Summary
Este protocolo describe un método colorimétrico de alta a través de poner que se basa en la formación de un complejo entre el yodo y cadenas de moléculas de glucosa en el almidón. El yodo forma complejos con tanto la amilosa y la amilopectina dentro de cadenas largas. Después de la adición de yodo a una muestra de almidón, la absorción máxima de la amilosa y la amilopectina se produce a 620 y 550 nm, respectivamente. La relación amilosa / amilopectina puede estimarse a partir de la relación de los valores de absorbancia 620 nm y 550 y la comparación de ellos con una curva patrón en la que concentraciones específicas conocido se representan frente a los valores de absorción. Este alto rendimiento, método barato es confiable y reproducible, lo que permite la evaluación de grandes poblaciones de clones de papa.
Abstract
Este protocolo describe un método colorimétrico de alta a través de poner que se basa en la formación de un complejo entre el yodo y cadenas de moléculas de glucosa en el almidón. El yodo forma complejos con tanto la amilosa y la amilopectina dentro de cadenas largas. Después de la adición de yodo a una muestra de almidón, la absorción máxima de la amilosa y la amilopectina se produce a 620 y 550 nm, respectivamente. La relación amilosa / amilopectina puede estimarse a partir de la relación de los valores de absorbancia 620 nm y 550 y la comparación de ellos con una curva patrón en la que concentraciones específicas conocido se representan frente a los valores de absorción. Este alto rendimiento, método barato es confiable y reproducible, lo que permite la evaluación de grandes poblaciones de clones de papa.
Introduction
Aproximadamente el 80% del peso fresco de un tubérculo de la patata es agua; casi la totalidad de la materia seca restante es el almidón 1. La mayor parte del almidón (70%) se compone de amilopectina, mientras que el resto es amilosa. La relación entre amilosa y amilopectina es la propiedad más importante que influye en las propiedades físicas del almidón. La amilosa es una cadena lineal de glucosa alfa 1-4, mientras que la amilopectina es una lineal cadena alfa 1-4 con alfa 1-6 ramas 2. Métodos como el yodo vinculante, calorimetría diferencial de barrido (DSC), el tamaño de alto rendimiento cromatografía de exclusión (HPSEC) y concanavalina A interacciones se han desarrollado para la determinación del almidón en diferentes especies de cultivo 3,4. Cada protocolo requiere de habilidades y equipos especiales, por lo que es difícil de escalar para cuantificar numerosas muestras a la vez. El método que aquí presentamos es un protocolo modificado de Hovenkamp-Hermelink et al. 5, que es una unión de doble longitud de onda de yodométodo basado en los gránulos de almidón teñidos. Las ventajas de este método frente a otros incluyen la determinación de amilosa de almidón en bruto sin purificar y el uso del sistema de doble longitud de onda para aumentar la precisión del método de 4,6.
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Protocol
1. Determinación de amilosa del almidón de la papa
- Pelar y cortar los tubérculos frescos en cubos pequeños.
- Coloca los cubos de papa en pequeñas bolsas de papel y almacenar toda la noche a -80 ° C.
- Transfiera los cubos de papa a las bolsas de nylon y de liofilización.
- Después de secado por congelación, moler la muestra de patata en polvo utilizando mortero o un molino Wiley.
- En un tubo de 50 ml, añadir 20-30 mg de la, muestra de tubérculo suelo liofilizado.
- Preparar una solución de 45% (w / v) de ácido perclórico (mezclar 24,4 ml de ácido perclórico al 60% y 25,6 ml de agua ultra-pura.
- Añadir 500 l de 45% (w / v) de ácido perclórico y agitar o removerlo para dispersar los gránulos de almidón.
- Después de un período de incubación de cuatro minutos a temperatura ambiente, añadir 16 ml de agua ultrapura a la solución y mezclar mediante agitación.
- Después de material no soluble se ha asentado en el fondo del tubo (7-10 minutos más tarde), transferir 40 l de la solución a una placa de microtitulación (evitando el pipeteado de todas las partículas).
- Añadir 50 l de solución de yodo (2 g de KI + 1 g de I 2 en 900 ml de agua ultrapura) y mezclar la muestra con la pipeta.
- Lea la absorbancia a 550 nm y 620 nm inmediatamente.
- Determinar el porcentaje de amilosa después de comparar la relación amilosa / amilopectina de cada muestra (620 nm/550 nm de absorbancia) con una curva estándar generada a partir de soluciones de amilosa y amilopectina en un intervalo de concentraciones. Este procedimiento se describe a continuación. Leer la (solución de yodo y ácido perclórico) en blanco junto con las muestras de ensayo. Uso blanqueó a los datos para los análisis.
