על ידי קביעת הריכוז של 3-AT, אשר מונע צמיחה של שמרי pGBKT7-הופכים על צלחות SD-W/-H.
    5. מיליליטר זרע 30 של SD-W עם כמה מושבות של AH109 pGBKT7-טרנספורמציה. דגירה 30 שעות ב 30 ° C עם רוטציה.
    6. זרעים 200 מ"ל של SD-W עם 30 מ"למAH109 התרבויות. דגירה עם סיבוב סביב 20 שעות ב 30 ° C.
    7. דגירה מופשר Y187-ספרייה הפך cDNA ב20 מ"ל YPGLU, דגירה 10 דקות בשעה 30 ° C עם רוטציה.
    8. צנטריפוגה נפח pGBKT7-שינתה AH109 התרבות מקבילה לסכום שווה ערך של תאי שמרי Y187 קיימא עבור 5 דקות ב 3500 סל"ד ב 20 ° C. למשוך את supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מ"ל YPGLU בזהירות.
    9. מערבבים את שמרי AH109 המושעים עם Y187 ספרייה ובה. להעביר בצינור 50 מ"ל. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 3500 סל"ד ב 20 ° C, לסגת בזהירות supernatant (גלולה שבירה).
    10. Resuspend גלולה בYPGLU כדי לקבל סכום כולל של 1.5 מ"ל.
    11. שמרים מורחים על 3 YCM-אגר 150 צלחות מ"מ, 0.5 מ"ל / צלחת. דגירה 4.5 שעות ב 30 ° C.
    12. לאסוף שמרי הזדווגו מצלחות YCM על ידי גירוד עם כוס לגרוף 10 מ"ל של SD-L/-W/-H. יש לשטוף את הצלחות שתי פעמים עם מדיום SD-L/-W/-H 5 מ"ל ובריכת.
    13. צנטריפוגה 5 דקות ב -3,500 סל"ד, 20° C. בטל supernatant ו resuspend את השמרים בגלולה 5 בינוניות SD-L/-W/-H מ"ל.
    14. מורחים שמרי הזדווגו על 10 צלחות (0.5 מ"ל / צלחת) של אגר SD-L/-W/-H השלימו עם הריכוז המתאים של 3-aminotriazole (3-AT) נקבע בבדיקה אוטומטית ההפעלה. לדגור על 30 מעלות צלזיוס באווירת humidified עבור 6-10 ימים.
    15. לקבוע דיפלואידי (2n) השיעור על מנת להעריך את יעילות הזדווגות על ידי הפצת 250 μl של דילולים סדרתי (10 -4 עד 10 -6) של ההשעיה שמרי הזדווגו על צלחות SD-L/-W. דגירה צלחות על 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים. לספור מושבות גדלו על SD-L/-W, ולהסיק המספר הכולל דיפלואידי ההווה בהיקף הראשוני של שמרי הזדווגו. דווח על מספר דיפלואידי זה למספר שמרים המכיל ספרייה בת קיימא כדי לחשב את שיעור דיפלואידי. זה צריך לנוע סביב 10-25%.
    16. 6-10 ימים לאחר דגירה על 30 מעלות צלזיוס, לבחור מושבות שמרי הזדווגו בSD-L/-W/-H הטרי + 3-AT צלחות. [טיפ: כדי השמרים בערכה של 8נתיבים של 12 בארות המתרבות בצלחת 96 היטב, כדי שיהיה קל יותר אחר כך עבור סידור]. בואו מושבות שמרים לגדול במשך 4-5 ימים ב30 ° C באווירת humidified.
  3. הקרנה של HIS3 שיבוטים חיוביים על ידי PCR וסדר
    המטרה היא PCR להגביר ORF כלול בpACT2 וקטורים של מושבות שמרים שגדלו על צלחות SD-L/-H/-W סלקטיבית.
    1. לשים היטב PCR צלחת 96 על קרח.
    2. לlyse תאי שמרים, להוסיף 50 μl לכל טוב של פתרון 20T Zymolase (2.5 מ"ג / מ"ל ​​ב10 מ"מ המאגר pH HEPES 7.7).
    3. בעדינות resuspend מושבה אחת בכל טוב.
    4. דגירה 15 דקות בשעה 37 ° C ו 15 דקות ב 95 ° C.
    5. שים את הצלחת בחזרה על קרח. הוסף 50 μl של מים מזוקקים בכל טוב. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    6. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3500 סל"ד ו 4 ° C.
    7. PCR להגביר 10 μl לזהות באמצעות הוספת פריימרים חישול או צדדים של ORF נגזרים מcDNA בpACT2 וקטורים. הפרוטוקול הוא GIven להגברה של 96 מושבות שמרי lysed עם פולימראז ExTaq. מכין את התערובת הבאה: 525 חיץ μl 10X ExTaq, 420 תמהיל dNTPs μl (2.5 מ"מ), 10.5 פריימר קדימה μl (1 מיקרוגרם / μl), 10.5 פריימר ההפוך μl (1 מיקרוגרם / μl), 31.5 ExTaq μl (5 U / μl ) ו3202.5 H 2 0 μl. הפץ 40 μl של התערובת לכל גם בצלחת 96-PCR היטב. הוסף 10 μl של שמרי lysed בכל טוב. לבצע הגברה כדלקמן: 94 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, ולאחר מכן 35 מחזורים ב 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, 72 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות, וסופו של דבר עם 72 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות. הפעלת 3 μl של מוצרי ה-PCR על 1.2% ג'ל agarose כדי לזהות שיבוטים PCR-חיוביים. שים לב שהשימוש טרום יציקה 96 גם agarose ג'לי מומלץ.
      [טיפ: ניתן לאחסן צלחת ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים ושימוש חוזרת לPCR החדש]
    8. רצף שברי PCR מוגברים בודדו מHIS3 שיבוטים חיוביים. לבצע ניתוח תפציץ לזהות הסלולרי ORF. מערכים נמוך ביטחון (E & ערךGT; 10 -10, זהות <80%, אורך הפפטיד <20 חומצות אמינו) מבוטלות, כמו גם frameshifted והמוקדם קודון STOP המכיל רצפים.

