Summary
Este artigo centra-se na identificação de conjuntos de dados de interação de alta confiança entre hospedeiro e as proteínas do patógeno usando uma combinação de dois métodos ortogonais: levedura de dois híbridos seguido de um ensaio de interação de alto rendimento em células de mamíferos chamada HT-GPCA.
Abstract
Esforços significativos foram reunidos para gerar mapas de rede de interação grande escala global proteína-proteína. Isso é fundamental para compreender as relações patógeno-hospedeiro e foi essencialmente realizado por exames genéticos em leveduras sistemas de dois híbridos. A recente melhoria da detecção de interação proteína-proteína por um ensaio de complementação fragmento baseado luciferase Gaussia agora oferece a oportunidade de desenvolver abordagens integradoras interactomic comparativas necessárias para comparar rigorosamente perfis de interação de proteínas de diferentes variantes de deformação do patógeno contra um conjunto comum de fatores celulares.
Este trabalho concentra-se especificamente sobre a utilidade de combinar dois métodos ortogonais para gerar conjuntos de dados de interação proteína-proteína: levedura de dois híbridos (Y2H) e um novo ensaio, Gaussia princeps ensaio complementação proteína de alto rendimento (HT-GPCA), realizado em células de mamíferos.
nt "> A identificação em larga escala de parceiros celulares de uma proteína patógeno é realizada por meio de cruzamentos de levedura baseado em rastreios de dois híbridos de bibliotecas de cDNA, utilizando múltiplas variantes de deformação do patógeno. Um subconjunto de parceiros que interagem seleccionados numa pontuação maior confiança estatística é maior validado em células de mamíferos para interações de pares com todo o conjunto de proteínas variantes do patógeno usando HT-GPCA. Esta combinação de dois métodos complementares melhora a robustez do conjunto de dados de interação, e permite a realização de uma análise comparativa interação rigoroso. Tais interactomics comparativos constituem uma estratégia confiável e poderoso para decifrar qualquer interplays patógeno-hospedeiro.Introduction
O aumento da quantidade de dados coletados para gerar mapas de interação proteína-proteína abre perspectivas para entender melhor as infecções do patógeno. A compreensão global das infecções de agentes patogénicos começa a surgir, proporciona acesso à gama de perturbações induzidas por proteínas de agentes patogénicos ao ligar o proteoma humano 1. É, assim, oferece uma maneira de compreender como patógenos manipular a maquinaria da célula hospedeira. Em particular, o mapeamento de várias redes de interacção hospedeiro-viral revelou que as proteínas virais como alvo proteínas do hospedeiro, preferencialmente, que são altamente ligados em rede celular (cubos), ou que são o centro de muitos caminhos na rede (proteínas estrangulamentos) 2-4. Essas interações permitem que os vírus para manipular processos celulares importantes, o que é fundamental para reproduzir e produzir descendência infeccioso. Comparada interações mapeamento foram recentemente realizados sobre vírus relacionados com o objetivo de extrair informações relativas àpatogénese 4. Além disso, estudos do host patógenos interações paisagem foram estendidos para muitos patógenos 5. A identificação de fatores de célula alvo fornece insights sobre as estratégias utilizadas pelos patógenos para infectar as células e permite a detecção de marcadores potenciais patogênicos.
