Summary
Denne artikkelen fokuserer på identifisering av høy trygg interaksjon datasett mellom vert og patogen proteiner ved hjelp av en kombinasjon av to ortogonale metoder: gjær to-hybrid etterfulgt av en høy gjennomstrømming interaksjon analysen i mammalske celler kalt HT-GPCA.
Abstract
Betydelig innsats var samlet for å generere store omfattende protein-protein interaksjon nettverk kart. Dette er medvirkende til å forstå patogen-vert relasjoner og ble i hovedsak utført av genetiske screenings i gjær to-hybrid-systemer. Den nylige forbedringen av protein-protein interaksjon deteksjon av en Gaussia luciferase-baserte fragment complementation analysen tilbyr nå muligheten til å utvikle integrerende komparative interactomic tilnærminger er nødvendige for å strengt sammenligne interaksjon profiler av proteiner fra ulike patogen belastning varianter mot et felles sett av cellulære faktorer.
Denne artikkelen fokuserer spesielt på nytten av å kombinere to ortogonale metoder for å generere protein-protein interaksjon datasett: gjær to-hybrid (Y2H) og en ny analyse, høy gjennomstrømming Gaussia princeps protein complementation analysen (HT-GPCA) utført i celler hos pattedyr.
nt "> En storstilt identifisering av mobilnettet partnere av et patogen protein er utført av parring-baserte gjær to-hybrid visninger av cDNA biblioteker ved hjelp av flere patogen belastning varianter. En undergruppe av samhandlende partnere valgt på en høy tillit statistisk scoring er videre validert i mammalske celler for parvis interaksjoner med hele settet av patogene varianter proteiner ved hjelp av HT-GPCA. Denne kombinasjonen av to komplementære metoder forbedrer robustheten av samspillet datasettet, og gjør at ytelsen til en strengere komparativ interaksjon analyse. Slike komparative interactomics utgjør en pålitelig og kraftig strategi for å dechiffrere patogen-vert interplays.Introduction
Den økende mengden av data som er samlet for å generere protein-protein interaksjon maps åpner perspektiver for å ytterligere forstå patogen infeksjoner. Som global forståelse av patogene infeksjoner begynner å dukke opp, det gir tilgang til omfanget av forstyrrelser forårsaket av patogener proteiner når du kobler den menneskelige proteomet en. Det har derved en måte å forstå hvordan patogener manipulere vertscellen maskineri. Spesielt avslørte kartlegging av flere viral-vert interaksjon nettverk som virusproteiner fortrinnsvis målet vert proteiner som er sterkt koblet i mobilnettverket (nav), eller som er sentralt for mange stier i et nettverk (flaskehalser proteiner) 2-4. Disse interaksjonene tillate virus å manipulere viktige cellulære prosesser, noe som er medvirkende til å gjenskape og produsere smittsomme avkom. Comparative interaksjoner kartlegging ble nylig gjennomført på beslektede virus med det mål å trekke ut informasjon i forhold tilpatogenese fire. Videre har studier av vert-patogener interaksjoner landskapet blitt utvidet til mange patogener fem. Den målrettede celle faktorer identifikasjon gir innsikt i strategier som brukes av patogener å infisere celler og tillater påvisning av potensielle sykdomsfremkallende markører.
