Summary
Pyrosequencing er en allsidig teknikk som muliggjør mikrobiell sekvenserings som kan brukes til å identifisere bakteriearter, diskriminere bakteriestammer, og detektere genetiske mutasjoner som gir resistens til anti-mikrobielle midler. I denne video, vil prosedyren for mikrobiell generering amplikon, amplikon pyrosequencing, og DNA-sekvens-analyse påvises.
Abstract
Pyrosequencing er en allsidig teknikk som muliggjør mikrobiell sekvenserings som kan brukes til å identifisere bakteriearter, diskriminere bakteriestammer og detektere genetiske mutasjoner som gir resistens til anti-mikrobielle midler. Fordelene med pyrosequencing for mikrobiologi bruksområder er rask og pålitelig high-throughput screening og nøyaktig identifisering av mikrober og mikrobielle genom mutasjoner. Pyrosequencing innebærer sekvensering av DNA ved å syntetisere den komplementære tråden en enkelt base i en tid, mens bestemme den spesifikke nukleotid blir innlemmet under syntesereaksjonen. Reaksjonen skjer på immobilisert enkelttrådet mal DNA, hvor de fire deoksyribonukleotider (dNTP) tilsettes sekvensielt, og de Kommunefritt dNTP'er er enzymatisk nedbrutt før tilsetning av den neste dNTP til syntesereaksjonen. Påvisning av den spesifikke basen innlemmet i malen blir overvåket ved generering av chemiluminescent signaler. Rekkefølgen av dNTPs som produserer kjemiluminescerende signaler bestemmer den DNA-sekvensen av malen. Den sanntids evne sekvensering av pyrosequencing teknologi muliggjør hurtig mikrobiell identifisering i en enkelt analyse. I tillegg er det pyrosequencing instrument, kan analysere den fullstendige genetiske mangfold antimikrobielt medikament-resistens, inkludert typing av SNP'er, punkt-mutasjoner, innsettinger og delesjoner, samt kvantifisering av multiple genkopier som kan oppstå i noen anti-mikrobiell resistens mønstre.
Introduction
Pyrosequencing er en rask og nøyaktig metode for sekvensielle nukleinsyrer som er basert på prinsippet om "sekvensering ved syntese". "Sekvensering ved syntese" involverer bruk av en enkelt streng DNA-templat for å syntetisere den komplementære tråden på en basestasjon om gangen, og å detektere den innlemmet base (A, T, G eller C) på hvert trinn etter detektering av et kjemiluminescerende signal. Den pyrosequencing reaksjon inkluderer mal DNA, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferin, luciferase, og apyrase. Syntesegassen Reaksjonen blir startet ved tilsetning av en av de fire dNTP'er og DNA-polymerase til den enkelkjedete biotinylert mal DNA. DNA-polymerase inneholder den komplementære dNTP på malen, med påfølgende frigjøring av pyrofosfat (figur 1). ATP sulfurylase konverterer forholdsmessig pyrofosfatet til ATP. ATP virker som en katalysator for luciferase-mediert omdannelse av luciferin til oxyluciferin, hvilkengenererer lys (figur 2). Intensiteten av lys som er proporsjonal med antallet av nukleotider innlemmes og bestemmer om en eller flere spesifikk dNTP 's (dATP, dTTP, dGTP, dCTP eller) er til stede på malen tråd sekvensielt (figur 3). Enhver ikke-inkorporerte dNTP er degradert av apyrase før tilsetning av den neste dNTP for videreføring av syntesereaksjonen. Denne "sekvensering ved syntese" reaksjon gjentas med tilsetning av hver av de fire dNTP'er til DNA-sekvensen av den enkelt-trådet DNA-templat bestemmes.
Hvis du vil se en animasjon av pyrosequencing reaksjon Klikk her for å se film .
Protocol
Innledning: Et enkelt bakteriekoloni bør anvendes for å inokulere et passende kulturkraften som er inkubert over natten. En bakteriell pellet blir så behandlet for å rense genomisk DNA ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig kit genomisk isolasjon. Den rensede genomisk DNA bør ha en 260/280 (nm) forhold> 1,8 for å sikre at prøven er fri for protein forurensning. Mengden av genomisk DNA som kreves for generering av den pyrosequencing malen er 10-20 ng.
A. Amplifikasjon av det Symbolmal
(PyroMark PCR Handbook; www.qiagen.com / håndbøker 1)
Sette opp PCR-reaksjon
Merk: En primer skal biotinylert på sitt 5 'enden, og det er anbefalt at det skal være HPLC renset for mal forberedelse. Vi anbefaler PyroMark analysen Design Software 2.0 for PCR og sekvens primer design som er optimalisert for kort-read sekvensering, men Primer-BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome ) fra NCBI kan også benyttes til primer utforming.