O sistema de dois híbridos de levedura é o método mais popular para identificar interacções binários desde rastreio genético é uma ferramenta eficiente e sensível para o mapeamento de alto rendimento de interacções proteína-proteína. A abordagem aqui proposta melhora ainda mais a exames Y2H individuais, avaliando uma proteína de patógenos múltiplas variantes de tensão, proporcionando assim o acesso a uma visão comparativa das interações proteína-proteína patógeno-hospedeiro. Além disso, a maior limitação do rastreio de levedura de dois híbridos reside numa elevada taxa de falsos negativos, uma vez que se recupera cerca de 20% do total das interacções 6. Isto implica que as interacções detectados com apenas um subconjunto dos agentes patogénicosgens variantes podem ter escapado à detecção com os outros. Portanto, parceiros individuais emergentes de todos os exames de dois híbridos são mais desafiados para a interação com a gama completa de cepas estudadas, fornecendo conjuntos de dados de interação comparativos. Uma vez que foi demonstrado que a combinação de diferentes metodologias aumenta fortemente a robustez da interacção proteína-proteína conjuntos de dados 7, esta validação é realizada em células de mamíferos por um ensaio de complementação da proteína-fragmento recentemente desenvolvido chamado HT-GPCA 8. Este sistema baseado em células permite a detecção de interacções proteicas por complementação da Gaussia princeps dividir luciferase e foi concebido para ser compatível com um formato de alto rendimento. Graças à sua tecnologia baseada em luminescência e seu baixo ruído de fundo em comparação com outro ensaio baseado em fluorescência, HT-GPCA mostra uma impressionante alta sensibilidade.
No geral, esta abordagem constitui uma eficienteferramenta para gerar um mapeamento abrangente de interplays patógeno-hospedeiro, o que representa o primeiro passo em direção a uma compreensão global da célula hospedeira seqüestro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Levedura Screenings dois híbridos
- Faça as seguintes soluções necessárias:
- Completa Fora gota sintético (SD): Dissolver 26,7 g de base de DP mínimo com glucose em 1 L de água. Adicionam-se 2 g de uma mistura de aminoácidos preparada como se segue: 2 g de hemi-sulfato de adenina, 2 g de arginina HCl, 2 g de histidina HCl, 2 g de isoleucina, leucina 4 g, 2 g de Lisina, 2 g de Metionina, Fenilalanina 3 g, 2 g de L -serina, 2 g de L-Treonina, Triptofano 3 g, 2 g de tirosina, 1,2 g de uracilo, 9 g Valina.
- Gota seletiva Out SD-L/-W/-H: SD contendo todos os aminoácidos essenciais, exceto os especificados (-L:-Leucina;-W:-Triptofano;-H:-histidina).
- YPGLU: para 1 L, em peso, 10 g de extracto de levedura, 10 g de Bacto-peptona e 20 g de glicose. Completo com 25 g Bacto ágar para meio sólido.
- YCM: Igual ao YPGLU, mas o pH ajustado para 4,5.
- Acasalamento e espalhando
- Use aliquotas congeladas de pré-transformed estirpe de levedura Y187 (tipo acasalamento α), contendo uma biblioteca de cDNA clonado em pACT2. Verificar a viabilidade celular por plaqueamento de diluições em série em placas de SD-G.
- Clonar o ORF patógeno em pGBKT7 vetor, e transformar o plasmídeo recombinante usando um procedimento padrão em AH109 cepa de levedura (um tipo de acasalamento).
- Espalhe pGBKT7 transformada AH109 fermento em placas SD-W. Incubar pelo menos dois dias de 30 ° C num incubador humidificado. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C até que o rastreio de dois híbridos.
- Utilização de 3-aminotriazole (3-AT), um inibidor competitivo da enzima HIS3, para contrariar o potencial de auto-transactivação do gene repórter HIS3 de proteínas dos agentes patogénicos. Realizar um teste de auto-activação através da determinação da concentração de 3-AT, que impede o crescimento de levedura pGBKT7-transformado em placas SD-W/-H.
- Semente 30 ml de SD-W com poucas colônias de pGBKT7 transformada AH109. Incubar 30 horas a 30 ° C com rotação.
- Sementes 200 ml de SD-W com o 30 mlAH109 das culturas. Incubar, com rotação a cerca de 20 horas a 30 ° C.
- Incubar descongeladas biblioteca de cDNA-Y187 transformada em 20 ml YPGLU, incubar 10 min a 30 ° C com rotação.
- Centrifugar um volume de pGBKT7-AH109 cultura transformada correspondente a uma quantidade equivalente de células de levedura Y187 viáveis durante 5 min a 3500 rpm a 20 ° C. Retirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 ml de YPGLU.