Gjær to-hybrid system er den mest populære metoden for å identifisere binære interaksjoner siden genetisk screening er en effektiv og sensitiv verktøy for high-throughput kartlegging av protein-protein interaksjoner. Tilnærmingen foreslått her ytterligere forbedrer enkelte Y2H screenings ved å vurdere et protein av flere patogener belastning varianter, og dermed gi tilgang til en sammenlignende oversikt over patogen-vert protein-protein interaksjoner. Videre ligger en betydelig begrensning av gjær to-hybrid screening i en høy falsk-negative klassifiseringen, siden det gjenvinner ca 20% av de totale seks interaksjoner. Dette innebærer at interaksjoner oppdaget med bare en undergruppe av pathogens varianter kan ha rømt deteksjon med de andre. Derfor er enkelte partnere dukker opp fra alle de to-hybrid screenings ytterligere utfordret for samhandling med det komplette utvalg av stammer studert, noe som gir komparative interaksjon datasett. Siden det ble demonstrert at å kombinere ulike metoder kraftig øker robustheten av protein-protein interaksjon datasett 7, er dette validering utføres i mammalske celler av en nyutviklet protein-fragment complementation analysen heter HT-GPCA åtte. Denne cellen-basert system tillater påvisning av protein interaksjoner ved complementation av Gaussia princeps delt luciferase og har blitt designet for å være kompatibel med en høy gjennomstrømming format. Takket være sin luminescens-basert teknologi og sin lave bakgrunnsstøy sammenlignet med andre fluorescens-basert analysen, viser HT-GPCA en påfallende høy følsomhet.
Totalt utgjør denne tilnærmingen en effektivverktøy for å generere en omfattende kartlegging av host-patogen interplays, som representerer det første skrittet mot en global forståelse av vertscellen kapring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Gjær to-hybrid Screenings
- Gjør følgende nødvendige løsninger:
- Komplett syntetisk Drop Out (SD): Løs opp 26,7 g minimal SD base med glukose i en liter vann. Tilsett 2 g av aminosyre-blanding fremstilt som følger: 2 g adenin hemisulfat, 2 g arginin HCl, 2 g Histidin HCl, 2 g isoleucin, 4 leucin g, 2 g Lysin HCl, 2 g metionin, 3 g fenylalanin, 2 g L -serin, 2 g L-Treonin, 3 g tryptofan, 2 g tyrosin, 1,2 g Uracil, 9 g valin.
- Selektiv Drop Out SD-L/-W/-H: SD inneholder alle essensielle aminosyrer bortsett fra de som er angitt (-L:-Leucine;-W:-Tryptofan;-H:-Histidine).
- YPGLU: i 1 L, vekt 10 g gjærekstrakt, 10 g Bacto Pepton og 20 g glukose. Komplett med 25 g Bacto agar for faste medier.
- YCM: Samme som YPGLU, men pH justert til 4,5.
- Parring og sprer
- Bruk frosne porsjoner av pre-transformed gjærstamme Y187 (parring typen α) som inneholder et cDNA-bibliotek klonet i pACT2. Sjekk celle levedyktighet ved plating seriefortynning på SD-L plater.
- Klone patogen ORF inn pGBKT7 vektor, og forvandle den rekombinant plasmid ved hjelp av en standard prosedyre i AH109 gjærstamme (parring type a).
- Spread pGBKT7-transformert AH109 gjær på SD-W plater. Inkuber i minst to dager 30 ° C i en fuktet inkubator. Platene kan lagres ved 4 ° C inntil to-hybrid screening.
- Bruk 3-Aminotriazole (3-AT), en kompetitiv inhibitor av enzymet HIS3, for å motvirke eventuelle selv-transactivation av HIS3 reportergen av patogener 'proteiner. Utføre en auto-aktivering test ved bestemmelse av konsentrasjonen av 3-AT, som hindrer veksten av pGBKT7-transformert gjær på SD-W/-H platene.
- Seed 30 ml av SD-W med noen kolonier av pGBKT7-transformert AH109. Inkuber 30 timer ved 30 ° C med rotasjon.
- Seed 200 ml av SD-W med 30 mlav de AH109 kulturer. Inkuber med rotasjon rundt 20 timer ved 30 ° C.
- Ruge tint cDNA bibliotek-transformert Y187 i 20 ml YPGLU, 10 incubate min ved 30 ° C med rotasjon.
- Sentrifuge med et volum på pGBKT7-transformerte kulturen AH109 tilsvarer en ekvivalent mengde av levedyktige Y187 gjærceller i 5 min ved 3500 rpm ved 20 ° C. Trekk forsiktig supernatanten og resuspender pellet i 10 ml YPGLU.