2. מטריקס בניין לHT-GPCA

HT-GPCA הוא assay מבוסס תאי יונקים שבו שני חלבוני הפתוגן ומארח transiently הביעו התמזגו ברים משלימים של פיצול לוציפראז Princeps Gaussia. על האינטראקציה של בני הזוג, אנזים זה מחדש ומאפשר מידה של הפעילות האנזימטית שלה. עוצמת האינטראקציה היא להסיק מכך יחס הארה מנורמל (ראה להלן ואיור 1)

  1. בחירה של שותפי תא מארח
    1. בחר חלבונים שמזוהים יותר משלוש פעמים בהקרנות Y2H עבור אימות נוספת בתאי יונקים להגדיל את מערך הביטחון 9.
    2. הוסף שותפים באינטראקציה ידועה של חלבוני הפתוגן כpositive פקדים.
  2. העבר לוקטורים תואמים HT-GPCA
    1. לשכפל כל חלבון ORF הפתוגן בוקטור pSPICA-N2 לייצר חלבוני הפתוגן עם חומצות אמינו 110-185 של Princeps Gaussia מואנשים התמזגו לוציפראז ב( fusions חלבון GL2 לפתוגן) N-סופית.
    2. PCR להגביר חלבון תאי ORF ישירות מהשיבוטים החיוביים Y2H או ממקורות אחרים ORF (ORFeome אנוש http://horfdb.dfci.harvard.edu/) ולהעביר אותם לוקטורי pSPICA-N1 כדי לייצר חלבונים התמזגו בN-הסופית עם חומצות אמינו של 18-109 האנושי Gaussia Princeps לוציפראז (fusions חלבון GL1-מארחת).
      [עצה: לשיבוט בקנה מידה גדול, מערכת שיבוט השער מומלצת. במקרה זה, להגברת PCR, השתמש פריימרים נועדו להכיל אתרים תואמים Gateway].
    3. רצף כל וקטורי הביטוי. רצפים של pSPICA-N1 ו-N2 pSPICAניתן למצוא בהתייחסות 8.

שים לב שניתן inversed בונה פלסמיד, חלבונים פתוגנים כלומר בpSPICA-N1 ומארח חלבון לתוך pSPICA-N2.