- Misture o sedimento de levedura AH109 com Y187 contendo biblioteca. Transferir num tubo de 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 3500 rpm a 20 ° C, o sobrenadante cuidadosamente retirada (pelete frágil).
- Ressuspender o sedimento em YPGLU para obter um total de 1,5 ml.
- Espalhe fermento para 3 YCM-Agar placas de 150 mm, 0,5 ml / placa. Incubar 4,5 horas a 30 ° C.
- Recolha de levedura acoplado YCM de placas por raspagem com um rodo de vidro em 10 ml de SD-L/-W/-H. Lavar as placas duas vezes com 5 ml de meio e SD-L/-W/-H piscina.
- Centrifugar 5 min a 3500 rpm, 20° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de levedura em 5 ml de meio SD-L/-W/-H.
- Espalhe levedura acoplado em placas de 10 (0,5 ml / placa) de SD-L/-W/-H Agar suplementado com a concentração apropriada de 3-aminotriazole (3-AT), determinada no teste de auto-activação. Incubar a 30 ° C numa atmosfera húmida durante 6-10 dias.
- Determinar a taxa diplóide (2n), a fim de avaliar a eficiência de acoplamento por difusão 250 ul de diluições em série (10 -4 a 10 -6) da suspensão de levedura acoplado em placas SD-L/-W. Incubar as placas a 30 ° C durante dois dias. Contagem das colónias cultivadas em SD-L/-W, e deduzir o número total diplóide presente no volume inicial de levedura acoplado. Denunciar este número diplóide para viável número levedura biblioteca contendo para calcular a taxa diplóide. Ele deve variar de cerca de 10-25%.
- 6-10 dias após incubação a 30 ° C, escolher colônias de leveduras acasaladas em SD-L/-W/-H fresco + 3-AT placas. [Dica: para o fermento em um esquema de 8pistas de 12 cavidades que reproduzem uma placa de 96 poços de modo que será mais fácil depois para sequenciação]. Deixe colónias de levedura crescer durante 4-5 dias a 30 ° C numa atmosfera húmida.
- Triagem de His3 clones positivos por PCR e seqüenciamento
O objectivo é o de amplificar por PCR a ORF contida nos vectores pACT2 de colónias de leveduras cultivadas em placas SD-L/-H/-W selectivos.- Colocar uma placa de 96 poços de PCR em gelo.
- Para lisar as células de levedura, adicionar 50 ul por poço de uma solução Zymolase 20T (2,5 mg / ml em 10 mM de Hepes pH 7,7).
- Delicadamente ressuspender uma colônia por poço.
- Incubar 15 min a 37 ° C e 15 min a 95 ° C.
- Colocar a placa de volta em gelo. Adicionar 50 ul de água destilada por poço. Misture bem por pipetagem cima e para baixo.
- Centrifugar durante 5 minutos a 3.500 rpm e 4 ° C.
- Amplificar por PCR de 10 jil para detectar uma inserção utilizando iniciadores de recozimento ambos os lados da ORF derivados de ADNc em vectores de pACT2. O protocolo é gada para a amplificação de 96 colónias de leveduras lisadas com a polimerase de ExTaq. Preparar a seguinte mistura: 525 ul de tampão 10X ExTaq, 420 ul da mistura de dNTPs (2,5 mM), 10,5 ul de iniciador directo (1 ug / ul), 10,5 ul de iniciador reverso (1 ug / ul), 31,5 ul ExTaq (5 U / ul ) e 3202,5 ul de H 2 0. Distribuir 40 ul da mistura por poço numa placa de PCR de 96. Adicionar 10 ul de levedura lisada por poço. Realizar a amplificação como se segue: 94 ° C durante 3 min, depois 35 ciclos a 94 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 4 min, e no final com 72 ° C durante 7 min. Executar 3 ul dos produtos de PCR num gel de agarose a 1,2% para detectar clones de PCR-positivas. Note que a utilização de pré-molde de 96 cavidades de géis de agarose é recomendada.