- Bland det resuspenderte AH109 gjær med Y187 inneholder bibliotek. Overfør i en 50 ml tube. Sentrifuger i 5 min ved 3500 rpm ved 20 ° C og forsiktig trekke supernatanten (skjør pellet).
- Resuspender pellet i YPGLU å få en total på 1,5 ml.
- Spread gjær på tre YCM-Agar 150 mm plater, 0,5 ml / plate. Inkuber 4,5 timer ved 30 ° C.
- Samle parret gjær fra YCM plater ved å skrape med en rake glass i 10 ml SD-L/-W/-H. Skyll platene to ganger med 5 ml SD-L/-W/-H medium og basseng.
- Sentrifuger 5 min ved 3500 rpm, 20° C. Kast supernatanten og resuspender gjær pellet i 5 ml SD-L/-W/-H medium.
- Spre parret gjær på til 10 plater (0,5 ml / plate) av SD-L/-W/-H-agar supplert med den passende konsentrasjon av 3-Aminotriazole (3-AT) bestemmes i den auto-aktivering test. Inkuber ved 30 ° C i en fuktet atmosfære i 6-10 dager.
- Bestem diploid (2n) satsen for å vurdere parring effektivitet ved å spre 250/il seriefortynninger (10 -4 til 10 -6) av parret gjærsuspensjonen på SD-L/-W plater. Inkuber platene ved 30 ° C i to dager. Telle kolonier dyrket på SD-L/-W, og utlede den totale diploide nummer til stede i den initiale volum av parret gjær. Rapporter denne diploid nummeret til levedyktig bibliotek som inneholder gjær for å beregne diploid rate. Det bør ligge rundt 10-25%.
- 6-10 dager etter inkubasjon ved 30 ° C, plukke parret gjær koloniene i frisk SD-L/-W/-H + 3-AT plater. [Tips: For gjæren i en ordning med 8baner av 12 brønner som gjengir en 96 brønners plate, slik at det vil være lettere etterpå for sekvensering]. Let gjær kolonier vokse i 4-5 dager ved 30 ° C i en fuktet atmosfære.
- Screening av his3 positive kloner av PCR og sekvensering
Målet er å PCR forsterke ORF som finnes i pACT2 vektorer av gjær kolonier dyrket på selektive SD-L/-H/-W plater.- Sett en 96 godt PCR plate på is.
- For å lysere gjærceller, tilsett 50 ul per brønn av en Zymolase 20T oppløsning (2,5 mg / ml i 10 mM Hepes-buffer pH 7,7).
- Forsiktig resuspender en koloni per brønn.
- Inkuber 15 min ved 37 ° C og 15 min ved 95 ° C.
- Sett platen tilbake på isen. Tilsett 50 mL av destillert vann per brønn. Bland godt med pipettering opp og ned.
- Sentrifuger i 5 min ved 3500 rpm og 4 ° C.
- PCR forsterke 10 ul å oppdage et innstikk bruke primere brenning begge sider av ORF avledet fra cDNA i pACT2 vektorer. Protokollen er given for forsterkning av 96 lyserte gjær kolonier med ExTaq polymerase. Forbered følgende mix: 525 ul 10X ExTaq buffer, 420 ul dNTPs mix (2,5 mm), 10.5 ul Forward Primer (1 mikrogram / mL), 10.5 ul Reverse Primer (1 mikrogram / mL), 31.5 ul ExTaq (5 U / ul ) og 3202,5 ul H 2 0. Fordel 40 ul av blandingen per brønn i en 96-brønners PCR-plate. Tilsett 10 pl av lysert gjær per brønn. Utfør forsterkning som følger: 94 ° C i 3 min, deretter 35 sykluser ved 94 ° C i 30 sek, 60 ° C i 1 min, 72 ° C i 4 minutter, og enden med 72 ° C i 7 min. Løpe 3 pl av PCR-produktene på en 1,2% agarosegel for å påvise PCR-positive klonene. Legg merke til at bruk av pre-cast 96 godt agarosegeler anbefales.
