Rapid High Throughput Amylose Bestemmelse i frysetørret kartoffelknolden Prøver

Summary

Denne protokol beskriver en højt gennemløb kolorimetrisk metode, der er baseret på dannelsen af ​​et kompleks mellem iod og kæder af glucosemolekyler i stivelse. Jod danner komplekser med både amylose og lange kæder indenfor amylopektin. Efter tilsætning af jod til en stivelse prøve forekommer den maksimale absorption af amylose og amylopectin ved 620 og 550 nm. Den amylose / amylopektin-forholdet kan estimeres ud fra forholdet mellem de 620 og 550 nm absorbansværdier og sammenligne dem med en standardkurve i hvilke specifikke kendte koncentrationer afbildes mod absorptionsværdier. Dette høje gennemløb og billig metode er pålidelig og reproducerbar, tillader evaluering af store populationer af kartoffel kloner.

Abstract

Denne protokol beskriver en højt gennemløb kolorimetrisk metode, der er baseret på dannelsen af ​​et kompleks mellem iod og kæder af glucosemolekyler i stivelse. Jod danner komplekser med både amylose og lange kæder indenfor amylopektin. Efter tilsætning af jod til en stivelse prøve forekommer den maksimale absorption af amylose og amylopectin ved 620 og 550 nm. Den amylose / amylopektin-forholdet kan estimeres ud fra forholdet mellem de 620 og 550 nm absorbansværdier og sammenligne dem med en standardkurve i hvilke specifikke kendte koncentrationer afbildes mod absorptionsværdier. Dette høje gennemløb og billig metode er pålidelig og reproducerbar, tillader evaluering af store populationer af kartoffel kloner.

Introduction

Ca. 80% af den friske vægt af en kartoffelknold er vand, og næsten al den tilbageværende tørstof er stivelse ^1. De fleste af stivelse (70%) består af amylopectin, mens resten er amylose. Forholdet mellem amylose og amylopectin er den vigtigste egenskab at påvirke de fysiske egenskaber af stivelse. Amylose er en lineær alfa 1-4 glucose kæde, mens amylopectin er en lineær alfa 1-4 kæde med alpha 1-6 grene ^2. Fremgangsmåder, såsom iod binding, differentiel scanningskalorimetri (DSC), højtydende gelpermeationskromatografi (HPSEC) og concanavalin A-interaktioner er blevet udviklet for stivelse bestemmelse i forskellige afgrødearter ^3,4. Hver protokol kræver særlige færdigheder og udstyr, hvilket gør det svært at skalere op at kvantificere mange prøver ad gangen. Den metode, vi præsenterer her er en modificeret protokol fra Hovenkamp-Hermelink et al. ^5, som er en dobbelt bølgelængde jod bindendemetode baseret på farvede stivelsesgranuler. Fordelene ved denne fremgangsmåde i forhold til andre omfatter amylose bestemmelse af rå stivelse uden oprensning deraf og anvendelse af den dobbelte bølgelængde system til at øge præcisionen af fremgangsmåden ^4,6.

Protocol

1.. Amylose Bestemmelse fra kartoffelknolden Stivelse

1. Skræl og skær friske knolde i små tern.
2. Placer kartoffel kuber i små brune poser og opbevares natten over ved -80 ° C.
3. Overfør kartoffel terninger til nylon poser og til frysetørring.
4. Efter frysetørret, slibe kartoffel prøven i pulver ved hjælp af morter og støder eller et Wiley Mølle.
5. I et 50 ml rør, tilsættes 20-30 mg frysetørret, formalet tuber prøve.
6. Der fremstilles en opløsning af 45% (w / v) perchlorsyre (mix 24,4 ml 60% perchlorsyre og 25,6 ml ultrarent vand.
7. Tilsæt 500 pi af 45% (w / v) perchlorsyre og ryste eller slyng den at dispergere stivelseskorn.
8. Efter fire minutters inkubationsperiode ved stuetemperatur, tilsættes 16 ml ultrarent vand til opløsningen, og der vortexes.
9. Efter ikke-opløselige materiale er fast til bunden af ​​røret (7-10 min senere), overføres 40 ul af opløsningen til en mikrotiterplade (undgå afpipettering af partikler).
10. Der tilsættes 50 pi iod (2 g KI + 1 g I ₂ i 900 ml ultrarent vand) og prøven blandes ved pipettering.
11. Læs absorbansen ved 550 nm og 620 nm straks.
12. Bestem amylose procentdel efter sammenligning amylose / amylopektin-forholdet af hver prøve (620 nm/550 nm absorbans) med en standardkurve genereret fra amylose og amylopectin løsninger på en række koncentrationer. Denne procedure vil blive beskrevet. Læs blank (jodopløsning, perchlorsyre) sammen med de prøver. Brug blændede data til analyserne.

2. Amylose / amylopektin Curve

1. I separate rør vejer 12,5 mg amylose og 12,5 mg amylopektin.
2. Tilføj til hvert rør 5 ml 45% (w / v) perchlorsyre og opløses fuldstændigt.
3. For hver af opløsningerne (amylose og amylopectin), bringe til et slutvolumen på 50 ml med ultrarent vand.
4. Bland 6,25ml amylose bestand fra det foregående trin med 18,75 ml ultrarent vand. Dette vil gøre en 6,25 mg / ml amylose opløsning.
5. Gentag proceduren for amylopektin løsning.
6. Brug af amylose og amylopectin standardopløsninger fra trin 2.4 og 2.5, forberede procent amylose standarder, som er 0-100% amylose (100-0% amylopectin) til en endelig volumen på 5 ml for at skabe standardkurven i 10% intervaller.
   For eksempel til at forberede:
   0% amylose / 100% amylopektin standard, pipette 5 ml amylopektin løsning.
   10% amylose / 90% amylopectin standard, kombinere 0,5 ml amylose og 4,5 ml amylopectin løsninger.
   20% amylose / 80% amylopectin standard, kombinere 1,0 ml amylose og 4,0 ml amylopectin løsninger.
   30% amylose / 70% amylopectin standard, kombinere 1,5 ml amylose og 3,5 ml amylopectin løsninger.
   40% amylose / 60% amylopectin standard, kombinere 2,0 ml amylose og 2,0 ml amylopectin løsninger.
   De 50% amylose/ 50% amylopectin standard, kombinere 2,5 ml amylose og 2,5 ml amylopectin løsninger.
   60% amylose / 40% amylopectin standard, kombinere 3,0 ml amylose og 2,0 ml amylopectin, og så videre).
7. Transfer 40 ul af hver standard blanding til en mikrotiterplade. Omfatter en brønd med 40 pi 45% (w / v) perchlorsyre som blind.
8. Der tilsættes 50 pi iod (2 g KI + 1 g I ₂ i 900 ml ultrarent vand) og blandes hver prøve (herunder de tomme) ved pipettering.
9. Læs absorbanser ved 550 nm og 620 nm straks og beregne amylose / amylopektin-forholdet for hver koncentration.

Representative Results

Den standardkurve konstrueret fra slukkede vedrørende forskellige amylose / amylopectin koncentrations løsninger viser de omtrentlige absorbans forhold i intervallet fra 0,7 til 1,6 (tabel 1). En lineær regression tendens linje fra disse oplysninger senere bruges til at udlede amyloseindhold i frysetørrede kartoffel prøver (figur 1).

Produktionsanlægget miljø har en vis indvirkning på den amyloseindhold i kartoffelknolden ^7. Replikeret amyloseindhold bestemmelser i to separate lokale steder viste lav variation blandt kartoffelknolde (Tabel 2). Pigmenter i farvede kød kartofler synes ikke at påvirke analysen amylose beslutsomhed.

% Amylose opløsning 1	550 nm absorbansen	620 nm absorbans	Ratio 2 620 nm/550 nm
0	0,223	0.156	0.700
10	0,225	0.181	0.804
20	0,221	0,203	0,919
30	0.220	0.219	0.995
40	0,223	0.246	1.103
60	0.216	0.280	1,296
70	0.231	0.319	1.381
90	0,225	0.347	1.542
100	0.219	0.357	1.630

Tabel 1.. Forholdet mellem amylose koncentration og absorbans ratio (620 nm/550 nm). Absorbansforholdet vs procent amylose er afbildet i figur 1 </ Strong> amylose bestemmelse ^1. Procent amylose opløsning blev fremstillet af amylose og amylopectin stamopløsninger ved forskellige koncentrationer ^2. Beregnet forhold fra slukkede data absorbans ved 620 nm og 550 nm.

Kultivar	Loc	550 nm	620 nm	Ratio	Amylose%
Adirondack Blå	1	1,86	1,78	0,955	25.5
	2	2,28	2.15	0,946	24.4
Tidlig Rose	1	2.17	2.12	0.977	27.8
	2	2,22	2.14	0,967	26.7
Freedom Russet	1	1.99	1,92	0.965	26.5
	2	1,98	1,93	0,973	27,4
Inca Gold	1	1.95	2.00	1.021	32.6
	2	2,27	2,28	1,004	30,7
Ranger Russet	1	1.88	1,84	0.975	27.6
	2	2.15	2,08	0,967	26.7
Russet Norkotah	1	1,84	1,79	0,972	27.3
	2	1,90	1,86	0.975	27.6
Snowden	1	2,23	2.13	0.956	25.5
	2	1,64	1,61	0.979	28,0
White Pearl	1	2,32	2,28	0,986	28.7
	2	2,22	2.18	0,983	28.5

Tabel 2. Replikerede evaluering af amyloseindhold i kartoffelsorter fra to forskellige produktionsprocesser felt lokationer (LOC).

Figur 1.. Amylosekoncentration standardkurve bruges til at udlede amylose procent indhold i kartoffelknolde.

Discussion

Amyloseindhold i kartoffelknolde typisk fra 20-35% ^7,8. Hvis de fleste værdier er uden for dette område, overveje disse mulige fejl: 1) rå data blev anvendt i stedet for slukkede data for konstruktionen af ​​amylose / amylopektin standardkurve, 2) rå data blev anvendt i stedet for slukkede data til bestemmelse af amylose / amylopektin nøgletal fra kartoffel prøver, eller 3) det vand, der anvendes til analysen var ikke ren nok. Vi har bemærket, at ved anvendelse af destilleret vand og ikke ultra-rent vand i analysen, de opnåede værdier ikke var reproducerbare. En nem måde at kontrollere, at jod-opløsning fremstilles korrekt, eller hvis det stadig er for gammel til at blive brugt, er at kontrollere, om den rå ekstinktionværdi for blindprøve ved 550 nm er omkring 0,1.

Præcision i forberedelsen af ​​jod og amylopektin / amylose-løsninger er afgørende for at få pålidelige amylose bestemmelser. Da vi bestemme andelen af ​​amymiste indhold snarere end den nøjagtige mængde af amylose i kartoffelstivelse, der er ingen rensning skridt til isolering af ren stivelse fra kartoflen pulver som præsenteret af andre metoder beslutsomhed.

Til bestemmelse af den amyloseindhold i kartoffelsorter blev to uafhængige frysetørrede knolde fra hver sort behandlet på hver lokalitet. Vi fandt, at variationen for amyloseindhold mellem kartoffelknoldene var lille (mindre end ét procentpoint) og ikke signifikant.

Der var ingen forskel i fastlæggelsen amyloseindhold på grund af den oprindelige mængde kartoffelstivelse, mellem 20-30 mg. Uden for dette interval, resultaterne blev upålidelige eller ikke kan påvises ved vores plade læser. Selvom Hovenkamp-Hermelink et al. ^5. foreslå at tilføje et vandvolumen, hvis prøven er for koncentreret, anbefaler vi genvejning prøven og gentage proceduren.

Denne undersøgelse PreseNTS data baseret på hvide konkretiserede kartofler. Derudover har vi vurderet denne metode med farvede flesh kartofler (gul, rød og lilla). Ingen interferens med jod / amylose kompleks blev opdaget. Men som med enhver jod bindende assay, er andelen af ​​amylose vil sandsynligvis være overvurderet noget på grund af den binding af jod til lige kæder i amylopektin molekyler. Denne analyse er beregnet til screening af store antal prøver. Når høje amylose personer identificeres, anbefaler vi re-test med et amylose-specifik analyse, såsom concanavalin A ^9,10. Denne analyse er dyrere og arbejdskrævende end jod bindingsanalysen, men det mere præcist bestemmer amylose niveauer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Amylose	Sigma	859656
Amylopectin	Sigma	A8515
Perchloric Acid 60%	Sigma	311413	Very hazardous to skin and eyes
Iodine	Sigma	23214TD
Potassium iodide	Sigma	08625JE
Equipment
Plate Reader	Bio Tek	ELx800