[Dica: placa pode ser armazenada a -20 ° C durante alguns meses e reutilizada para nova PCR] - Sequência os fragmentos amplificados de PCR a partir de isolados HIS3 clones positivos. Faça uma análise BLAST para identificar celular ORF. Alinhamentos de baixa confiança (E & valorgt, 10 -10, identidade <80%, o comprimento de péptidos <20 aminoácidos) são eliminados, bem como frameshifted e codão de paragem prematuro contendo sequências.
2. Edifício Matriz para HT-GPCA
HT-GPCA é um ensaio à base de células de mamífero em que ambas as proteínas de agentes patogénicos e de acolhimento são transitoriamente expressa fundida com fragmentos complementares da divisão Gaussia princeps luciferase. Após a interacção dos parceiros, esta enzima é reconstituído permitindo a medida da sua actividade enzimática. A intensidade da interacção é assim deduzido a partir de uma Proporção Normalizada luminescência (ver abaixo e na Figura 1)
- Selecção de parceiros celulares hospedeiras
- Escolha proteínas que são identificados mais de três vezes nos rastreios Y2H para validação adicional em células de mamíferos para aumentar a confiança do conjunto de dados 9.
- Adicionar conhecidos parceiros que interagem com as proteínas do patógeno como positive controlos.
- Transferência em vetores compatíveis HT-GPCA
- Clone cada proteína patógeno ORF num vector pSPICA-N2 para gerar proteínas de agentes patogénicos com aminoácidos 110-185 dos princeps Gaussia humanizados luciferase fundidos os seus N-terminus (fusões de proteínas GL2-agente patogénico).
- PCR amplificar o ORF da proteína celular directamente a partir dos clones positivos Y2H ou de outros recursos ORF (ORFeome Humano http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) e transferi-los em vectores pSPICA-N1 para gerar proteínas fundidas no terminal N com os aminoácidos 18-109 da humanizado Gaussia princeps luciferase (fusões de proteínas GL1-anfitrião).
[Dica: Para a clonagem em larga escala, o sistema de clonagem Gateway é recomendado. Nesse caso, para a amplificação por PCR, utilizar iniciadores concebidos para conter locais compatíveis gateway]. - Sequência de todos os vetores de expressão. Seqüências do pSPICA-N1 e N2-pSPICApode ser encontrado na referência 8.
Note-se que construções de plasmídeos pode ser invertida, ou seja, proteínas patógenos em pSPICA-N1 e proteína do hospedeiro em pSPICA-N2.
3. High-Throughput Gaussia princeps luciferase à base de proteínas Ensaio de Complementação (HT-GPCA)
- Transfecção celular
- Semente células 293T de 350.000 células / mL de meio DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS) sem nenhum antibiótico. Distribuir 100 ^ l / poço em placas de cultura estéreis branco. Não exceder 10 placas em um único experimento. Deixe as células crescer durante 24 horas a 37 ° C com 5% de CO 2.
[Dica:. PSPICA Uma vez que os plasmídeos contêm uma origem de SV40, o uso de células 293T permite a sua replicação em células transfectadas e, portanto, conduz a sobre-expressão de dois fragmentos de luciferase] - No dia seguinte, as células transfecção usando qualquer protocolo de transfecção adequado. Note-se que para certos reagentes de transfecção, o number de células semeadas pode ter de ser adaptado. Utilização de 100 ng por poço de ambas hospedeiro do agente patogénico e ORF construções de plasmídeos. A co-transfecção de 10 ng por poço de um de CMV-luciferase do pirilampo plasmídeo para normalizar para a eficiência de transfecção. Cada ponto é testado em triplicata.
[Dica:. Misturas de ADN pode ser realizada um dia antes da transfecção e armazenadas a -20 ° C, com vedantes adesivas] - Transferir a mistura de transfecção das placas de cultura de células 293T. Ter cuidado para depositar suavemente a mistura de ADN para as células, como 293T não são fortemente aderente e facilmente separar a partir do fundo do poço. Incubar numa incubadora de cultura de células 24-30 horas a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Semente células 293T de 350.000 células / mL de meio DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS) sem nenhum antibiótico. Distribuir 100 ^ l / poço em placas de cultura estéreis branco. Não exceder 10 placas em um único experimento. Deixe as células crescer durante 24 horas a 37 ° C com 5% de CO 2.