- Tine alle nødvendige løsninger (listet opp i tabell 1) og bland hvert grundig. Sett opp reaksjonen i henhold til tabell 1. Alt arbeid kan gjøres ved romtemperatur.
Merk: PCR Master Mix inneholder MgCl 2 for en endelig konsentrasjon på 1,5 mM, som gir tilfredsstillende resultater i de fleste tilfeller. Dersom et høyere Mg 2 + konsentrasjon er nødvendig, kan opp til 3,5 mL av 25 mM MgCl2 tilsettes til en reaksjon.
- Bland reaksjonen blanding av forsiktig pipettering opp og ned, deretter dispensere riktige volumer i PCR-rør.
- Legg template DNA til hver PCR-rør. Vi anbefaler 10 ng av genomisk DNA.
- Programmere termosykleren i henhold til tabell 2. En endelige holdetemperatur ved 4 ° C er anbefalt for enkelhets skyld. Hvis du bruker en termisk cycler uten et oppvarmet lokk, overlay reaksjoner med 100 pl mineralolje.
- Plasser PCR-rør i cycler og starte syklusen program.
B. Vacuum Workstation Protocol
Immobilisering av de Biotinylated PCR-produkter
- Gjør en master mix henhold til Figur 4.
Merk: Før pipettering, rist flasken med streptavidin-belagte Sepharose perler for å sikre en homogen suspensjon.
- Avhengig av volumet av PCR-produktet som brukes, giver 60-75 pl konsentrat-blanding inn i hver brønn i en PCR-plate for å gi et totalt volum på 80 mL per brønn.
- Legg 5-20 ul biotinylert PCR-produkt til hver brønn.
- Tett brønner med stripe caps og rist for PCR-platen ved 1400 rpm i 5-10 minutter ved romtemperatur (15-25 ° C) ved hjelp av en orbital shaker.
Denaturering av DNA og tilsetning av sekvensering primer
- Fortynn sekvensering primere til 0,3 mM med buffer annealing og dispenser 25 ul i hver brønn av en reaksjonsplate. Plasser platen på arbeidsstasjonen.
- Fyll arbeidsstasjon rennene i henhold til Figur 5 diagrammet.
- Slå på vakuumpumpen, og sørg for at bryteren på vakuum verktøyet er satt til på (figur 6). Skyll filteret sonder med høy renhet vann (Milli-Q 18,2 MW x cm eller tilsvarende) i trough 5 (figur 5). Fyll opp trau med frisk høyrent vann for bruk i trinn 12.
- Arbeider raskt, plassere PCR plate med perler på arbeidsstasjonen. Sørg for at begge platene er i samme retning som når prøvene ble lastet.
- Med vakuumbryteren PÅ, senke vakuumverktøy inn i brønnene til PCR-platen i 20 sekunder eller inntil alt volum er aspirert. Perlene vil bli fanget av den vakuum-verktøyet (figur 7).
- Med vakuum fremdeles er på, spyle-verktøyet med 70% etanol (trau 1) i 20 sekunder eller inntil alt volum er aspirert.
- Med vakuum ON, skylle verktøyet med denaturering løsning (trough 2) i 20 sekunder, eller til alt volumet er aspirert.
Merk: Denaturering Solution inneholder natriumhydroksid, som er et øye og hudirriterende. Alltid bære en frakk, hansker og vernebriller.
- Med vakuum ON, skylle verktøyet med vaskebufferen (trough 3) i 20 sekunder, eller til alt volumet er aspirert.
- Med vakuum PÅ, heve vakuum verktøy til ut over 90 ° vertikalt i 5 sekunder, for å tillate all væsken renne ut av vakuum-verktøyet. Slå pumpen AV, og juster vakuum verktøy med reaksjonen plate. Senk vakuum verktøyet inn ibrønn, og rist fra side til side for å frigjøre kulene i brønnene inneholdende sekvensering primer.
- For å rengjøre vakuum verktøyet, agitere filteret sonder i høy renhet vann (trau 4) i 10 sek.
- Slå vakuum ON og skyll verktøy med høy renhet vann (trough 5) i 20 sekunder, eller til alt volumet er aspirert.
- Ta utstyret verktøy for å utover 90 ° C vertikalt i 5 sek, deretter bytte vakuum OFF og lagre i "Parking" posisjon.
Annealing sekvensering primer til DNA-trådene
- Plasser reaksjon plate i en forvarmet plate holder.
- Varm opp platen på en varmeblokk ved 80 ° C i 2 min.
- Fjern platen fra holderen og sted på disken for å avkjøles ved romtemperatur i 5 min.
Pyromark Q24 Operation
Merk: Slå på instrumentet med strømbryteren plassert over strømledningen. Stjernerstup kan ta opptil 1 min.
- Fyll en patron i henhold til instruksjonene i PyroMark Gold Q24 reagenser Håndbok 2. Å fastslå volumer som trengs, sette opp en kjøre fil i instrumentets programvare, og under Verktøy-menyen velger du Pre Run Informasjon
- Hvis instrumentet var allerede på, sørge for at det ikke utfører en kjøre og deretter åpne lokket. Et lydsignal høres hvis lokket åpnes når det er utrygt å gjøre det.
- Åpne kassetten gate og sett kassetten med etiketten vendt fremover (Figur 8). Kontroller at kassetten er satt inn riktig (en linje skal være synlig på forsiden) og lukke porten.
- Åpne plate-holding ramme og plassere plate med prøver inne i instrumentet.
- Lukke plate-holder rammen og instrumentets lokk (figur 9).
Starte en kjøring
- Sett inn USB-pinne med seriefilens opprettet med instrumentets programvare til USB-porten på forsiden av instrumentet.
- Velg "Run" i hovedmenyen og trykk "OK".
- Bruk pilene for å velge ønsket seriefilen og trykk "Velg".
Merk: Instrumentet vil begynne dispensere reagenser når alt forhåndsinnstilt trykk og temperatur nivåer er nådd (dette kan ta flere minutter). Under et løp, viser instrumentet skjermen pyrogram av den valgte godt i sanntid. Bruk pilene for å vise pyrogram av andre brønner.
Fullfører en løpetur
- Når instrumentet bekrefter at kjøringen er ferdig og kjøre filen er lagret på USB-stick, trykker du på "Close".
- Fjern USB-stick. Hvis det ble fjernet før oppløpet ferdig, setter du inn USB-pinne. Velg "Administrasjon" og deretter "Kopier Ufrelste Runs".
- Den kjøre filen kan nå åpnes og analysert ved hjelp av instrument programvare og sammenlignettil et bibliotek av kjente mikrober ved hjelp av Identifire programvare.
Representative Results
Resultatene av en typisk pyrosequencing løp ved hjelp av programvaren viser plasseringen av frem-og bakover-primere som brukes for generering amplikon, og sekvensering primer anvendes for pyrosequencing reaksjon i den konserverte 16S ribosomalt sekvens (figur 10). Den hypervariable sekvens mellom tennsatsen områder tillater bakteriell identifikasjon av et stort antall bakterielle arter ved hjelp av den konserverte sekvensering primeren (5'-TACATGCAAGTCGA). som en intern kontroll kvalitet, DNA-sekvensen som innbefattet den variable regionen kan bli kontrollert for å sikre at den korrekte DNA-region har blitt analysert . Den pyrosequencing programvare gjør det mulig for sammenligning og justeringen av den genererte sekvensen til en intern database av bakterielle ribosomale sekvenser for bakteriell identifikasjon. I tillegg kan en sekvens bli analysert for å bestemme mutasjoner som antibiotisk resistens. For eksempel, analyse av mutasjoner i det 23S ribosomale gener av HelicobActer pylori demonstrerer to mutasjon mønstre (GAA eller AGA) der det gis antibiotikaresistens (Figur 11). Analyse av flere isolater fra samme pasient kan samtidig analyseres for å spore fremveksten av resistens over tid for å hjelpe til epidemiologiske undersøkelser av mikrobiell narkotika motstand utbrudd.
Figur 1. Biotinylerte PCR-produktet brukes som en mal for å innlemme dNTP'er ved DNA-polymerase, som fører til genereringen av pyrofosfat (PPi).
Figur 2. ATP sulfurylase omdanner forholdsmessig pyrofosfat til ATP. ATP fungerer som en katalysator for luciferase-mediert omdannelse av luciferin til oxyluciferin, som genererer lys som er prosjonal til mengden av ATP. Lyset er registrert som toppen på pyrogram spor og indikerer nukleotid innlemmelse. De Kommunefritt dNTPs er degradert av apyrase før neste dNTP er lagt for videreføring av syntesen.
Figur 3. Intensiteten av lyset som genereres indikerer om en eller flere spesifikk dNTP 's (dATP, dTTP, dGTP, dCTP eller) ble inkorporeres malen tråd sekvensielt.
Figur 4. Flytskjema for utarbeidelse av master-mix å bremse den biotinylated PCR produktet.
ge = "always"> Figur 5. PyroMark arbeidsstasjon, med PCR plate, PyroMark plate, og trough steder.
Figur 6. Steder av vakuum Slå på og av posisjoner.
Figur 7. Vakuum verktøyet. Riktig håndtering av vakuum verktøyet.
Figur 8. Cartridge gate åpnet med kassetten på plass.
Figur 9. Cartridge ordentlig med gate stengt.
Figur 10. Pyrosequencing baserte bakterielle identifikasjonsresultater. PCR-primere som er utformet for konserverte regioner av DNA-templat, og den sekvensering primer er plassert umiddelbart oppstrøms for et godt karakterisert identifisere hypervariable DNA-sekvens innenfor amplikonet (vist i blått).
Figur 11. Påvisning av antibiotika resistens i Helicobacter pylori ved hjelp pyrosequencing. Analyse av mutasjoner i 23S gener som gir antibakteriell resistens i Helicobacter pylori inneholder GAA eller AGA sekvenser. Klikk her for å se større figur .
| Volum per reaksjon | Endelig konsentrasjon | |
| Pyro PCR Master Mix, 2x | 12.5 ul | 1x |
| CoralLoad Concentrate, 10x | 2,5 pl | 1x |
| 25 mM MgCl2 (valgfritt) | Variabel | ≥ 1,5 mM |
| Q-Solution, 5x (valgfritt) | 5 ul | 1x |
| Primer A / Primer B | Variabel / Variabel | 0,2 μM/0.2 jM |
| RNase-fritt vann | Variabel | - |
| Total Volume (etter å ha lagt mal DNA) | 25 ul |
Tabell 1. PCR-reaksjonsblandingen.
| & Nbsp; | Ytterligere kommentarer | ||
| Initial PCR aktivering trinn | 15 min | 95 ° C | HotStartTaq DNA Polymerase er aktivert |
| 3 trinn sykling: Denaturering | 30 sek | 94 ° C | |
| Gløding | 30 sek | 60 ° C 56 ° C | For genomisk DNA For bisulfite konvertert DNA |
| Extension | 30 sek | 72 ° C | |
| Antall sykluser | 45 | ||
| Endelige forlengelse | 10 min | 72 ° C |
Tabell 2. PCR Cycle Spesifikasjoner.
Discussion
Flere nye neste generasjons sekvensering metoder har blitt kommersialisert. Tre av de mest brukte metodene er ion halvleder sekvensering, enkelt molekyl sanntid sekvensering, og sekvensering av syntese (SBS). 3-11 Hver av disse metodene avhenger sekvensering ved syntese, men ansette nye plattformer for påvisning av de inkorporerte nukleotider. I ion halvleder sekvensering, serverer en enkelt strand av DNA som en mal for sekvensering strand. 12. Polymerase og nukleotider legges sekvensielt som i pyrosequencing. Når en nukleotid tilsettes til den voksende DNA-kjede, er en hydrogenion frigjøres. Den hydrogen-ion blir detektert av en felteffekttransistor baserte sensor.
Enkelt molekyl sanntid sekvensering avhenger null modus bølgeleder (ZMW). 13. Den ZMW er en liten struktur hvor et enkelt molekyl polymerase er festet til bunnen av brønnen. Det er belyst på en slik måte at en floreduft-molekylet kan bli detektert. Hver nukleotid er merket med et fluorescerende molekyl. Som en fluorescently merket nukleotid er innarbeidet, identifiserer en detektor nucleotide. Når neste nukleotid er lagt til, er den fluorescerende molekyl spaltes. 14.
Sekvensering ved syntese (SBS) anvender en unik metode for å forsterke den mål-DNA slik at klynger av unike sekvenser genereres. 15. enkeltstrengede maler er generert og deretter den komplementære tråden blir syntetisert. Hvert nukleotid er merket med et fluorescerende molekyl, og etter hver basetilsetning fluorescensen av den tilsatte basen tas opp.
Disclosures
Produksjon og Fri tilgang til denne artikkelen er sponset av Qiagen.
Forfattere Ahmed, Durocher, Jessen og Vardi er ansatte i Qiagen Inc. som produserer reagenser og instrumenter som brukes i denne artikkelen.
Acknowledgments
Dette prosjektet var støtte i en del av Johns Hopkins University, kontor Provost gjennom Gateway Science Initiative og Qiagen Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
| CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
| Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
| High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
| Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
| PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
| PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
| PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
| PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
| PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
| PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
| PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
| PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
| Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
| Heat block | Fisher | 11-718Q |
References
- PyroMark PCR Handbook. , [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2009).
- PyroMark Q24 User Manual. , [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2012).
- Elahi, E., Ronaghi, M. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).
- Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).
- Langaee, T., Ronaghi, M. Genetic variation analyses by pyrosequencing. Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).
- Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).
- Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes. J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).
- J, Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data. Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).
- Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).
- King, C., Scott-Horton, T. Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping. J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).
- Rothberg, J. W., Heinz,, et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., Fehr, A. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Sequencing Technology | Sequencing by Synthesis | Illumina [Internet]. , Illumina. Available from: http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn (2012).
