Summary
Pyrosequencing은 박테리아를 식별하는 균주를 구별하고, 항균 에이전트에 저항성을 부여하는 유전자 변이를 감지하는 데 사용할 수있는 미생물 게놈 시퀀싱을 용이하게하는 다양한 기술입니다. 이 비디오에서는, 미생물 amplicon의 생성,의 amplicon의 pyrosequencing 및 DNA 염기 서열 분석을위한 절차를 설명합니다.
Abstract
Pyrosequencing은 박테리아를 식별하는 균주를 감별 및 항균 에이전트에 저항성을 부여하는 유전자 변이를 감지하는 데 사용할 수있는 미생물 게놈 시퀀싱을 용이하게하는 다양한 기술입니다. 미생물학 응용 프로그램에 대한 pyrosequencing의 장점은 신속하고 신뢰성 높은 처리량 검사 및 미생물 및 미생물 게놈 변이의 정확한 신원이 (가) 있습니다. Pyrosequencing은 합성 반응 중에 포함 된 특정 염기의 존재를 결정하면서 보완 가닥 한 번에 하나의 기지를 합성하여 DNA 시퀀싱 포함한다. 반응은 네 가지 deoxyribonucleotides (dNTP)이 순차적으로 추가하고 비법 dNTPs는 합성 반응에 대한 다음 dNTP를 첨가하기 전에 효소로 분해되어있다 고정 된 단일 가닥 주형 DNA에 발생합니다. 템플릿에 포함 된 특정 자료의 검출은 chemilum의 생성에 의해 모니터링inescent 신호. 화학 발광 신호를 생성 dNTPs의 순서는 템플릿의 DNA 순서를 결정합니다. pyrosequencing 기술의 실시간 시퀀싱 기능은 하나의 분석의 급속한 미생물 식별 할 수 있습니다. 또한, pyrosequencing 악기, SNPs를, 점 돌연변이, 삽입 및 삭제뿐만 아니라 일부 항균성 저항에서 발생할 수있는 여러 유전자 사본의 정량화 입력 등의 항균성 약물 저항의 전체 유전 적 다양성을 분석 할 수 있습니다 패턴입니다.
Introduction
Pyrosequencing은 "합성 순서"의 원리에 근거 시퀀스 핵산 산에 신속하고 정확한 방법입니다. "합성 시퀀싱은"한 번에 상보적인 가닥 하나의 기본을 합성 한 가닥의 DNA 템플릿을 사용하고 통합베이스 (A, T, G, 또는 C) 화학 발광 신호를 검출하여 각 단계에서 감지 포함한다. pyrosequencing 반응은 주형 DNA, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA 중합 효소, ATP sulfurylase, 루시페린, 루시퍼, 그리고 apyrase가 포함되어 있습니다. 합성 반응은 네 가지 dNTPs와 단일 좌초 바이오틴 템플릿 DNA에 DNA 중합 효소 중 하나의 추가에 의해 시작됩니다. DNA 중합 효소는 피로 인산의 후속 릴리스 (그림 1), 템플릿 위에 보완 dNTP를 포함합니다. ATP sulfurylase 비례 ATP에 피로 인산으로 변환합니다. ATP는 어떤 oxyluciferin에 루시페린의 루시 페라 제 - 매개 변환을위한 촉매 역할을등 (그림 2)를 생성합니다. 빛의 강도는 통합 된 뉴클레오티드의 수에 비례 하나 이상의 특정 dNTP의이 (dATP, dTTP, dGTP, dCTP 또는) 순차적으로 템플릿 가닥 (그림 3)에 있는지 확인합니다. 어떤 비법 dNTP 전에 합성 반응의 연속은 다음 dNTP의 추가에 apyrase로 저하됩니다. 단일 가닥 DNA 템플릿의 DNA 순서가 결정 될 때까지 "합성 순서"반응은 네 가지 dNTPs의 각 추가로 반복됩니다.
pyrosequencing 반응의 애니메이션을 보려면 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Protocol
소개 : 하나의 세균성 식민지가 하룻밤 배양하는 적절한 배양액을 접종하는 데 사용되어야한다. 박테리아 펠렛은 다음 시판 게놈 분리 키트를 사용하여 게놈 DNA를 정화 처리됩니다. 정제 된 게놈 DNA는 280분의 260 (NM) 비율에게 샘플 단백질 오염 무료입니다 보장하기> 1.8이 있어야합니다. pyrosequencing 템플릿의 생성에 필요한 게놈 DNA의 양이 10-20 NG입니다.