- A lise celular e Gaussia luciferase dosagem
- Lavar as células com PBS (100 ul / poço). Adicionar 40 de tampão de lise 1X Renilla ul. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente, sob agitação.
- Economize 10 ml de lisados celulares em outra plataforma brancoe para posterior dosagem da atividade da luciferase Firefly. Armazenar a 4 ° C ou, alternativamente, à temperatura de -20 ° C, com vedação.
- Medir a actividade Gaussia nos restantes 30 ul de lisados de células por adição de 100 ul de reagente de ensaio de luciferase de Renilla e contando luminescência durante 10 segundos com um luminómetro. Dosagem de uma placa de 96 poços leva cerca de meia hora. Realizar medição com extratos de células frescas desde estocagem ou a longo prazo pode afetar a atividade Gaussia interação mediada.
- Mensuração da atividade Firefly
- Medir a actividade Firefly no salvo 10 ul de lisados de células por adição de 50 uL de reagente de ensaio de luciferase do vaga-lume e contando luminescência durante 10 seg. Dosagem de uma placa de 96 poços leva cerca de meia hora. [Dica: A dosagem de luciferase de pirilampo podem ser realizadas no dia seguinte em lisados congelados.]
- Cálculos NLR
- Para monitorar a interação, estimar uma relação de luminescência Normalizada (NLR) para cada par patógeno-hospedeiro. Para isso, divide a actividade normalizada Gaussia luminescência detectada na presença de ambos, do patógeno e proteínas do hospedeiro pela soma das actividades medidas nos poços de controlo (Figura 1 adaptada de referência 8). O NLR valor de corte para interações positivas foi estimado em cerca de 3,5 8.
- A análise dos dados
- Realizar agrupamento hierárquico utilizando o pacote estatístico R. Em primeiro lugar, agrupar os dados em categorias NLR, em seguida, calcular um dendrograma interação utilizando o método de ligação completa. Visualize estedendrograma com JavaTreeView 10. Calcular a distância entre dendrograma interação e árvore filogenética usando um coeficiente de correlação de Pearson.
- Para gerar redes de interação, selecione as interações positivas do conjunto de dados HT-GPCA e usar o software Cytoscape 1. Extraia os graus das proteínas do hospedeiro e traçar a sua distribuição para acessar as dinâmicas locais de rede. Redes Host-patógenos pode ser sobreposto ao interactome host para fornecer uma avaliação do impacto global das proteínas do patógeno na rede de celular do hospedeiro.
- Extraia o GO (Gene Ontology) termos associados aos fatores celulares específicos com o banco de dados DAVID bioinformática 12 para avaliar o enriquecimento funcional do conjunto de dados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uma grande força de HT-GPCA reside na sua elevada sensibilidade, tal como ilustrado pela avaliação das taxas de falsos positivos e falsos negativos para a proteína E2 de HPV na Figura 2 (adaptado da referência 13). Para determinar a taxa de falsos negativos, interacções conhecidas de E2 de HPV16 foram avaliadas por HT-GPCA (Figura 2A). Quatro dos 18 interacções não foram recuperados (correspondente a uma taxa de falsos negativos de 22%). As interacções de falsos positivos foram medidos a 5,8%, utilizando proteínas de HPV 12 E2 contra um conjunto aleatório de proteínas celulares (Figura 2B). Além disso, a forte especificidade do método é realçada na Figura 2C mostra que um único ponto de mutação conhecidos para interferir com a ligação E2 ao seu parceiro de células BRD4 aniquila o rácio NLR (Figura 2C).
