Rapid High Throughput amilosio Determinazione in liofilizzati campioni dei tuberi

Summary

Questo protocollo descrive un alto attraverso mettere metodo colorimetrico che si basa sulla formazione di un complesso tra iodio e catene di molecole di glucosio in amido. Iodio forma complessi sia con amilosio e amilopectina all'interno di lunghe catene. Dopo l'aggiunta di iodio ad un campione di amido, il massimo assorbimento di amilosio e amilopectina avviene a 620 e 550 nm, rispettivamente. Il rapporto amilosio / amilopectina può essere stimato dal rapporto tra i valori di assorbanza 620 e 550 nm e confrontandoli con una curva standard in cui specifici noto concentrazioni sono tracciati rispetto ai valori di assorbimento. Questo alto rendimento, metodo economico è affidabile e riproducibile, permettendo la valutazione di grandi popolazioni di cloni di patata.

Abstract

Questo protocollo descrive un alto attraverso mettere metodo colorimetrico che si basa sulla formazione di un complesso tra iodio e catene di molecole di glucosio in amido. Iodio forma complessi sia con amilosio e amilopectina all'interno di lunghe catene. Dopo l'aggiunta di iodio ad un campione di amido, il massimo assorbimento di amilosio e amilopectina avviene a 620 e 550 nm, rispettivamente. Il rapporto amilosio / amilopectina può essere stimato dal rapporto tra i valori di assorbanza 620 e 550 nm e confrontandoli con una curva standard in cui specifici noto concentrazioni sono tracciati rispetto ai valori di assorbimento. Questo alto rendimento, metodo economico è affidabile e riproducibile, permettendo la valutazione di grandi popolazioni di cloni di patata.

Introduction

Circa il 80% del peso fresco di un tubero di patata è acqua, quasi tutta la materia secca restante è amido ^1. La maggior parte dell'amido (70%) è costituito da amilopectina, mentre il resto è amilosio. Il rapporto tra amilosio e amilopectina è la proprietà più importante che influenza le proprietà fisiche di amido. Amilosio è una catena alfa 1-4 glucosio lineare, mentre l'amilopectina è un lineare alfa 1-4 catena con alfa 1-6 rami ^2. Metodi quali iodio vincolante, calorimetria a scansione differenziale (DSC), dimensioni elevate prestazioni esclusione cromatografia (HPSEC) e interazioni concanavalina A sono stati sviluppati per la determinazione dell'amido in diverse specie coltivate ^3,4. Ogni protocollo richiede competenze e attrezzature speciali, rendendo difficile scalare fino a quantificare i numerosi campioni alla volta. Il metodo che presentiamo qui è un protocollo modificato da Hovenkamp-Hermelink et al. ⁵ che è una lunghezza d'onda dual vincolante iodiometodo basato sulla granuli di amido colorati. I vantaggi di questo metodo rispetto altri includono la determinazione amilosio da amido greggio purificandolo e l'utilizzo del sistema doppia lunghezza d'onda per aumentare la precisione del metodo ^4,6.

Protocol

1. Determinazione amilosio da Potato Starch Tuber

1. Sbucciare e tagliare tuberi freschi a dadini.
2. Mettere cubetti di patate in piccoli sacchetti marroni e conservare tutta la notte a -80 ° C.
3. Trasferimento cubetti di patate alle borse di nylon e per liofilizzazione.
4. Dopo liofilizzato, macinare il campione di patate in polvere usando mortaio e pestello o un Wiley Mill.
5. In una provetta da 50 ml, aggiungere 20-30 mg dell ', campione di tubero terra liofilizzato.
6. Preparare una soluzione al 45% (w / v) di acido perclorico (24.4 ml della miscela del 60% di acido perclorico e 25,6 ml di acqua ultra-pura.
7. Aggiungere 500 ml di 45% (w / v) di acido perclorico e scuotere o agitare per disperdere i granuli di amido.
8. Dopo un periodo di quattro minuti di incubazione a temperatura ambiente, aggiungere 16 ml di acqua ultra-pura alla soluzione e mescolare nel vortex.
9. Dopo materiale non solubile è depositata sul fondo della provetta (7-10 min dopo), trasferire 40 microlitri della soluzione di micropiastra (evitando il pipettaggio di eventuali particelle).
10. Aggiungere 50 ml di soluzione di iodio (2 g di KI + 1 g I ₂ in 900 ml di acqua ultra-pura) e mescolare il campione con una pipetta.
11. Leggere l'assorbanza a 550 nm e 620 nm immediatamente.
12. Determinare la percentuale di amilosio dopo Confrontando il rapporto amilosio / amilopectina di ciascun campione (620 nm nm/550 assorbanza) con una curva standard generata da soluzioni amilosio e amilopectina in un intervallo di concentrazioni. Tale procedura verrà descritto successivamente. Leggi il vuoto (soluzione di iodio e acido perclorico) insieme con i campioni di prova. Usa oscurato i dati per le analisi.