[Tips: plate kan oppbevares ved -20 ° C for et par måneder og gjenbrukes for nye PCR] - Sekvens PCR forsterket fragmenter isolert fra HIS3 positive kloner. Utfør en BLAST analyse for å identifisere mobilnettet ORF. Low-tillit justeringer (E value >, 10 -10, identitet <80%, peptid lengde <20 aminosyrer) blir forkastet samt frameshifted og for tidlig stoppkodon inneholdende sekvenser.
2. Matrix bygningen for HT-GPCA
HT-GPCA er en pattedyrcellelinje-baserte analysen der både patogen og vert proteiner er forbigående uttrykk smeltet til komplementære fragmenter av splitten Gaussia princeps luciferase. Ved interaksjon av partnerne, er dette enzymet rekonstitueres slik at måling av enzymatisk aktivitet. Samspillet intensitet er således utledet fra en normalisert Luminescence-forhold (se nedenfor og figur 1)
- Valg av vertscellen partnere
- Velg proteiner som er identifisert mer enn tre ganger i de Y2H screenings for ytterligere validering i mammalske celler til å øke datasettet tillit 9.
- Legg kjent samspill partnere av patogen proteiner som posive kontroller.
- Overføre til HT-GPCA kompatible vektorer
- Klone hvert patogen protein ORF i en pSPICA-N2 vektor for å generere patogen proteiner med aminosyrer 110-185 av humanisert Gaussia princeps luciferase smeltet på deres N-terminus (GL2-patogen protein fusjoner).
- PCR forsterke celleprotein ORF direkte fra Y2H positive kloner eller fra andre ORF ressurser (Human ORFeome http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) og overføre dem til pSPICA-N1 vektorer for å produsere proteiner fusjonert ved N-terminus med aminosyrene 18-109 av humanisert Gaussia princeps luciferase (GL1-vert protein fusjoner).
[Tips: For storskala kloning, er Gateway kloning system anbefales. I så fall, for PCR forsterkning, bruke primere designet for å inneholde Gateway kompatible nettsteder]. - Sekvens alle ekspresjonsvektorene. Sekvenser av de pSPICA-N1-og N2-pSPICAkan finnes i referanse 8..
Merk at plasmidkonstruksjoner kan invers, dvs. patogener proteiner i pSPICA-N1 og vert protein i pSPICA-N2.
3. Høy gjennomstrømming Gaussia princeps Luciferase-Based Protein complementation analyse (HT-GPCA)
- Cell Transfection
- Seed 293T-celler ved 350.000 celler / ml DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS) uten antibiotikum. Fordel 100 ul / brønn i sterile hvite dyrkingsplater. Ikke overstig 10 plater i et enkelt eksperiment. La cellene vokse i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
[Tips:. Siden pSPICA plasmider inneholder et SV40-opprinnelse, tillater bruk av 293T-celler deres replikasjon i transfekterte celler, og dermed fører til overekspresjon av de to fragmenter luciferase] - Dagen etter transfektere celler ved hjelp av en hvilken som helst egnet transfeksjon protokollen. Merk at for visse transfeksjonsteknologier reagenser, den number av celler seeded kan måtte tilpasses. Bruk 100 ng per brønn både den patogene og vert ORF plasmidkonstruksjoner. Ko-transfektere 10 ng pr brønn av en av CMV-Firefly luciferase plasmid for å normalisere for transfeksjon effektivitet. Hvert punkt testes i triplikat.
[Tips:. DNA mikser kan utføres dagen før transfeksjon og lagret ved -20 ° C med selvklebende seler] - Overfør transfeksjon blandingen til platene av dyrkede 293T celler. Vær nøye med å forsiktig deponere DNA-blandingen på cellene, som 293T er ikke sterkt vedheftende og lett løsner fra bunnen av brønnen. Inkuber i en cellekultur-inkubator i 24-30 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Seed 293T-celler ved 350.000 celler / ml DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS) uten antibiotikum. Fordel 100 ul / brønn i sterile hvite dyrkingsplater. Ikke overstig 10 plater i et enkelt eksperiment. La cellene vokse i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Cellelyse og Gaussia luciferase dosering
- Vask cellene med PBS (100 ul / brønn). Legg 40 mL 1X Renilla lysis buffer. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur under omrøring.