Esta abordagem interactomic comparativa em larga escala tem sido recentemente aplicado com sucesso a três pró precoceas proteínas de papilomavírus humanos (HPV): E2, E6 e E7 proveniente de diferentes genótipos representativa da diversidade natural HPV em tropismos e patologias 13,14. Para cada uma das proteínas precoces, agrupamento hierárquico dos perfis de interação principalmente HPV recapitula a filogenia, comprovando a robustez da abordagem e da pertinência de conjuntos de dados de interação (Figura 3 adaptados a partir de referências 13 e 14). Ele pode ser utilizado para correlacionar os perfis específicos de interacções vírus-hospedeiro com características patológicas, dando assim indícios do envolvimento de proteínas virais na patogénese. Interacções específicas do genótipo pode ser extraído, que correspondem potencialmente patogénicos ou tropismo para os biomarcadores como mostrado na Figura 4 para as proteínas E6 de HPV (Figura 4 adaptado da referência 14).
Além disso, conhecimentos funcionais podem surgir a partir de tais análises em larga escala. Por exemplo, no estudo de interactomicas proteínas E2 do HPV, a análise funcional de enriquecimento levou à identificação de uma família importante que consiste em factores de transcrição celular, em conformidade com a função primária de E2 como um regulador da transcrição viral. É também revelada uma segmentação funcional inesperado da máquina tráfico intracelular, abrindo novas perspectivas para o papel de E2 no HPV patogénese 13.
Em geral, os estudos comparativos realizados interatómicas com as proteínas precoces de HPV melhorar significativamente a compreensão da patogénese de HPV, correlacionando perfis interacções específicas para diferenças fenotípicas.
Figura 1. A identificação de interacções proteína-proteína utilizando HT-GPCA. Ambos patógeno hospedeiro e proteínas são fundidas com uma inacmetade tivo do Gaussia princeps luciferase (partes GL2 e GL1, respectivamente). Quando as proteínas estão interagindo, uma actividade da luciferase é induzida pela proximidade de ambas as metades da enzima. A actividade da luciferase Gaussia restaurado é calculado a partir de uma Proporção Normalizada luminescência (NLR), como mostrado no lado direito. Figura adaptada de referência 8. clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Características HT-GPCA. (A) 18 interacções extraídos a partir da literatura que envolve a proteína E2 de HPV 16 e as proteínas celulares foram testados por HT-GPCA de modo a estimar a taxa de falsos negativos associados a esta t echnique. A relação NLR são representados como um gradiente de cor (mapa de calor), com uma escala de preto (sem interação) à luz (interação forte) azul. Quatro interações conhecidas não foram recuperados (setas vermelhas), dando uma estimativa aproximada da taxa de falso-negativo em torno de 22%. (B) 12 proteínas E2 de HPV foram testados com 10 proteínas celulares escolhidas aleatoriamente, o que corresponde a um priori interacções negativas, a fim de determinar a taxa de falsos positivos do HT-GPCA, que teve cerca de 5,8%. (C) A interacção entre a proteína celular BRD4 e HPV16 ou HPV18 proteínas E2 é conhecida por depender dos aminoácidos e I73 I77 respectivamente. Quando esses aminoácidos são mutantes, o HT-GPCA NLR cai com uma redução de 5-time demonstrando uma alta especificidade de detectar interações. Figura adaptada da referência 13. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 3. Comparação entre os dendrogramas experimentais baseadas em interacção e HPV árvores filogenéticas. A filogenia do HPV com base no início de proteínas E2 (A), E6 (B) ou E7 (C) sequências são representadas no lado esquerdo de cada gráfico. Dendrogramas de interação foram obtidos por agrupamento hierárquico dos perfis de interação de cada proteína e são representados à direita. Observou-se uma congruência significativa entre os dois tipos de árvore, com agrupamento semelhante dos tipos patológicas (retângulos coloridos), comprovando a pertinência dos conjuntos de dados de interação. Figura adaptada a partir de referências 13 e 14. Clique aqui para ver maior figgurar.