템플릿의 A. 증폭
(PyroMark PCR 수첩, www.qiagen.com / 핸드북 1)
PCR 반응을 설정
참고 : 하나의 프라이머의 5 '말단에로 만들었다해야하며, 그것이이 템플릿 준비를 위해 정제 HPLC하는 것이 좋습니다. 우리는 PCR 및 SE에 대한 PyroMark 분석 설계 소프트웨어 2.0을 추천합니다짧은 읽기 시퀀싱에 최적화 된 quence 프라이머 디자인은, 그러나, 프라이머-BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome NCBI에서)도 할 수 있습니다 프라이머 디자인에 사용할 수.
- 필요한 모든 솔루션 (표 1) 해동 각 철저히 섞는다. 표 1에 따라 반응을 설정합니다. 모든 작업은 상온에서 수행 할 수 있습니다.
참고 : PCR Master Mix는 대부분의 경우 만족스러운 결과를 제공하는 1.5 mm의 최종 농도에 대한 MgCl 2를 포함합니다. 높은 마그네슘 2 + 농도가 필요한 경우, 25 mM의 MgCl 2의 최대 3.5 μL를 반응에 추가 할 수 있습니다.
- 철저하게 부드럽게 위아래로 pipetting에 의해 반응 믹스를 혼합 한 후 PCR 튜브에 적절한 볼륨을 분배.
- templat 추가각 PCR 튜브에 전자 DNA. 우리는 게놈 DNA의 10 NG를 추천합니다.
- 표 2에 따라 열 자전거 타는 사람을 프로그램입니다. 4에서 마지막 홀드 ° C는 편의를 위해 권장됩니다. 100 μL 미네랄 오일을 가열 뚜껑없이 열 자전거 타는 사람을 사용하는 경우, 오버레이는 반응.
- 자전거 타는 사람에 PCR 튜브를 삽입하고 순환 프로그램을 시작합니다.
B. 진공 워크 스테이션 프로토콜
바이오틴 PCR 제품을 고정
- 그림 4에 따른 마스터 믹스를 확인하십시오.
참고 : 피펫 전에 부드럽게 균일 한 현탁액을 보장하기 위해 스트렙 타비 딘 - 코팅 세파 비즈의 병을 흔들어.
- 사용되는 PCR 제품의 양에 따라 잘 당 80 μL의 총 볼륨을주는 PCR 플레이트의 각 웰에 60 ~ 75 μL 마스터 믹스를 분배.
- 각 well에 5-20 μL 바이오틴 PCR 제품을 추가합니다.
- 지구 CA와 우물을 밀봉궤도 셰이커를 사용하여 실내 온도 (15-25 ° C)에서 5 ~ 10 분 동안 1,400 rpm에서 PCR 플레이트 PS 및 교반.
DNA의 변성 및 프라이머 시퀀싱 추가
- 버퍼를 열처리와 0.3 μM로 시퀀싱 프라이머를 희석 반응 플레이트의 각 웰에 25 μl를 분배. 워크 스테이션에 접시를 놓습니다.
- 그림 5 그림에 따라 워크 스테이션 골짜기를 입력합니다.
- 진공 펌프를 켜고 진공 도구를 스위치 (그림 6)에 설정되어 있는지 확인합니다. 통 5 고순도 물 (밀리-Q 18.2 MW X cm 또는 동급) (그림 5)와 필터 프로브를 세척합니다. 12 단계에서 사용하기 위해 신선한 고순도의 물을 리필 통.
- 신속하게 작업, 워크 스테이션 구슬 PCR 플레이트를 배치합니다. 두 플레이트 샘플로드 된 때와 같은 방향으로되어 있는지 확인합니다.