2. Curve amilosio / amilopectina

1. In tubi separati pesano 12,5 mg di amilosio e 12,5 mg di amilopectina.
2. Aggiungere a ciascuna provetta 5 ml di 45% (w / v) di acido perclorico e sciogliere completamente.
3. Per ciascuna delle soluzioni (amilosio e amilopectina), portare a volume finale di 50 ml con acqua ultra-pura.
4. Mescolare 6.25ml di amilosio stock a partire dal passaggio precedente con 18,75 ml di acqua ultra-pura. Questo farà una soluzione amilosio 6,25 mg / ml.
5. Ripetere la procedura per la soluzione amilopectina.
6. Utilizzando il amilosio e amilopectina soluzioni standard da passi 2.4 e 2.5, preparare la percentuale standard amilosio che sono 0-100% amilosio (100-0% amilopectina) ad un volume finale di 5 ml per creare la curva standard in intervalli di 10%.
   Ad esempio, per preparare:
   L'amilosio / 100% Standard amilopectina 0%, pipetta da 5 ml di soluzione amilopectina.
   L'amilosio / 90% standard di amilopectina del 10%, si combinano 0,5 ml di amilosio e amilopectina 4,5 ml di soluzioni.
   L'amilosio / 80% standard di amilopectina 20%, si combinano 1,0 ml di amilosio e amilopectina 4,0 ml di soluzioni.
   L'amilosio / 70% standard di amilopectina 30%, si combinano 1,5 ml di amilosio e amilopectina 3,5 ml di soluzioni.
   L'amilosio / 60% standard di amilopectina del 40%, si combinano 2,0 ml di amilosio e amilopectina 2,0 ml di soluzioni.
   L'amilosio 50%/ 50% standard di amilopectina, combinare 2.5 amilosio ml e 2,5 ml di soluzioni di amilopectina.
   L'amilosio / amilopectina 40% Standard 60%, combinano 3,0 ml di amilosio e amilopectina 2,0 ml, e così via).
7. Trasferire 40 ml di ciascuna miscela standard per micropiastra. Includere un pozzo con 40 microlitri 45% (w / v) di acido perclorico come il vuoto.
8. Aggiungere 50 ml di soluzione di iodio (2 g di KI + 1 g I ₂ in 900 ml di acqua ultra-pura) e mescolare ogni campione (compreso il bianco) pipettando.
9. Per saperne di assorbanza a 550 nm e 620 nm immediatamente e calcolare il rapporto amilosio / amilopectina per ciascuna concentrazione.

Representative Results

La curva standard costruita dati tranciati di diverse soluzioni di concentrazione di amilosio / amilopectina mostra rapporti di assorbanza approssimativi nell'intervallo da 0,7 1.6 (Tabella 1). Una linea di tendenza di regressione lineare da questi dati viene poi utilizzata per dedurre contenuto di amilosio in liofilizzati campioni di patate (Figura 1).

L'ambiente di produzione vegetale ha qualche effetto sul contenuto di amilosio del tubero di patata ^7. Replicati determinazioni di contenuto di amilosio in due sedi distinte campo hanno mostrato bassa variazione tra i tuberi di patate (Tabella 2). Pigmenti di patate color carne non sembrano influenzare il dosaggio determinazione amilosio.

% Soluzione amilosio 1	550 nm assorbanza	620 nm assorbanza	Rapporto 2 620 nm/550 nm
0	0,223	0,156	0.700
10	0.225	0.181	0,804
20	0,221	0.203	0,919
30	0.220	0.219	0.995
40	0,223	0.246	1.103
60	0,216	0.280	1.296
70	0.231	0,319	1.381
90	0.225	0.347	1.542
100	0.219	0,357	1.630

Tabella 1. Relazione tra concentrazione di amilosio e il rapporto di assorbanza (620 nm/550 nm). Assorbanza rapporto vs cento amilosio è tracciata nella figura 1 </ Strong> per la determinazione amilosio ^1. Soluzione di amilosio percentuale è stata fatta da amilosio e amilopectina soluzioni madre a diverse concentrazioni ^2. Rapporto calcolato dai dati tranciati assorbanza a 620 nm e 550 nm.

Cultivar	Loc	550 nm	620 nm	Rapporto	Amilosio%
Adirondack Blu	1	1.86	1.78	0.955	25.5
	2	2.28	2.15	0,946	24.4
All'inizio Rose	1	2.17	2.12	0,977	27.8
	2	2.22	2.14	0,967	26.7
Freedom Russet	1	1.99	1.92	0,965	26.5
	2	1.98	1.93	0,973	27.4
Inca Gold	1	1.95	2.00	1.021	32.6
	2	2.27	2.28	1.004	30.7
Ranger Russet	1	1.88	1.84	0,975	27.6
	2	2.15	2.08	0,967	26.7
Russet Norkotah	1	1.84	1.79	0,972	27.3
	2	1.90	1.86	0,975	27.6
Snowden	1	2.23	2.13	0,956	25.5
	2	1.64	1.61	0,979	28.0
Pearl White	1	2.32	2.28	0,986	28.7
	2	2.22	2.18	0,983	28.5

Tabella 2. La valutazione replicato di contenuto di amilosio in cultivar di patata da due diversi siti produttivi campo (LOC).

Figura 1. Amilosio curva standard di concentrazione utilizzata per dedurre contenuto percentuale di amilosio nei tuberi di patata.

Discussion

Contenuto di amilosio nei tuberi di patata varia tipicamente 20-35% ^7,8. Se la maggior parte dei valori sono fuori di questo intervallo, considerare questi possibili errori: 1) i dati grezzi sono stati usati al posto dei dati blanking per la costruzione della curva standard amilosio / amilopectina; 2) i dati grezzi sono stati usati al posto dei dati blanking per la determinazione del amilosio / rapporti di amilopectina dai campioni di patate, oppure 3) l'acqua utilizzata per l'analisi non era abbastanza puro. Abbiamo notato che utilizzando acqua distillata e acqua non ultra-pura nell'analisi, i valori ottenuti non erano riproducibili. Un modo semplice per verificare che la soluzione di iodio viene preparata correttamente o se è ancora troppo vecchio per essere utilizzato è quello di verificare se il valore di assorbanza grezzo del campione in bianco a 550 nm è di circa 0,1.

Precisione nella preparazione della soluzioni amilopectina / amilosio iodio ed è fondamentale per ottenere determinazioni amilosio affidabili. Dal momento che stiamo determinando la proporzione di amyperdere contenuto piuttosto che l'esatta quantità di amilosio nel fecola di patate, non vi è alcuna fase di purificazione per l'isolamento di amido puro dalla polvere di patate come presentato da altri metodi di determinazione.

Per la determinazione del contenuto di amilosio in cultivar di patata, due freeze tuberi indipendenti secchi di ogni cultivar sono stati processati ad ogni località. Abbiamo trovato che la variazione del contenuto di amilosio tra i tuberi di patata era piccola (meno di un punto percentuale) e non significativo.

Non c'era differenza nella determinazione del contenuto di amilosio causa della quantità iniziale di fecola di patate, tra 20-30 mg. Al di fuori di questo intervallo, i risultati sono diventati inaffidabili o non rilevabili dal nostro lettore di piastre. Anche se Hovenkamp-Hermelink et al. ⁵ suggeriscono l'aggiunta di un volume di acqua se il campione è troppo concentrato, si consiglia il campione della pesata e ripetendo la procedura.

Questo Prese studionti dati a base di patate fleshed bianco. Inoltre, abbiamo valutato questo metodo con patate carne colorati (giallo, rosso e viola). È stata rilevata alcuna interferenza con il complesso iodio / amilosio. Tuttavia, come con qualsiasi saggio di legame iodio, la proporzione di amilosio è probabilmente sovrastimato piuttosto a causa del legame di iodio a catene lineari di molecole di amilopectina. Questo test è destinato lo screening di un gran numero di campioni. Una volta soggetti ad alto amilosio sono identificati, si consiglia di ri-test con un metodo specifico di amilosio, come concanavalina A ^9,10. Questo test è più costoso e che il saggio di legame iodio laborioso, ma determina più precisamente i livelli di amilosio.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Amylose	Sigma	859656
Amylopectin	Sigma	A8515
Perchloric Acid 60%	Sigma	311413	Very hazardous to skin and eyes
Iodine	Sigma	23214TD
Potassium iodide	Sigma	08625JE
Equipment
Plate Reader	Bio Tek	ELx800