3. Assay תפוקה גבוהה Gaussia Princeps מבוסס לוציפראז חלבון שלמה (HT-GPCA)

  1. Transfection הסלולרי
    1. 293T תאי זרע ב350,000 תאים / מ"ל ​​של DMEM עם סרום 10% שור עוברי (FBS) ללא אנטיביוטיקה. הפץ 100 μl / היטב בתרבות צלחות לבנות סטרילי. לא יעלה על 10 צלחות בניסוי יחידה. בואו תאים לגדול במשך 24 שעות ב 37 ° C עם 5% CO 2.
      [טיפ:. מאז פלסמידים pSPICA מכילים המוצא SV40, השימוש בתאי 293T מאפשר השכפול שלהם בתאי transfected ובכך מוביל לביטוי יתר של שני שברי לוציפראז]
    2. למחרת, תאי transfect באמצעות כל פרוטוקול transfection מתאים. שימו לב כי לריאגנטים transfection מסוימים, נוmber של תאים שנזרעו אולי צריך להיות מותאם. השתמש 100 ננוגרם לכל גם הן את הפתוגן ומארח ORF בונה פלסמיד. שיתוף transfect 10 ng לכל גם של CMV-Firefly לוציפראז פלסמיד לנרמל ליעילות transfection. כל נקודה היא נבדק בשלושה עותקים.
      [טיפ:. ניתן לבצע תערובות DNA היום לפני transfection ומאוחסנות ב -20 ° C עם חותמות דבק]
    3. העבר את תערובת transfection לצלחות של תאי 293T תרבית. להיות זהיר כדי להפקיד את התערובת בעדינות על ה-DNA בתאים, כמו 293T הם לא מאוד חסיד ולנתק בקלות מתחתית הבאר. דגירה בתא תרבות חממה עבור 24-30 שעות ב 37 ° C עם 5% CO 2.
  1. תמוגה תא ומינון לוציפראז Gaussia
    1. שטוף תאים עם PBS (100 μl / טוב). הוסף 40 מאגר תמוגה Renilla 1X μl. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר תחת תסיסה.
    2. חסוך 10 μl של lysates התא בפלאט הלבן אחרדואר למינון הבא של פעילות לוציפראז Firefly. החנות ב 4 מעלות צלזיוס או לחלופין ב -20 ° C עם איטום.
    3. למדוד את פעילות Gaussia על 30μl הנותרים של lysates תא על ידי הוספת 100 μl של מגיב assay לוציפראז Renilla וספירת הארה עבור 10 שניות עם luminometer. המינון של 96 צלחת גם לוקח בערך חצי שעה. לבצע מדידה עם תמציות תאי אחסון טריות מאז הקפאה או לטווח ארוך עשוי להשפיע על פעילות Gaussia אינטראקציה בתיווך.
  1. מדידה של פעילות Firefly
    1. למדוד את הפעילות בגחלילית הציל 10 μl של lysates תא על ידי הוספת 50 μl של מגיב assay לוציפראז Firefly וספירת הארה עבור 10 שניות. המינון של 96 צלחת גם לוקח בערך חצי שעה. [טיפ: המינון של Firefly לוציפראז יכול להתבצע ביום שאחרי על lysates קפוא.]
  1. חישובי NLR
      Gaussia ופעילות לוציפראז Firefly להשיג ערך הארה Gaussia מנורמל תוך לקיחה בחשבון של היעילות transfection וכדאיויות תא. לחשב את הממוצע של triplicates.
    1. כדי לפקח על האינטראקציה, מעריך יחס הארה מנורמל (NLR) עבור כל זוג הפתוגן-מארח. לשם כך, יש לחלק את פעילות הארה Gaussia המנורמלת זוהתה בנוכחותם של שני חלבוני הפתוגן ומארח בסכום של הפעילות שנמדדה בשליטת בארות (איור 1 מותאם מהתייחסות 8). ערך חתך NLR לאינטראקציות חיוביות כבר מוערך כ 3.5 8.
  1. ניתוח נתונים
    1. בצע אשכולות היררכי באמצעות חבילת נתון R. ראשית, קבוצה את נתוני NLR לקטגוריות, ואז לחשב dendrogram אינטראקציה תוך שימוש בשיטת ההצמדה המלאה. דמיינו את זהdendrogram עם JavaTreeView 10. לחשב את המרחק בין dendrogram אינטראקציה ועץ פילוגנטי באמצעות מקדם מתאם פירסון.
    2. כדי ליצור אינטראקציה רשתות, בחר את האינטראקציות חיוביות מבסיס נתוני HT-GPCA ולהשתמש בתוכנת Cytoscape 1. חלץ את מעלות של החלבונים המארחים ולהתוות ההפצה שלהם כדי לגשת לדינמיקה המקומית ברשת. ניתן גבי רשתות Host-פתוגנים לinteractome המארח כדי לספק הערכה של ההשפעה הגלובלית של חלבוני הפתוגן ברשת הסלולרית המארחת.
    3. לחלץ GO (אונטולוגיה ג'ין) מונחים הקשורים לגורמים הסלולריים הממוקדים עם דוד מסד הנתונים ביואינפורמטיקה 12 להעריך את ההעשרה התפקודית של בסיס הנתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כוח עיקרי של HT-GPCA טמון ברגישות הגבוהה שלו, כפי שמודגם על ידי ההערכה של שיעורים שליליים שווא ושקר חיובי לחלבון HPV E2 באיור 2 (עיבוד ההתייחסות 13). כדי לקבוע את השיעור השלילי הכוזב, אינטראקציות ידועות של E2 מHPV16 הוערכו על ידי HT-GPCA (איור 2 א). ארבעה מתוך 18 אינטראקציות לא התאוששו (מקבילה ל -22% שיעור שלילי כוזב). האינטראקציות החיוביות הכוזבות נמדדו להיות 5.8% באמצעות חלבוני 12 HPV E2 נגד קבוצה אקראית של חלבונים תאיים (איור 2). יתר על כן, את הספציפיות חזקות של השיטה מודגשת באיור 2 ג מראים כי מוטציה נקודה אחת ידועה להפריע E2 קשירה לשותף תא BRD4 annihilates יחס NLR (איור 2 ג).