- ON 진공 스위치, 진공을 낮출20 초 또는 모든 볼륨이 흡입 될 때까지 PCR 플레이트의 우물에 도구입니다. 구슬 진공 도구 (그림 7)에 의해 캡처됩니다.
- 아직도 진공, 20 초 동안 70 % 에탄올 (여물통 1) 도구를 세척 또는 모든 볼륨이 흡인 될 때까지.
- ON 진공, 20 초 동안 변성 용액 (여물통 2)와 도구를 세척 또는 모든 볼륨이 흡인 될 때까지.
참고 : 변성 솔루션은 눈과 피부에 자극이다 수산화 나트륨을 포함하고 있습니다. 항상 실험실 코트, 장갑 및 보호 안경을 착용하십시오.
- ON 진공, 20 초 동안 세척 버퍼 (여물통)로, 도구를 세척 또는 모든 볼륨이 흡인 될 때까지.
- ON 진공, 모든 액체가 진공 도구를 밖으로 배출 할 수 있도록 5 초 동안 90 ° 이상 수직으로 진공 도구를 올립니다. 펌프를 끄고, 반응 플레이트 진공 도구를 맞 춥니 다. 에 진공 도구를 낮 춥니 다우물은 부드럽게 우물 포함 시퀀싱 프라이머로 구슬을 풀어 좌우로 흔 듭니다.
- 진공 도구를 청소하기 위해 10 초 고순도 물 (트로프 4)에서 필터 프로브를 선동.
- ON 진공 전환하고 모든 볼륨이 흡입 될 때까지 20 초 또는 고순도 물 (통 5)로 도구를 세척하십시오.
- 5 초 동안 90 넘어 ° C 수직에 진공 도구를 올린 후 진공 OFF 스위치를 "주차"위치에 저장합니다.
DNA 가닥에 시퀀싱 프라이머를 어닐링
- 미리 예열 격판 덮개 홀더 반응 플레이트를 놓습니다.
- 2 분 80 가열 블록 ° C에서 접시를 가열한다.
- 5 분 동안 상온에서 냉각 카운터 홀더와 장소에서 플레이트를 제거합니다.
Pyromark Q24 운영
참고 : 전원 코드 위에있는 전원 스위치를 사용하여 기기의 스위치를 켭니다. 스타TUP는 1 분까지 걸릴 수 있습니다.
- PyroMark 골드 Q24 시약 지침서 제 2 권에 제공된 지침에 따라 카트리지를 입력합니다. 장비 소프트웨어의 실행 파일을 설정, 필요한 볼륨을 결정하고, 도구 메뉴에서 사전 실행 정보를 선택하려면
- 기기에 이미 경우, 실행을 수행되지 않도록하고 뚜껑을 엽니 다. 그렇게하는 것이 안전 할 때 뚜껑이 열리는 경우 가청 경보 신호가 방출 될 것입니다.
- 카트리지 문을 열고 레이블 (그림 8) 앞으로 향하게하여 카트리지를 삽입합니다. 카트리지가 제대로 (라인 앞에 표시되어야합니다) 삽입되어 있는지 확인하고 문을 닫습니다.
- 판 지주 프레임을 열고 기기 내부의 샘플 접시를 놓습니다.
- 판 지주 프레임과 악기 뚜껑 (그림 9)를 닫습니다.
실행을 시작
- 실행 파일을 USB 스틱을 삽입s는 기기의 전면에있는 USB 포트에 기기의 소프트웨어를 만들었습니다.
- 메인 메뉴에서 "실행"을 선택하고 "OK"를 누릅니다.
- 원하는 실행 파일을 선택하고 "선택"을 눌러 이동 화살표를 사용합니다.
참고 :이 장비는 모든 사전 설정 압력과 온도 수준 (이 작업은 몇 분의 시간이 소요될 수 있음)에 도달 할 때 시약을 조제하기 시작합니다. 실행 중에, 기기의 화면을 실시간으로 선택 잘 pyrogram를 표시합니다. 다른 우물의 pyrogram를 보려면 이동 화살표를 사용합니다.