- Spar 10 mL av cellelysater i en annen hvit plate for påfølgende doseringen av Firefly luciferase aktivitet. Oppbevar ved 4 ° C, eller alternativt ved -20 ° C med tetting.
- Mål Gaussia aktivitet på de gjenværende 30μl av cellelysater ved å tilsette 100 ul av Renilla-luciferase assay reagens og telling luminescens i 10 s med et luminometer. Dosering av en plate med 96 brønner tar omtrent en halv time. Utfør målingen med frisk celle ekstrakter siden frysing eller langtidslagring kan påvirke samhandlingen-mediert Gaussia aktivitet.
- Måling av Firefly aktivitet
- Mål Firefly aktivitet av det lagrede 10 mL av cellelysater ved å tilsette 50 pl av Firefly luciferase assay reagens og telling luminescens i 10 sek. Dosering av en plate med 96 brønner tar omtrent en halv time. [Tips: Doseringen av Firefly luciferase kan utføres dagen etter på frosne lysater.]
- NLR Beregninger
- For å overvåke samspillet, anslår en Normalisert Luminescens Ratio (NLR) for hvert patogen-host par. For å gjøre dette, dele normalisert Gaussia luminescens aktivitet oppdages i nærvær av både patogen og vert proteiner med summen av aktivitetene målt i kontroll brønner (figur 1 tilpasset fra referanse 8). Den NLR cut-off verdi for positive interaksjoner har blitt anslått til å være rundt 3,5 8.
- Dataanalyse
- Utfør hierarkisk clustering hjelp av R statistikken pakken. Først gruppere NLR data i kategorier, deretter beregne et samspill dendrogram bruker hele sammenhengen metoden. Visualisere dettedendrogram med JavaTreeView 10. Beregne avstanden mellom interaksjon dendrogram og fylogenetisk tre ved hjelp av en pearson korrelasjonskoeffisient.
- For å generere interaksjon nettverk, velger de positive interaksjoner fra HT-GPCA datasett og bruke Cytoscape programvaren 1. Pakk de grader av verten proteiner og plotte fordelingen å få tilgang til nettverket lokale dynamikk. Host-patogener nettverk kan gå føre seg til verten interactome å gi en vurdering av de globale konsekvensene av patogen proteiner i verten mobilnettverk.
- Pakk ut GO (Gene ontologi) vilkår knyttet til de målrettede cellulære faktorer med DAVID bioinformatikk database 12 for å vurdere den funksjonelle berikelse av datasettet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En stor styrke av HT-GPCA ligger i dens høye følsomhet, som illustrert ved vurderingen av falske positive og falske negative for den HPV E2 protein i figur 2 (tilpasset fra referanse 13). For å bestemme falsk negativ kurs, ble kjente interaksjoner av E2 fra HPV16 vurdert av HT-GPCA (Figur 2A). Fire av 18 interaksjoner ble ikke gjenvunnet (tilsvarende en 22% feilaktig negative klassifiseringen). De falske positive interaksjoner ble målt til å være 5,8% ved bruk av 12 HPV E2 proteiner mot en tilfeldig sett av cellulære proteiner (figur 2B). Videre er den sterke spesifisiteten av fremgangsmåten presentert i Figur 2C viser at en enkel punktmutasjon kjent for å interferere med E2 binding til sin celle partner BRD4 tilintetgjør den felles økonomiske forhold (figur 2C).