גישת interactomic השוואתית בקנה מידה גדולה זה כבר מיושם בהצלחה לאחרונה שלוש פרו מוקדםteins של Papillomaviruses האנושי (HPV): E2, E6 ו E7 מקורם נציג גנוטיפים שונה של הגיוון הטבעי בHPV tropisms ומוזרויות 13,14. לכל אחד מהחלבונים המוקדמים, הקיבוץ ההיררכי של פרופילי האינטראקציה בעיקר תולדות הגזע HPV משחזר, המוכיחים את חוסנה של הגישה והרלוונטיות של מערכי נתונים אינטראקציה (איור 3 מותאמים מהפניות 13 ו -14). ניתן להשתמש בו, כדי לקשר בין פרופילי אינטראקציה-מארח וירוס ספציפיים עם תכונות פתולוגיים, ובכך נותנים רמזים על מעורבותם של חלבונים נגיפיים בפתוגנזה. ניתן לחלץ אינטראקציות הגנוטיפ ספציפיות, אשר באופן פוטנציאלי מתאימות לסמנים ביולוגיים פתוגניים כמיהות או כפי שמוצגים באיור 4 לחלבוני E6 של HPV (איור 4 מותאמים מהתייחסות 14).

יתר על כן, תובנות תפקודיות יכולות לצאת מניתוח בקנה מידה גדולה מסוג זה. לדוגמה, במחקר של interactomicE2 חלבוני HPV, ניתוח ההעשרה הפונקציונלי הוביל לזיהוי של משפחה בולטת בהיקף בגורמי שעתוק סלולרי, בקנה אחד עם תפקידו העיקרי של E2 כרגולטור תעתיק נגיפי. הוא גם חשף מיקוד צפוי פונקציונלי של מכונות הסחר תאיים, פתיחת אופקים חדשים לתפקיד של E2 בפתוגנזה HPV 13.

בסך הכל, מחקרים ההשוואתיים שבוצעו interatomic עם החלבונים המוקדמים HPV לשפר באופן משמעותי את ההבנה של הפתוגנזה HPV באמצעות התאמת פרופילי אינטראקציות ספציפיות להבדלים פנוטיפי.