실행을 완료
- 악기가 실행이 완료되었음을 확인하고 실행 파일을 USB 스틱에 저장되어있는 경우, "닫기"를 누릅니다.
- USB 스틱을 제거합니다. 실행이 완료되기 전에이 제거 된 경우, USB 스틱을 삽입합니다. "관리"및 "복사 저장되지 않은 뛰기"를 선택합니다.
- 실행 파일이 현재 열려 장비 소프트웨어를 사용하여 비교 분석 할 수 있습니다Identifire 소프트웨어를 사용하여 알려진 미생물의 라이브러리.
Representative Results
소프트웨어를 사용하여 일반적인 pyrosequencing 실행의 결과는 amplicon의 생성에 사용되는 정방향 및 역방향 프라이머의 위치 및 보존 16S 리보솜 순서 (그림 10)에서 pyrosequencing 반응에 사용되는 시퀀싱 프라이머를 보여줍니다. 프라이머 사이의 hypervariable 순서 사이트는 보존 시퀀싱 프라이머 (5'-TACATGCAAGTCGA)를 사용하여 박테리아 많은 수의 세균 식별 할 수 있습니다. 내부 품질 관리로, DNA 시퀀스 브라케팅 변수 영역이 올바른 DNA 영역이 분석되었음을 보장하기 위해 검사 할 수 . pyrosequencing 소프트웨어는 세균의 식별을위한 박테리아 리보솜 시퀀스의 내부 데이터베이스에 생성 된 시퀀스의 비교 및 정렬 할 수 있습니다. 또한, 순서는 항생제 약물 내성을 부여 변이를 결정하기 위해 분석 할 수 있습니다. Helicob의 23S 리보솜 유전자의 돌연변이의 예를 들어, 분석acter pylori 감염은 항생제 내성을 부여하는 두 변이 패턴 (GAA 또는 AGA) (그림 11)를 보여줍니다. 같은 환자에서 여러 균주의 분석은 동시에 미생물 약제 내성 발생의 역학 조사에 도움이 시간이 지남에 약물 저항의 출현을 추적 할 assayed 수 있습니다.
그림 1. 바이오틴 PCR 제품은 파이로 인산 (PPI)의 생성으로 이어지는, DNA 중합 효소에 의해 dNTPs를 통합하는 템플릿으로 사용됩니다.
그림 2. ATP sulfurylase 비례 프로입니다 빛을 생성 oxyluciferin에 루시페린의 루시 페라 제 - 중재 변환을위한 촉매로 ATP. ATP의 역할에 피로 인산으로 변환ATP의 양에 비 례. 빛이 pyrogram 추적에 최대로 기록 염기 결합을 나타냅니다. 다음 dNTP가 합성의 연속에 대한 추가되기 전에 비법 dNTPs는 apyrase에 의해 성능이 저하됩니다.
그림 3. 하나 이상의 특정 dNTP의이 (dATP, dTTP, dGTP, dCTP 또는) 순차적으로 템플릿 가닥에 포함 된 경우 생성 된 빛의 강도를 나타냅니다.
그림 4. 바이오틴 PCR 제품을 무력화하는 마스터 믹스의 준비를위한 플로우 차트.
GE = "항상"> 그림 5. PCR 플레이트, PyroMark 판과 저점의 위치와 PyroMark 워크 스테이션.
그림 6. 위치 ON과 OFF 진공 스위치의 위치.
그림 7. 진공 도구입니다. 진공 도구의 적절한 취급.
그림 8. 카트리지 게이트 위치에 카트리지를 열었습니다.
그림 9. 문이 닫힌 카트리지가 올바르게 삽입.
그림 10. 기반 박테리아 식별 결과를 Pyrosequencing. PCR 프라이머는 DNA 템플릿의 보존 지역을 위해 설계되었으며, 시퀀싱 프라이머의 amplicon (파란색으로 표시)에서 잘 특성화 식별 hypervariable DNA 서열의 상류에 즉시 배치됩니다.