Figura 4. Representação esquemática dos E6 principais alvos celulares. Alvos celulares foram classificadas com base na intensidade de interação e agrupados de acordo com a interação tipo de HPV. Esta representação permite a identificação de biomarcadores específicos, tais como FADD, que interage apenas com as proteínas E6 de HPV oncogênicos. Tal direccionamento deve ser crucial para a característica cancerígena de todos os HPV oncogênicos, e constitui, portanto, um bom candidato para ser usado como um marcador para a infecção pelo HPV ou como um alvo terapêutico. Figura adaptado da referência 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Independentemente, o fermento e dois ensaios de interação híbridos e mamíferos, como GST pull-down, lumier ou MAPPIT, provaram ser ferramentas eficazes para detectar interações proteína-proteína, mas são limitados pela alta taxa de falso-positivos e falso-negativos interacções associadas com estas técnicas 15. Além disso, a evidência crescente de que a combinação de métodos ortogonais aumenta a confiabilidade do conjunto de dados de interação obtidas 7. O desenvolvimento recente da técnica HT-GPCA aqui descrita, não só melhora a sensibilidade de detecção de interacção proteína-proteína em células de mamíferos binário, mas também oferecida a possibilidade de lidar com uma grande quantidade de interacções de uma vez.
A estratégia descrita aqui melhora a cobertura de exames Y2H individuais sondando interações de múltiplas variantes de tensão. Além disso, novos testes interações com um método de detecção ortogonal fornece interação comparativa rigorosaconjuntos de dados ção, por superar as limitações e escapar artefatos inerentes à metodologia de dois híbridos. Com efeito, uma vez que HT-GPCA tem lugar em células de mamíferos, as modificações pós-traducionais e localização subcelular das proteínas naturais não são afectados. A nossa abordagem pode, assim, produzir, num único passo de interacção mapas que são melhoradas, quando comparados com os que se baseiam principalmente na levedura de dois híbridos para a interacção de detecção 4.
Neste ponto, embora, recomendamos ser cuidadoso ao estudar as proteínas de trans-membrana, uma vez que a detecção de interacções pode depender da localização dos fragmentos Gaussia em ambos os lados da membrana. Nestes casos, pode ser necessário para fundir os fragmentos Gaussia na extremidade C-terminal de um ou ambos os parceiros. Além disso, a expressão de luciferase pode ser influenciado por vários parâmetros, tais como a eficiência da transfecção e o número de células. Portanto, nós recomendamos fortemente exerdevido o procedimento de normalização descrito na seção de protocolo, a fim de ter em conta as variações experimentais.
Usando matrizes ordenada de ORF tomadas da crescente coleção de ORFeome Humano, prevemos um ponto no futuro próximo, onde HT-GPCA pode ser usado diretamente como um método de triagem. Isto deve melhorar drasticamente a primeira cobertura de rastreio de proteínas uma vez que cada pares iria então ser testado, e em segundo lugar, deve facilitar a automatização. No entanto, uma expansão mais drástica de alto rendimento deste ensaio devem ser trazidos pelo desenvolvimento de um ensaio in vitro utilizando HT-GPCA em sistemas de expressão in vitro com base em extractos de células humanas. Este também deve permitir monitorar interacções proteína-proteína em um ambiente bioquímico controlada.
Finalmente, espera-se desenvolvimentos futuros para melhorar a visualização de luminescência mediada por células vivas em. Nesse caso, o HT-GPCA poderia serutilizado para detectar interacções dinâmicas no âmbito da adição de drogas ou inibidores de complexos, permitindo assim o controlo directo de rompimento de uma interacção.
Ao todo, esta abordagem constitui um esquema eficiente para todos os estudos de interação patógeno-hospedeiro e sentimos que as análises comparativas interactome poderia fornecer uma estrutura sólida para entender micróbio seqüestro de células hospedeiras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelo financiamento do Institut Pasteur e por doações da Ligue nationale contre le Cancer (subvenções R05/75-129 e RS07/75-75), a Association pour la Recherche sur le Cancer (subvenções ARC A09 / 1/5031 e 4867), e da Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 e 026 01 ANR09 MIEN). MM era beneficiário de uma bolsa MENRT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
- Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
- Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
- de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
- Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
- Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
- Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
- Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
- Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
- Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
- Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).