איור 1
איור 1. זיהוי של אינטראקציות בין חלבונים באמצעות HT-GPCA. שניהם הפתוגן ומארח חלבונים הם התמזגו לinacמחצית tive של Gaussia Princeps לוציפראז (חלקי Gl2 וGL1, בהתאמה). כאשר החלבונים נמצאים באינטראקציה, פעילות לוציפראז מושרה על ידי הקרבה של שני החצאים של האנזים. פעילות לוציפראז שוחזר Gaussia מחושבת מיחס הארה מנורמל (NLR) כפי שמוצגת בצד ימין. איור המותאם מהתייחסות 8. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2
איור 2. מאפייני HT-GPCA. () 18 אינטראקציות שחולצו מן הספרות מעורבת חלבון E2 מHPV16 וחלבונים תאיים נבדקו על ידי HT-GPCA על מנת לאמוד את השיעור שגוי השלילי לא קשור לזה echnique. יחס NLR מיוצגים כצבע הדרגתי (מפת חום) עם קנה מידה משחור (ללא התערבות) לאור (אינטראקציה חזקה) כחולה. ארבע אינטראקציות ידועות לא התאוששו (חצים אדומים) נותנים הערכה גסה של השיעור שגוי השלילי סביב 22%. (ב) חלבוני 12 HPV E2 נבדקו עם 10 חלבונים תאיים אקראי הרים, מתאימים לאפריורי אינטראקציות שליליות, על מנת לקבוע את השיעור החיובי השגוי של HT-GPCA, שקלע סביב 5.8%. (ג) האינטראקציה בין החלבון התאי BRD4 וHPV16 או HPV18 חלבוני E2 ידוע תלויה בחומצות אמינו וI73 I77 בהתאמה. כאשר חומצות אמינו אלה שעברו מוטציה, NLR HT-GPCA יורד עם ירידה של 5 זמן להפגין סגוליות גבוהה של גילוי אינטראקציות. איור המותאם מהתייחסות 13. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

jove_content "עבור: לשמור-together.within עמודים =" תמיד "> איור 3
איור 3. השוואה בין dendrograms מבוסס אינטראקציה ניסיונית ועצים פילוגנטי HPV. תולדות הגזע של HPV המבוססים על חלבוני E2 המוקדם (), E6 (ב) או E7 (C) רצפים מיוצגים בצד השמאל של כל גרף. dendrograms האינטראקציה התקבלו על ידי אשכולות היררכי של פרופילי האינטראקציה של כל חלבון ומיוצג בצד ימין. חפיפה משמעותית בין שני סוגי העץ, עם אשכולות דומים מהסוגים פתולוגיים (מלבנים צבעוניים), המוכיחה את הרלוונטיות של מערכי נתונים האינטראקציה. איור מותאם מהפניות 13 ו -14. לחץ כאן לצפייה בתאנה גדולה יותריור.

איור 4
איור 4. ייצוג סכמטי של E6 מטרות הסלולר העיקריות. מטרות הסלולר מוינו מבוססות על עוצמת האינטראקציה וקובצו לפי סוג HPV אינטראקציה. ייצוג זה מאפשר זיהוי של סמנים ביולוגיים ספציפיים, כגון FADD, שמקיים אינטראקציה עם חלבוני E6 של HPV שהעור בלבד. מיקוד כזה חייב להיות חיוני לתכונה מסרטנת מכל HPV שהעור ובכך מהווה מועמד טוב לשמש גם כסמן הפונדקאי לזיהום HPV או כמטרה טיפולית. איור המותאם מהתייחסות 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

באופן עצמאי, שמרים, שני מבחני אינטראקציה היברידיים ויונקים, כגון GST הנפתח, LUMIER או MAPPIT, הוכיחו להיות כלים יעילים לאיתור חלבונים אינטראקציות, אבל מוגבלים על ידי השיעור הגבוה של חיובית שגוי וכוזב שליליים אינטראקציות קשורות לטכניקות אלה 15. יתר על כן, ראיות הולכות וגדלו כי שילוב שיטות מאונך מגדילה את האמינות של בסיס נתוני האינטראקציה השיג 7. ההתפתחות האחרונה של טכניקת HT-GPCA מתוארת כאן השתפרה לא רק את הרגישות של גילוי אינטראקציה בין חלבונים בתאי יונקים בינארי, אלא גם הציעה את האפשרות להתמודד עם כמות גדולה של אינטראקציות ובעונה אחת.

האסטרטגיה שתוארה כאן משפרת את הכיסוי של הקרנות Y2H בודדות על ידי חיטוט אינטראקציות של גרסאות מתח מרובות. יתר על כן, בדיקות חוזרות אינטראקציות עם שיטת זיהוי אורתוגונלי מספקת אינטראקציה השוואתית מחמירהמערכי נתונים tion, על ידי התגברות על מגבלות ונמלטו חפצים הטבועים במתודולוגיה של שתי ההיברידית. ואכן, מאז HT-GPCA מתרחש בתאי יונקים, השינויים לאחר translational ולוקליזציה subcellular טבעי של החלבונים אינם מושפעים. הגישה שלנו ובכך יכולה לייצר במפות אינטראקציה צעד אחד ששופרו בהשוואה לאלו המבוססים בעיקר על שמרי שני היברידיים לאינטראקציה חישה 4.