그림 11. pyrosequencing을 사용하여 헬리코박터 파일로리의 항생제 약물 저항의 검출. GAA 또는 AGA 시퀀스를 포함하는 헬리코박터 항균 저항을 부여 23S 유전자의 돌연변이 분석. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
| 반응 볼륨 당 | 최종 농도 | |
| 파이 PCR 마스터 믹스, 배 | 12.5 μL | 1X |
| CoralLoad 집중, 배 | 2.5 μL | 1X |
| 25 mM의 MgCl 2 (선택 사양) | 변하기 쉬운 | ≥ 1.5 밀리미터 |
| 배 Q-솔루션 (옵션) | 5 μL | 1X |
| 프라이머 / 프라이머 B | 변수 / 변수 | 0.2 μM/0.2 μM |
| RNase가없는 물 | 변하기 쉬운 | - |
| 총 양 (템플릿 DNA를 추가 한 후) | 25 μL |
표 1. PCR 반응 혼합물.
| & NBSP의; | 추가 의견 | ||
| 초기 PCR 활성화 단계 | 15 분 | 95 ° C | HotStartTaq DNA 중합 효소가 활성화됩니다 |
| 3 단계 순환 : 변성 | 30 초 | 94 ° C | |
| 가열 냉각 | 30 초 | 60 ° C 56 ° C | 게놈 DNA에 대한 아황산 수소 변환 DNA에 대한 |
| 확장 | 30 초 | 72 ° C | |
| 사이클의 수 | 45 | ||
| 최종 확장 | 10 분 | 72 ° C |
표 2. PCR 사이클 사양.
Discussion
몇 가지 새로운 차세대 시퀀싱 방법이 상용화되었다. 가장 널리 사용되는 방법의 세 가지 다음 방법 중 3-11은 각각 합성 순서에 따라 달라집니다. 이온 반도체 연속, 단일 분자 실시간 시퀀싱 및 합성 (SBS)에서 연속이지만 법인 핵산의 검출을위한 새로운 플랫폼을 사용합니다. 이온 반도체 서열에서 DNA의 단일 가닥 서열 가닥의 템플릿 역할을합니다. 12 중합 효소 및 핵산 순차적으로 pyrosequencing에서와 같이 추가됩니다. 뉴클레오티드가 성장하는 DNA 가닥에 추가 될 때, 수소 이온이 해제됩니다. 수소 이온이 전계 효과 트랜지스터 기반의 센서에 의해 감지됩니다.
단일 분자 실시간 시퀀싱 제로 모드 도파관 (ZMW)에 따라 달라집니다. 13 ZMW는 단일 효소 분자가 잘 하단에 부착되는 작은 구조입니다. 그것은 그 플로 같은 방법으로 켜집니다냄새 분자를 감지 할 수 있습니다. 각각의 뉴클레오티드 형광 분자로 태그됩니다. 찬란 태그 염기가 통합 될 때, 감지기는 염기를 식별합니다. 다음 뉴클레오티드가 추가 될 때, 형광 분자가 쪼개합니다. 14
합성 시퀀싱 (SBS) 고유 한 시퀀스 클러스터가 생성하는 표적 DNA와 같은 증폭하는 독특한 방법을 사용합니다. 15 단일 가닥의 템플릿을 생성하고 보완 가닥이 합성된다. 각각의 뉴클레오티드 형광 분자로 표시되며, 각베이스 추가 한 후 추가 된베이스의 형광 기록됩니다.
Disclosures
이 문서에 대한 생산 및 무료 액세스는 Qiagen의 후원됩니다.
저자 아메드, Durocher, Jessen 및 Vardi이 문서에 사용 된 시약 및 장비를 생산 Qiagen의 주식 회사의 직원입니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 존스 홉킨스 대학, 게이트웨이 과학 이니셔티브와 Qiagen의 주식을 통해 학장의 사무실에 의해 부분적으로 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
| CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
| Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
| High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
| Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
| PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
| PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
| PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
| PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
| PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
| PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
| PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
| PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
| Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
| Heat block | Fisher | 11-718Q |
References
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