2. Curva de amilosa / amilopectina
- En tubos separados pesan 12,5 mg de amilosa y 12,5 mg de amilopectina.
- Añadir a cada tubo 5 ml de 45% (w / v) de ácido perclórico y disolver completamente.
- Para cada una de las soluciones (amilosa y amilopectina), llevar a un volumen final de 50 ml con agua ultrapura.
- Mezclar 6,25ml de solución madre de amilosa de la etapa anterior con 18,75 ml de agua ultrapura. Esto hará que una solución de amilosa 6,25 mg / ml.
- Repita el procedimiento para la solución de la amilopectina.
- El uso de la amilosa y la amilopectina soluciones estándar de los pasos 2.4 y 2.5, preparar las normas de amilosa por ciento que son 0-100% de amilosa (100-0% de amilopectina) a un volumen final de 5 ml para crear la curva estándar en intervalos de 10%.
Por ejemplo, para preparar:
La amilosa / amilopectina 100% estándar de 0%, pipeta de 5 ml de solución de amilopectina.
El estándar de 10% de amilosa / 90% de amilopectina, se combinan 0,5 ml de amilosa y 4,5 ml de soluciones de amilopectina.
El estándar de 20% de amilosa / 80% de amilopectina, se combinan 1,0 ml de amilosa y 4,0 ml de soluciones de amilopectina.
El estándar de 30% de amilosa / 70% de amilopectina, se combinan 1,5 ml de amilosa y 3,5 ml de soluciones de amilopectina.
El estándar de 40% de amilosa / 60% de amilopectina, se combinan 2,0 ml de amilosa y 2,0 ml de soluciones de amilopectina.
La amilosa 50%/ Estándar amilopectina 50%, se combinan 2,5 ml de amilosa y amilopectina 2,5 ml de soluciones.
El estándar de 60% de amilosa / 40% de amilopectina, se combinan 3,0 ml de amilosa y amilopectina 2,0 ml, y así sucesivamente). - Transferir 40 l de cada mezcla estándar a una placa de microtitulación. Incluir un pozo con 40 l 45% (w / v) de ácido perclórico como blanco.
- Añadir 50 l de solución de yodo (2 g de KI + 1 G I 2 en 900 ml de agua ultra-pura) y mezclar cada muestra (incluyendo el espacio en blanco) por pipeteado.
- Leer las absorbancias a 550 nm y 620 nm inmediatamente y calcular la relación amilosa / amilopectina para cada concentración.
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Representative Results
La curva estándar construida a partir de datos troqueladas de diferentes soluciones de concentración de amilosa / amilopectina muestra razón de absorbancia aproximados que van desde 0,7 hasta 1,6 (Tabla 1). Una línea de tendencia de regresión lineal a partir de estos datos se utiliza posteriormente para inferir el contenido de amilosa en liofilizados muestras de papa (Figura 1).
El ambiente de producción de la planta tiene algún efecto sobre el contenido de amilosa del tubérculo 7. Determinaciones de contenido de amilosa replicados en dos lugares separados del campo mostraron baja variación entre los tubérculos de papa (Cuadro 2). Los pigmentos de las patatas de color carne no parecen afectar el ensayo de determinación de amilosa.
| % De solución de amilosa 1 | 550 nm de absorbancia | 620 nm de absorbancia | Ratio 2 620 nm nm/550 |
| 0 | 0.223 | 0.156 | 0.700 |
| 10 | 0.225 | 0.181 | 0.804 |
| 20 | 0.221 | 0.203 | 0.919 |
| 30 | 0.220 | 0.219 | 0.995 |
| 40 | 0.223 | 0.246 | 1.103 |
| 60 | 0.216 | 0.280 | 1.296 |
| 70 | 0.231 | 0.319 | 1.381 |
| 90 | 0.225 | 0.347 | 1.542 |
| 100 | 0.219 | 0.357 | 1.630 |
Tabla 1. Relación entre la concentración de amilosa y la relación de absorbancia (620 nm/550 nm). Relación de absorbencia frente al porcentaje de amilosa se representa en la figura 1 </ Strong> para la determinación de amilosa 1. Solución amilosa Porcentaje fue hecho de amilosa y amilopectina soluciones madre a diferentes concentraciones 2. Relación calculada a partir de datos cegados absorbancias a 620 nm y 550 nm.
| Cultivares | Loc | 550 nm | 620 nm | Proporción | La amilosa% |
| Adirondack Azul | 1 | 1.86 | 1.78 | 0.955 | 25.5 |
| 2 | 2.28 | 2.15 | 0.946 | 24.4 | |
| Early Rose | 1 | 2.17 | 2.12 | 0.977 | 27.8 |
| 2 | 2.22 | 2.14 | 0.967 | 26.7 | |
| Freedom Russet | 1 | 1.99 | 1.92 | 0.965 | 26.5 |
| 2 | 1.98 | 1.93 | 0.973 | 27.4 | |
| Inca de Oro | 1 | 1.95 | 2.00 | 1.021 | 32.6 |
| 2 | 2.27 | 2.28 | 1.004 | 30.7 | |
| Guardabosques Russet | 1 | 1.88 | 1.84 | 0.975 | 27.6 |
| 2 | 2.15 | 2.08 | 0.967 | 26.7 | |
| Norkotah Russet | 1 | 1.84 | 1.79 | 0.972 | 27.3 |
| 2 | 1.90 | 1.86 | 0.975 | 27.6 | |
| Snowden | 1 | 2.23 | 2.13 | 0.956 | 25.5 |
| 2 | 1.64 | 1.61 | 0.979 | 28.0 | |
| Pearl White | 1 | 2.32 | 2.28 | 0.986 | 28.7 |
| 2 | 2.22 | 2.18 | 0.983 | 28.5 |
Tabla 2. Evaluación replicada del contenido de amilosa en cultivares de papa procedentes de dos centros de producción de campo diferentes (LOC).
Figura 1. Curva estándar de concentración de amilosa utilizado para inferir contenido de amilosa por ciento en tubérculos de patata.
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Discussion
El contenido de amilosa en tubérculos de patata normalmente oscila entre 20-35% 7,8. Si la mayoría de los valores están fuera de este rango, considerar estos posibles errores: 1) datos brutos se utilizan en lugar de los datos blanqueó para la construcción de la curva estándar de amilosa / amilopectina; 2) datos brutos se utilizan en lugar de los datos blanqueó para la determinación de la amilosa / ratios de amilopectina de las muestras de patata, o 3) el agua utilizada para el análisis no era lo suficientemente puro. Nos dimos cuenta de que mediante el uso de agua destilada y el agua no ultrapura en el análisis, los valores obtenidos no fueron reproducibles. Una forma sencilla de comprobar que la solución de yodo se prepara correctamente o si todavía es demasiado viejo para ser utilizado es comprobar si el valor de absorbancia en bruto de la muestra en blanco a 550 nm es de alrededor de 0,1.
La precisión en la preparación del yodo y las soluciones de amilopectina / amilosa es crucial para conseguir determinaciones fiables de amilosa. Dado que estamos determinando la proporción de amyperder contenido en lugar de la cantidad exacta de amilosa en el almidón de patata, no hay etapa de purificación para el aislamiento de almidón puro a partir del polvo de patata tal como se presenta por otros métodos de determinación.
Para la determinación del contenido de amilosa en cultivares de patata, dos de congelación tubérculos secos independientes de cada cultivar fueron procesadas en cada localidad. Hemos encontrado que la variación de contenido de amilosa entre los tubérculos de patata era pequeña (menos de un punto porcentual) y no significativa.
No hubo diferencias en la determinación del contenido de amilosa debido a la cantidad inicial de almidón de patata, entre 20-30 mg. Fuera de este rango, los resultados llegaron a ser poco fiable o no detectables por nuestro lector de placas. Aunque Hovenkamp-Hermelink et al. 5 sugieren la adición de un volumen de agua si la muestra está demasiado concentrada, se recomienda volver a pesar la muestra y repetir el procedimiento.
Este estudio presedatos nts basados en patatas de carne blanca. Además, hemos evaluado este método con las patatas de la carne de color (amarillo, rojo y morado). No se detectó ninguna interferencia con el complejo de yodo / amilosa. Sin embargo, como con cualquier ensayo de unión de yodo, la proporción de amilosa es probable que sea algo sobreestimado debido a la unión de yodo a cadenas lineales en las moléculas de amilopectina. Este ensayo ha sido diseñado para el cribado de un gran número de muestras. Una vez identificados los individuos de alto contenido de amilosa, se recomienda volver a probar con un ensayo-amilosa específica, como concanavalina A 9,10. Este ensayo es más caro y mano de obra que el ensayo de unión de yodo, pero se determina con mayor precisión los niveles de amilosa.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
El financiamiento para esta investigación fue proporcionado en parte por el Programa de Investigación Asociado USDA-ARS y el Comité de Germoplasma de Cultivos USDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Amylose | Sigma | 859656 | |
| Amylopectin | Sigma | A8515 | |
| Perchloric Acid 60% | Sigma | 311413 | Very hazardous to skin and eyes |
| Iodine | Sigma | 23214TD | |
| Potassium iodide | Sigma | 08625JE | |
| Equipment | |||
| Plate Reader | Bio Tek | ELx800 | |
References
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