בשלב זה, אם כי, היינו ממליץ להיות זהיר בעת לימוד חלבוני טרנס בממברנה, שכן זיהוי של אינטראקציות יכול להיות תלוי בלוקליזציה של שברי Gaussia משני הצדדים של הקרום. במקרים אלה, זה יכול להיות נחוץ כדי למזג את שברי Gaussia בסופו של C-המסוף של אחד או שני בני הזוג. בנוסף, ביטוי לוציפראז יכול להיות מושפע ממספר רב של פרמטרים כגון יעילות transfection ומספר תא. לכן, אנו ממליצים בחום follבשל הליך הנורמליזציה מתואר בסעיף הפרוטוקול כדי לקחת בחשבון שינויים ניסיוניים.

על ידי שימוש במערכים מסודרים של ORF שנלקחו מהאוסף הולך וגדל של ORFeome האנוש, אנו צופים לנקודה בעתיד הקרוב שבו HT-GPCA יכול לשמש באופן ישיר כשיטת הקרנה. זה ראשון באופן דרסטי צריך לשפר את הכיסוי מאז ההקרנה כל חלבון זוגות היו אז להיבדק, ושנית, היא צריכה להקל על האוטומציה. עם זאת, הרחבת תפוקה גבוהה יותר דרסטית של assay זה צריך להיות מובא על ידי הפיתוח של assay במבחנת HT-GPCA שימוש במערכות ביטוי מבחנה המבוססות על תמציות של תאי אדם. זה אמור גם לאפשר לעקוב אחר אינטראקציות בין חלבונים בסביבה ביוכימית מבוקרת.

לבסוף, התפתחויות הקרובות צפויות לשפר את ההדמיה של הארה מורכבת בתיווך בתאים חיים. במקרה זה, HT-GPCA יכול להיותמשמש לגילוי אינטראקציות דינמיות בהקשר של התוספת של תרופות או מעכבים מורכבים ובכך מאפשרים ניטור חי של שיבוש אינטראקציה.

בסך הכל, גישה זו מהווה מתווה יעילה לכל מחקרים של יחסי גומלין פתוגן מארח ואנחנו מרגישים שניתוחי interactome השוואתיים יכולים לספק מסגרת מוצקה להבין חיידק חטיפה של תאי מארח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מימון מהמכון פסטר ועל ידי מענקים מLigue Nationale contre le הסרטן (מענקי R05/75-129 וRS07/75-75), איגוד pour la משוכלל ונדיר sur le הסרטן (מענקים ARC A09 / 1/5031 ו4867), וסוכנות הידיעות Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 וANR09 הבעת 026 01). MM היה מקבל מלגת MENRT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast strains Clontech
Minimal SD base US biological D9500
Amino acids Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Acros organics 264571000
Zymolase Seikagaku 120491
DMEM Gibco-Life Technologies 31966
Fetal bovine serum BioWest S1810
Phosphate buffer Saline (PBS) Gibco-Life Technologies 14190
Penicillin-Streptomycin Gibco-Life Technologies 15140
Trypsin-EDTA Gibco-Life Technologies 25300
Renilla luciferase assay Promega E2820
White culture plate Greiner Bio-One 655083
96-wellPCR plates 4titude 4t-i0730/C
Incubator (30 °C) Memmert
Incubator (37 °C) Heraeus
Luminometer Berthold Centro XS-LB 960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
  2. Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
  3. de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
  4. Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
  5. Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
  6. Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
  7. Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
  8. Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
  9. Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
  10. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
  11. Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
  12. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
  13. Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
  14. Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
  15. Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).

Tags

אימונולוגיה גיליון 77 גנטיקה מיקרוביולוגיה ביוכימיה ביולוגיה מולקולרית ביולוגיה תאית הנדסה ביו רפואית זיהום סרטן ביולוגיה נגיפים אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן אינטראקציה בין חלבונים הקרנת תפוקה גבוהה הארה שמרים שתי היברידי HT-GPCA רשת חלבון שמרים תא התרבות
גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muller, M., Cassonnet, P., Favre,More

Muller, M., Cassonnet, P., Favre, M., Jacob, Y., Demeret, C. A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (77), e50404, doi:10.3791/50404 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter