Summary
פרוטוקול זה מתאר גבוה באמצעות שיטת colorimetric לשים המסתמכת על היווצרות מורכבת בין יוד ושרשרות של מולקולות גלוקוז בעמילן. יוד יוצרת קומפלקסים עם שני amylose ושרשרות ארוכות בתוך amylopectin. לאחר התוספת של יוד לדגימת עמילן, הספיגה מקסימלית של amylose וamylopectin מתרחשת ב620 ו550 ננומטר, בהתאמה. יחס amylose / amylopectin ניתן להעריך מהיחס של ערכי ספיגת ננומטר 620 ו550 ומשווה אותם לעקומת סטנדרט שבו ריכוזים ספציפיים ידוע הם זממו נגד ערכי קליטה. תפוקה גבוהה, שיטה זולה היא אמינה לשחזור, ומאפשרת ההערכה של אוכלוסיות גדולות של שיבוטים תפוחי אדמה.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר גבוה באמצעות שיטת colorimetric לשים המסתמכת על היווצרות מורכבת בין יוד ושרשרות של מולקולות גלוקוז בעמילן. יוד יוצרת קומפלקסים עם שני amylose ושרשרות ארוכות בתוך amylopectin. לאחר התוספת של יוד לדגימת עמילן, הספיגה מקסימלית של amylose וamylopectin מתרחשת ב620 ו550 ננומטר, בהתאמה. יחס amylose / amylopectin ניתן להעריך מהיחס של ערכי ספיגת ננומטר 620 ו550 ומשווה אותם לעקומת סטנדרט שבו ריכוזים ספציפיים ידוע הם זממו נגד ערכי קליטה. תפוקה גבוהה, שיטה זולה היא אמינה לשחזור, ומאפשרת ההערכה של אוכלוסיות גדולות של שיבוטים תפוחי אדמה.
Introduction
כ 80% מהמשקל הטרי של פקעת תפוח אדמה הוא מים; כמעט את כל החומר היבש שנותר הוא עמילן 1. רוב העמילן (70%) מורכב מamylopectin, והשאר הוא amylose. היחס בין amylose וamylopectin הוא הנכס החשוב ביותר המשפיע על התכונות הפיסיקליות של עמילן. Amylose הוא שרשרת גלוקוז ליניארי אלפא 1-4, בעוד amylopectin היא שרשרת אלפא 1-4 ליניארי עם אלפא 1-6 ענפים 2. שיטות כגון יוד מחייבות, פער הסריקה calorimetry (DSC), כרומטוגרפיה גודל ביצועים גבוהים הדרה (HPSEC) ואינטראקציות concanavalin פותחו עבור נחישות עמילן במינים יבול שונים 3,4. כל פרוטוקול דורש מיומנויות וציוד מיוחדים, מה שהופך את זה קשה בהיקף של עד לכמת דוגמאות רבות בכל פעם. השיטה שאנו מציגים כאן היא פרוטוקול שונה מHovenkamp-Hermelink et al. 5 שהוא יוד אורך גל כפולה מחייבתשיטה מבוססת על גרגרי עמילן מוכתמים. היתרונות של שיטה זו לעומת אחרים כוללים קביעת amylose מעמילן גלם ללא מטהר אותו ואת השימוש במערכת אורך הגל הכפולה כדי להגדיל את הדיוק של 4,6 השיטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. קביעת amylose מעמילן פקעת תפוח האדמה
- מקלפים וחותכים פקעות טריות לקוביות קטנות.
- מניחים קוביות תפוחי אדמה בשקיות חומות קטנות ולאחסן לילה בשעה -80 ° C.
- העבר את קוביות תפוחי אדמה לשקיות ניילון ולייבוש בהקפאה.
- לאחר ההקפאה יבשה, לטחון את מדגם תפוחי האדמה לאבקה באמצעות מכתש ועלי או מיל ויילי.
- בצינור 50 מיליליטר, להוסיף 20-30 מ"ג, מדגם פקעת קרקע המיובש בהקפאה.