Dette storstilt komparativ interactomic tilnærming har nylig blitt brukt til tre tidlige proteins av humant papillomavirus (HPV): E2, E6 og E7 stammer fra ulike genotyper representant for HPV naturmangfoldet i tropisms og sykdomstrekk 13,14. For hver av de tidlige proteiner, hierarkisk clustering av samspillet profilene stort sett recapitulates HPV fylogeni, som beviser hvor robust tilnærming og relevans av interaksjon datasett (figur 3 tilpasset fra referanser 13 og 14). Den kan brukes til å relatere spesifikke virus-vert interaksjon profiler med patologiske trekk, og dermed gi ledetråder for involvering av virale proteiner i patogenesen. Genotype-spesifikke interaksjoner kan hentes ut, noe som potensielt tilsvarer tropisme eller patogene biomarkører som vist i figur 4 for E6 proteiner på HPV (figur 4 tilpasset fra referanse 14).
Videre kan funksjonelle innsikt komme ut slike store analyser. For eksempel, i studier av interactomicHPV E2 proteiner, den funksjonelle berikelse analyse førte til opprullingen av en prominent familie bestående i mobilnettet transkripsjonsfaktorer, i tråd med den primære rolle E2 som en viral transcriptional regulator. Det avslørte også en uventet funksjonell målretting av den intracellulære menneskehandel maskiner, åpner nye perspektiver for rollen som E2 i HPV patogenesen 13.
Totalt sammenligningstallene interatomic studier utført med HPV tidlige proteiner betraktelig bedre forståelse av HPV patogenesen ved å korrelere spesifikke interaksjoner profiler til fenotypiske forskjeller.
Figur 1. Identifisering av protein-protein interaksjoner med HT-GPCA. Både patogen og vert proteiner er smeltet til en Inactive halvparten av Gaussia princeps luciferase (GL2 og GL1 deler, henholdsvis). Når proteinene er i samspill, er en luciferase aktivitet indusert av nærhet av begge halvdelene av enzymet. Den restaurerte Gaussia luciferase aktivitet er beregnet ut fra en Normalisert Luminescens Ratio (NLR) som vist til høyre. Figur tilpasset fra referanse 8. Klikk her å se større figur .
Figur 2. HT-GPCA egenskaper. (A) 18 interaksjoner utvunnet fra litteraturen involverer E2 proteinet fra HPV16 og cellulære proteiner ble testet med HT-GPCA for å estimere den falske-negative klassifiseringen forbundet med dette t echnique. Den NLR ratio er representert som en farge gradient (varme map) med en skala fra svart (ingen interaksjon) til lys blå (sterk interaksjon). Fire kjente interaksjoner ble ikke gjenfunnet (røde piler) som gir et grovt estimat av den falske negative rente rundt 22%. (B) 12 HPV-E2-proteiner ble testet med 10 tilfeldig plukket cellulære proteiner, svarende til a priori negative interaksjoner, for å bestemme den falske positive rate av HT-GPCA, som scoret rundt 5,8%. (C) Samspillet mellom BRD4 mobilnettet protein og HPV16 eller HPV18 E2 proteiner er kjent for å være avhengig av aminosyrene I73 og I77 henholdsvis. Når disse aminosyrer er mutert, synker HT-GPCA NLR med en fem-time nedgang demonstrere en høy spesifisitet for å påvise interaksjoner. Figur tilpasset fra referanse 13.. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Sammenligning mellom eksperimentelle samspill-baserte dendrogrammer og HPV fylogenetiske trær. Den fylogeni av HPV basert på tidlig proteiner E2 (A), E6 (B) eller E7 (C) sekvenser er representert til venstre på hver graf. Interaksjon dendrogrammer ble innhentet av hierarkisk clustering av samspillet profiler av hver protein og er representert på høyre side. En betydelig sammenfall ble observert mellom begge tre typer, med samme gruppering av de patologiske typer (fargede rektangler), beviser pertinence av samspillet datasett. Figur tilpasset fra referanser 13 og 14. Klikk her for å se større bildeure.
Figur 4. Skjematisk fremstilling av E6 viktigste cellulære mål. Cellulære målene ble sortert basert på samspillet intensitet og gruppert etter samspill HPV type. Denne representasjonen tillater identifisering av spesifikke biomarkører som Fadd, som kommuniserer bare med E6 proteiner av onkogene HPV. En slik satsing må være avgjørende for den kreftfremkallende egenskap av alt onkogene HPV og dermed utgjør en god kandidat til å brukes enten som et surrogat markør for HPV-infeksjon eller som et terapeutisk mål. Figur tilpasset fra referanse 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvstendig, gjær-to hybrid og pattedyr interaksjon analyser, for eksempel GST-trekk, Lumier eller MAPPIT, har vist seg å være effektive verktøy for å oppdage protein-protein interaksjoner, men er begrenset av den høye frekvensen av falske positive og falske negative interaksjoner forbundet med disse teknikkene 15. Videre er bevis vokser at kombinere ortogonale metoder øker påliteligheten til den oppnådde interaksjon datasettet 7.. Den senere tids utvikling av HT-GPCA teknikk som er beskrevet her har ikke bare forbedret følsomhet for å detektere binær protein-protein interaksjon i pattedyrceller, men har også tilbys muligheten til å håndtere et stort antall interaksjoner på en gang.
Strategien er beskrevet her forbedrer dekningen av individuelle Y2H screenings ved sondering interaksjoner av flere belastningsskader varianter. Videre retesting interaksjoner med en ortogonal gjenkjenning metoden gir strenge komparativ interacsjon datasett, ved å overvinne begrensninger og rømmer gjenstander som ligger til de to-hybrid metodikk. Faktisk, siden HT-GPCA foregår i mammalske celler, den post-translasjonelle modifikasjoner og naturlig subcellulære lokalisering av proteinene er upåvirket. Vår tilnærming kan dermed produsere i et enkelt trinn interaksjon maps som er forbedret i forhold til de i hovedsak basert på gjær to-hybrid for samhandling sensing fire.
På dette tidspunkt selv om, ville vi anbefale å være forsiktig når man studerer trans-membran proteiner, ettersom påvisningen av interaksjoner kan være avhengig av lokaliseringen av Gaussia fragmenter på hver side av membranen. I disse tilfeller kan det være nødvendig å smelte de Gaussia fragmentene i den C-terminale ende av den ene eller begge parter. I tillegg kunne luciferase uttrykket påvirkes av en rekke parametre som transfeksjon effektivitet og celle nummer. Derfor vil vi på det sterkeste anbefale Føllgrunn normalisering fremgangsmåten beskrevet i protokollen seksjon for å ta hensyn til eksperimentelle variasjoner.
Ved å bruke ordnede rekker av ORF tatt fra den økende samling av Human ORFeome, ser vi for oss en gang i nær fremtid hvor HT-GPCA kunne brukes direkte som en screening metode. Dette skal først drastisk forbedre screening dekning ettersom hvert protein parene ville da bli testet, og for det andre bør det lette automatisering. Imidlertid bør en mer drastisk høy gjennomstrømning utvidelse av denne analysen tas av utviklingen av en in vitro HT-GPCA analysen ved hjelp av in vitro ekspresjonssystemer basert på menneskelige celle ekstrakter. Dette bør også gjøre det mulig å overvåke protein-protein interaksjoner i et kontrollert biokjemisk miljø.
Endelig er kommende utviklingen forventes å bedre visualisering av komplekse-mediert luminescens i levende celler. I så fall kunne HT-GPCA værebrukes til å detektere dynamiske interaksjoner i forbindelse med tilsetningen av medikamenter eller inhibitorer kompliserte og dermed gir bor overvåking av avbrudd av en interaksjon.
I alt utgjør denne tilnærmingen en effektiv disposisjon for eventuelle studier av patogen-host samspill og vi føler at komparative interactome analyser kunne gi et solid rammeverk for å forstå mikrobe kapringen av vertscellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis av midler fra Institut Pasteur og med tilskudd fra Ligue nationale contre le Cancer (tilskudd R05/75-129 og RS07/75-75), Foreningen pour la Recherche sur le Cancer (tilskudd ARC A09 / 1/5031 og 4867), og Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 og ANR09 MIEN 026 01). MM var en mottaker av en MENRT fellesskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
- Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
- Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
- de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
- Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
- Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
- Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
- Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
- Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
- Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
- Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).