- הכן פתרון של 45% (w / v) חומצת perchloric (לערבב 24.4 מיליליטר של 60% חומצת perchloric ו25.6 מיליליטר של מים טהורים.
- הוסף 500 μl של 45% (w / v) חומצת perchloric ולנער או לערבל אותו כדי לפזר גרגרי עמילן.
- לאחר תקופת דגירה של ארבע דקות בטמפרטורת חדר, להוסיף 16 מיליליטר של מים טהורים לפתרון ומערבבים על ידי vortexing.
- אחרי חומר שאינו מסיס יש התיישב לחלק התחתון של הצינור (7-10 דקות מאוחר יותר), להעביר 40 μl של הפתרון לצלחת microtiter (הימנעות pipetting של כל חלקיקים).
- הוסף 50 μl של תמיסת יוד (ז 2 גרם KI + 1 2 ב900 מיליליטר של מים טהורים) ומערבבים את המדגם על ידי pipetting.
- קראו את הספיגה ב 550 ננומטר ו620 מייד ננומטר.
- לקבוע את אחוז amylose לאחר שהשווה את יחס amylose / amylopectin של כל דגימה (620 ספיגת nm/550 ננומטר) עם עקומת סטנדרט שנוצרה מפתרונות amylose וamylopectin בטווח של ריכוזים. הליך זה יתואר הבא. קראו (תמיסת יוד וחומצת perchloric) ריקות יחד עם דגימות הבדיקה. שימוש נמחק הנתונים לניתוחים.
2. Curve amylose / amylopectin
- בצינורות נפרדים שוקלים 12.5 מ"ג amylose ו12.5 מ"ג amylopectin.
- הוסף לכל 5 מיליליטר שפופרת של 45% (w / v) חומצת perchloric ומתמוסס לחלוטין.
- עבור כל אחד מהפתרונות (amylose וamylopectin), מביא לנפח סופי של 50 מיליליטר עם מים טהורים.
- מערבבים 6.25מיליליטר של מניית amylose מהשלב הקודם עם 18.75 מים טהורים מיליליטר. זה יהפוך את פתרון amylose 6.25 מ"ג / מיליליטר.
- חזור על התהליך עבור פתרון amylopectin.
- שימוש amylose ופתרונות סטנדרטיים amylopectin מצעדים 2.4 ו2.5, להכין את הסטנדרטים amylose אחוזים שהם amylose 0-100% (amylopectin 100-0%) לנפח סופי של 5 מיליליטר כדי ליצור עקומת הסטנדרט במרווחי 10%.
לדוגמה, כדי להכין:
0% amylose / 100% סטנדרטיים amylopectin, פיפטה 5 פתרון amylopectin מיליליטר.
10% amylose / 90% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 0.5 amylose מיליליטר ו4.5 מיליליטר פתרונות amylopectin.
20% amylose / 80% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 1.0 amylose מיליליטר ו4.0 מיליליטר פתרונות amylopectin.
30% amylose / 70% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 1.5 amylose מיליליטר ו3.5 מיליליטר פתרונות amylopectin.
40% amylose / 60% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 2.0 amylose מיליליטר ו2.0 מיליליטר פתרונות amylopectin.
Amylose 50%/ 50% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 2.5 amylose מיליליטר ו2.5 מיליליטר פתרונות amylopectin.
60% amylose / 40% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 3.0 amylose מיליליטר ו2.0 מיליליטר amylopectin, וכן הלאה). - העבר 40 μl של כל תערובת סטנדרטית לצלחת microtiter. כולל גם עם 40 μl 45% (w / v) חומצה perchloric כריקה.
- הוסף 50 μl של תמיסת יוד (ז 2 גרם KI + 1 2 ב900 מיליליטר של מים טהורים) ומערבבים כל מדגם (כולל את החסר) על ידי pipetting.
- קראו absorbances ב 550 ננומטר ו620 מייד ננומטר ולחשב את יחס amylose / amylopectin עבור כל ריכוז.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עקומת הסטנדרט שנבנתה מנתונים נמחקו מפתרוני ריכוז amylose / amylopectin שונים מציגה יחס הספיגה משוער נע .7-1.6 (טבלה 1). קו המגמה של רגרסיה ליניארית מנתונים אלה שימש מאוחר יותר כדי להסיק מסקנת תוכן amylose בדגימות תפוחי אדמה הקפאה יבשה (איור 1).
יש סביבת ייצור צמח השפעה כלשהי על תוכן amylose בפקעת תפוח האדמה 7. קביעות תוכן amylose משוכפלים בשני מיקומי שדה נפרדים הראו וריאציה נמוכה בקרב פקעות תפוחי אדמה (טבלה 2). לא נראים פיגמנטים בתפוחי אדמה בשר בצבע כדי להשפיע על assay נחישות amylose.
| % פתרון amylose 1 | 550 ספיגת ננומטר | 620 ספיגת ננומטר | יחס 2 620 ננומטר nm/550 |
| 0 | 0.223 | 0.156 | 0.700 |
| 10 | 0.225 | 0.181 | 0.804 |
| 20 | 0.221 | 0.203 | .919 |
| 30 | 0.220 | 0.219 | 0.995 |
| 40 | 0.223 | 0.246 | 1.103 |
| 60 | 0.216 | 0.280 | 1.296 |
| 70 | 0.231 | 0.319 | 1.381 |
| 90 | 0.225 | 0.347 | 1.542 |
| 100 | 0.219 | 0.357 | 1.630 |
טבלת 1. קשר בין ריכוז amylose ויחס הספיגה (620 nm/550 ננומטר). יחס ספיגת לעומת amylose אחוזים זממו באיור 1 </ Strong> לקביעת amylose 1. פתרון amylose אחוז היה עשוי amylose ופתרונות מניות amylopectin בריכוזים שונים 2. יחס מחושב מהנתונים נמחקו absorbances ב620 ננומטר ו550 ננומטר.
| זן | Loc | 550 ננומטר | 620 ננומטר | יחס | % Amylose |
| Adirondack הכחול | 1 | 1.86 | 1.78 | 0.955 | 25.5 |
| 2 | 2.28 | 2.15 | 0.946 | 24.4 | |
| רוז המוקדם | 1 | 2.17 | 2.12 | 0.977 | 27.8 |
| 2 | 2.22 | 2.14 | 0.967 | 26.7 | |
| Freאדום אדמדם | 1 | 1.99 | 1.92 | 0.965 | 26.5 |
| 2 | 1.98 | 1.93 | 0.973 | 27.4 | |
| האינקה זהב | 1 | 1.95 | 2.00 | 1.021 | 32.6 |
| 2 | 2.27 | 2.28 | 1.004 | 30.7 | |
| ריינג'ר אדמדם | 1 | 1.88 | 1.84 | 0.975 | 27.6 |
| 2 | 2.15 | 2.08 | 0.967 | 26.7 | |
| Norkotah האדמדם | 1 | 1.84 | 1.79 | .972 | 27.3 |
| 2 | 1.90 | 1.86 | 0.975 | 27.6 | |
| סנודן | 1 | 2.23 | 2.13 | .956 | 25.5 |
| 2 | 1.64 | 1.61 | 0.979 | 28.0 | |
| לבנה פנינה | 1 | 2.32 | 2.28 | 0.986 | 28.7 |
| 2 | 2.22 | 2.18 | .983 | 28.5 |
טבלה 2. הערכה משוכפלת של תוכן amylose בזני תפוחי אדמה משני מיקומים שונים שדה ייצור (לוק).
איור 1. עקומת סטנדרט ריכוז amylose משמשת להסיק תוכן אחוזים amylose בפקעות תפוח אדמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תוכן amylose בפקעות תפוח אדמה בדרך כלל נע בין 20-35% 7,8. אם רוב הערכים הם מחוץ לטווח זה, שקול שגיאות אפשריות הבאות: 1) נתונים גולמיים שימשו במקום נתונים נמחקו לבניית עקומת סטנדרט amylose / amylopectin; 2) נתונים גולמיים שימשו במקום נתונים נמחקו לקביעת amylose / יחסי amylopectin מדגימות תפוחי האדמה, או 3) המים המשמשים לניתוח לא היו טהורים מספיק. שמנו לב שעל ידי שימוש במים מזוקקים ומים לא אולטרה טהורים בניתוח, הערכים שהתקבלו לא היו לשחזור. דרך קלה כדי לוודא שתמיסת יוד מוכנה כראוי או אם הוא עדיין ישן מדי כדי לשמש היא לבדוק אם הערך ספיגת הגלם של המדגם הריק ב550 ננומטר הוא סביב 0.1.
דיוק בהכנה של יוד ופתרוני amylopectin / amylose הוא חיוני כדי לקבל קביעות amylose אמינות. מכיוון שאנו נמצאים בקביעת חלקם של איימילאבד את התוכן ולא את הסכום המדויק של amylose בעמילן תפוח אדמה, אין צעד טיהור לבידוד של עמילן טהור מאבקת תפוחי האדמה כפי שהוצג על ידי שיטות קביעה אחרות.
לקביעת תוכן amylose בזני תפוחי אדמה, שתי פקעות הקפאה עצמאיות מיובשות מזן עובדו בכל יישוב. מצאנו כי הווריאציה לתוכן amylose בין הפקעות תפוחי אדמה הייתה קטנה (נקודת אחוז פחות מאחוז אחד) ולא משמעותית.
לא היה הבדל בקביעת תוכן amylose בשל הכמות הראשונית של עמילן תפוח אדמה, בין 20-30 מ"ג. מחוץ לטווח זה, התוצאות היו לא אמינות או בלתי ניתנות לגילוי על ידי קורא הצלחת שלנו. למרות Hovenkamp-Hermelink et al. 5 מציעים הוספת נפח מים אם המדגם מרוכז מדי, אנו ממליצים reweighing המדגם ולחזור על ההליך.
prese מחקר זהNTS הנתונים מבוססים על תפוחי אדמה בשר לבנים. בנוסף, יש לנו הערכה בשיטה זו עם תפוחי אדמה בצבע עור (צהובה, אדומים וסגולים). אין הפרעה למורכבת יוד / amylose זוהתה. עם זאת, כמו בכל assay מחייב יוד, חלקם של amylose עשוי להפריז במידה מה בשל מחייב של יוד לרשתות ישר במולקולות amylopectin. assay זה מיועד להקרנת מספר גדול של דגימות. ברגע שאנשים amylose גבוהים מזוהים, אנו ממליצים מחדש בדיקות עם assay amylose ספציפי, כגון concanavalin 9,10. assay זה הוא יקר יותר ועבודה אינטנסיבית מ assay מחייב יוד, אבל זה דווקא יותר קובע רמות amylose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
מימון למחקר זה מסופק בחלקו על ידי תכנית עמיתים מחקר USDA-ARS והוועדה germplasm היבול של משרד החקלאות האמריקנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Amylose | Sigma | 859656 | |
| Amylopectin | Sigma | A8515 | |
| Perchloric Acid 60% | Sigma | 311413 | Very hazardous to skin and eyes |
| Iodine | Sigma | 23214TD | |
| Potassium iodide | Sigma | 08625JE | |
| Equipment | |||
| Plate Reader | Bio Tek | ELx800 | |
References
- Composition Hoover, R. molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review. Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).
- Bertoft, E., Blennow, A. Structure of Potato Starch. Advances in Potato Chemistry and Technology. , 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).
- Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds. Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).
- Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique. Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).
- Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato. Potato Res. 31, 241-246 (1988).
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. Starch. , 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).
- Haase, N. U., Plate, J. Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors. Stärke. 48 (5), 167-171 (1996).
- Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules. Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).
- Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A. J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).
- Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A. Starch. 42, 302-305 (1990).
