Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen hochdurchgestellt kolorimetrischen Methode, die auf der Bildung eines Komplexes zwischen Jod und Ketten von Glucosemolekülen in Stärke beruht. Jod bildet Komplexe mit sowohl Amylose und Amylopektin in langen Ketten. Nach der Zugabe von Jod zu einer Stärkeprobe, die maximale Absorption von Amylose und Amylopektin erfolgt bei 620 und 550 nm auf. Das Amylose / Amylopektin-Verhältnis kann aus dem Verhältnis der 620 und 550 nm Absorptionswerte geschätzt werden und deren Vergleich mit einer Standardkurve, in der spezifischen bekannten Konzentrationen an Absorptionswerte aufgetragen. Dieser hohe Durchsatz ist kostengünstiges Verfahren zuverlässig und reproduzierbar, so dass die Auswertung von großen Populationen von Kartoffel-Klonen.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt einen hochdurchgestellt kolorimetrischen Methode, die auf der Bildung eines Komplexes zwischen Jod und Ketten von Glucosemolekülen in Stärke beruht. Jod bildet Komplexe mit sowohl Amylose und Amylopektin in langen Ketten. Nach der Zugabe von Jod zu einer Stärkeprobe, die maximale Absorption von Amylose und Amylopektin erfolgt bei 620 und 550 nm auf. Das Amylose / Amylopektin-Verhältnis kann aus dem Verhältnis der 620 und 550 nm Absorptionswerte geschätzt werden und deren Vergleich mit einer Standardkurve, in der spezifischen bekannten Konzentrationen an Absorptionswerte aufgetragen. Dieser hohe Durchsatz ist kostengünstiges Verfahren zuverlässig und reproduzierbar, so dass die Auswertung von großen Populationen von Kartoffel-Klonen.
Introduction
Etwa 80% des Frischgewicht einer Kartoffelknolle ist Wasser, fast alle der verbleibenden Trockenmasse ist Stärke ein. Der größte Teil der Stärke (70%) aus Amylopektin besteht, während der Rest Amylose. Das Verhältnis zwischen Amylose und Amylopektin ist die wichtigste Eigenschaft die Beeinflussung der physikalischen Eigenschaften der Stärke. Amylose ist ein lineares alpha 1-4 Zuckerkette, während Amylopektin ein lineares alpha-Kette mit 1-4 alpha 1-6 Verzweigungen 2. Verfahren wie Jodbindung, Differential Scanning Calorimetry (DSC), Hochleistungs-Grßenausschlußchromatographie (HPSEC) und Concanavalin A-Wechselwirkungen zur Stärkebestimmung in verschiedenen Pflanzenspezies 3,4 entwickelt. Jedes Protokoll erfordert besondere Fähigkeiten und Ausrüstung, was es schwierig zu skalieren, zahlreiche Proben zu einem Zeitpunkt zu quantifizieren. Die Methode, die wir hier vorstellen ist ein modifiziertes Protokoll von Hovenkamp-Hermelink et al. 5, die ein Dual-Wellenlängen-Jod-Bindung istVerfahren, das auf gefärbten Stärkekörner. Die Vorteile dieser Methode gegenüber anderen sind die Amylose Bestimmung von roher Stärke ohne Reinigung es und die Verwendung der Dual-Wellenlängen-System, um die Genauigkeit der Methode 4,6 zu erhöhen.
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Protocol
1. Amylose Bestimmung von Kartoffelknollenstärke
- Schälen und schneiden frische Knollen in kleine Würfel schneiden.
- Zeigen Kartoffelwürfel in kleinen braunen Taschen und über Nacht bei -80 ° C.
- Übertragen Kartoffelwürfel auf Nylonbeutel und für die Gefriertrocknung.
- Nach gefriergetrocknet, zermahlen die Kartoffelprobe zu Pulver mit Mörser und Stößel oder einer Wiley-Mühle.
- In ein 50 ml Röhrchen, fügen 20-30 mg des gefriergetrockneten, Boden Knollenprobe.
- Bereiten Sie eine Lösung von 45% (w / v) Perchlorsäure (Mischungs 24,4 ml 60% Perchlorsäure und 25,6 ml von ultra-reinem Wasser.
- In 500 ul von 45% (w / v) Perchlorsäure und schütteln oder schwenken Sie um Stärkekörner zu verteilen.
- Nach einem Vier-Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur, fügen Sie 16 ml ultrareinem Wasser zu der Lösung und durch Vortexen mischen.
- Nach der nicht-löslichen Material auf dem Boden der Röhre angesiedelt (7-10 min später), Transfer 40 ul der Lösung auf eine Mikrotiterplatte (Vermeidung der Pipettieren von Partikeln).
- In 50 ul von Jod-Lösung (2 g KI + 1 g I 2 in 900 ml Reinstwasser) und mischen Sie die Probe durch Pipettieren.
- Die Absorption bei 550 nm und 620 nm sofort.
- Bestimmen Sie die Amylose-Anteil nach Vergleich des Amylose / Amylopektin-Verhältnis von jeder Probe (620 nm/550 nm-Absorption) mit einer Standardkurve von Amylose und Amylopektin-Lösungen bei verschiedenen Konzentrationen erzeugt. Dieser Vorgang wird als nächstes beschrieben. Lesen des Rohlings (Jodlösung und Perchlorsäure) zusammen mit den Testproben. Verwendung tanzt Daten für die Analysen.
2. Amylose / Amylopektin-Kurve
- In getrennten Röhren wiegen 12,5 mg Amylose und Amylopektin 12,5 mg.
- Hinzufügen zu jedem Röhrchen 5 ml 45% (w / v) Perchlorsäure und vollständig aufzulösen.
- Für jede der Lösungen (Amylose und Amylopectin), zu bringen, um ein Endvolumen von 50 ml mit ultrareinem Wasser.
- Mix 6.25ml Amylose-Lager aus dem vorherigen Schritt mit 18,75 ml ultra-reinem Wasser. Damit wird ein 6,25 mg / ml Lösung Amylose.
- Wiederholen Sie den Vorgang für die Amylopektin-Lösung.
- Verwendung der Amylose-und Amylopektin-Standardlösungen aus den Schritten 2.4 und 2.5, bereiten die Prozent Amylose Standards, die 0-100% Amylose (100-0% Amylopektin) auf ein Endvolumen von 5 ml der Standardkurve in 10%-Intervallen zu schaffen.
Zum Beispiel die Vorbereitung:
Die 0% Amylose / Amylopektin 100% Standard-Pipette 5 ml Lösung Amylopektin.
Die 10% Amylose / 90% Amylopektin-Standard, kombiniert 0,5 ml Amylose und Amylopektin 4,5 ml-Lösungen.
Die 20% Amylose / 80% Amylopektin-Standard, kombiniert 1,0 ml Amylose und Amylopektin 4,0 ml-Lösungen.
Die 30% Amylose / 70% Amylopektin-Standard, kombiniert 1,5 ml Amylose und Amylopektin 3,5 ml-Lösungen.
Die 40% Amylose / 60% Amylopektin-Standard, kombiniert 2,0 ml Amylose und Amylopektin 2,0 ml-Lösungen.
Die 50% Amylose/ 50% Amylopektin-Standard, kombiniert 2,5 ml Amylose und Amylopektin 2,5 ml-Lösungen.
Die 60% Amylose / Amylopektin 40% Standard kombinieren 3,0 ml und 2,0 ml Amylose Amylopektin, und so weiter). - Transfer 40 ul jedes Standards Mischung auf eine Mikrotiterplatte. Fügen Sie einen gut mit 40 ul 45% (w / v) Perchlorsäure als leer.
- In 50 ul von Jod-Lösung (2 g KI + 1 g I 2 in 900 ml Reinstwasser) und mischen jede Probe (einschließlich Leerzeichen) durch Pipettieren.
- Lesen Absorption bei 550 nm und 620 nm sofort und berechnen Sie die Amylose / Amylopektin-Verhältnis für jede Konzentration.
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Representative Results
Die Standardkurve von tanzt Daten verschiedener Amylose / Amylopektin-Konzentration Lösungen konstruiert zeigt ungefähre Absorptionsverhältnis von 0,7 bis 1.6 (Tabelle 1). Eine lineare Regressionstrendlinie von diesen Daten werden später zum Ableiten Amylosegehalt in gefriergetrockneter Kartoffelproben (Fig. 1) verwendet.
Die Anlage Produktionsumgebung hat eine Wirkung auf die Amylose-Gehalt in der Kartoffelknolle 7. Amylose repliziert Bestimmungen in zwei getrennten Feldpositionen zeigten eine geringe Variation auf die Kartoffelknollen (Tabelle 2). Pigmente in farbigen Fleisch Kartoffeln scheinen nicht die Amylose Bestimmung Assay beeinflussen.
| % Amylose-Lösung ein | 550 nm Absorption | 620 nm Absorption | Verhältnis 2 620 nm/550 nm |
| 0 | 0.223 | 0.156 | 0.700 |
| 10 | 0,225 | 0.181 | 0.804 |
| 20 | 0.221 | 0.203 | 0,919 |
| 30 | 0.220 | 0.219 | 0,995 |
| 40 | 0.223 | 0.246 | 1.103 |
| 60 | 0.216 | 0.280 | 1.296 |
| 70 | 0.231 | 0.319 | 1.381 |
| 90 | 0,225 | 0.347 | 1.542 |
| 100 | 0.219 | 0.357 | 1.630 |
Tabelle 1. Verbindungen zwischen Amylose Konzentration und Absorptionsverhältnis (620 nm/550 nm). Verhältnis der Absorptionsvermögen gegen Prozent Amylose ist in Fig. 1 <aufgetragen/ Strong> für Amylose Bestimmung ein. Prozentual Amylose-Lösung wurde aus Amylose und Amylopektin Stammlösungen in unterschiedlichen Konzentrationen 2 verwiesen. Berechnete Verhältnis von ausgeblendeten Daten Extinktionen bei 620 nm und 550 nm liegt.
| Sorte | Loc | 550 nm | 620 nm | Verhältnis | Amylose% |
| Adirondack Blau | 1 | 1,86 | 1,78 | 0,955 | 25,5 |
| 2 | 2,28 | 2,15 | 0,946 | 24,4 | |
| Frühe Rose | 1 | 2.17 | 2.12 | 0,977 | 27,8 |
| 2 | 2.22 | 2.14 | 0.967 | 26,7 | |
| FreEdom Russet | 1 | 1,99 | 1,92 | 0,965 | 26,5 |
| 2 | 1,98 | 1,93 | 0,973 | 27,4 | |
| Inca Gold | 1 | 1,95 | 2,00 | 1.021 | 32,6 |
| 2 | 2,27 | 2,28 | 1.004 | 30,7 | |
| Ranger Russet | 1 | 1,88 | 1,84 | 0,975 | 27,6 |
| 2 | 2,15 | 2,08 | 0.967 | 26,7 | |
| Russet Norkotah | 1 | 1,84 | 1,79 | 0.972 | 27,3 |
| 2 | 1,90 | 1,86 | 0,975 | 27,6 | |
| Snowden | 1 | 2.23 | 2.13 | 0.956 | 25,5 |
| 2 | 1,64 | 1.61 | 0,979 | 28,0 | |
| White Pearl | 1 | 2,32 | 2,28 | 0,986 | 28,7 |
| 2 | 2.22 | 2.18 | 0,983 | 28,5 |
Tabelle 2. Replizierte Auswertung von Amylose in Kartoffelsorten aus zwei verschiedenen Feld Produktionsstandorte (Loc).
Abbildung 1. Amylose Konzentration Standardkurve zur Amylose Prozent Gehalt in Kartoffelknollen zu schließen.
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Discussion
Amylose Gehalt in Kartoffelknollen typischerweise im Bereich von 20-35% 7,8. Wenn die meisten Werte außerhalb dieses Bereiches, betrachten Sie diese möglichen Fehler: 1) Rohdaten wurden statt blendet Daten für den Bau des Amylose / Amylopektin-Standardkurve verwendet, 2) Rohdaten wurden statt blendet Daten für die Bestimmung der Amylose verwendet / Amylopektin-Verhältnis von den Kartoffelproben, oder 3) die für die Analyse verwendeten Wasser war nicht rein genug. Wir haben festgestellt, dass durch Verwendung von destilliertem Wasser und nicht ultrareinem Wasser in der Analyse waren die erhaltenen Werte nicht reproduzierbar. Eine einfache Möglichkeit, um zu überprüfen, dass die Jod-Lösung korrekt zubereitet oder, wenn es noch zu alt, um verwendet werden, ist zu prüfen, ob die Rohstoffe Absorptionswert der Blindprobe bei 550 nm beträgt rund 0,1.
Präzision bei der Herstellung des Iod und Amylopektin / Amylose-Lösungen ist entscheidend, um immer zuverlässig Amylose Bestimmungen. Da wir den Anteil an AmyInhalt verlieren, statt der genauen Zahl der Amylose in der Kartoffelstärke, gibt es keine Reinigungsschritt für die Isolierung von reiner Stärke aus der Kartoffel-Pulver als von anderen Bestimmungsmethoden vorgestellt.
Für die Bestimmung des Amylose-Gehalt in Kartoffelsorten wurden zwei unabhängige gefriergetrocknet Knollen von jeder Sorte an jedem Ort bearbeitet. Wir fanden, daß die Variation für Amylosegehalt zwischen den Kartoffelknollen war klein (weniger als ein Prozent) und nicht signifikant.
Es gab keinen Unterschied in der Amylosegehalt Bestimmung durch die anfängliche Menge an Kartoffelstärke, zwischen 20-30 mg. Außerhalb dieses Bereiches wurden die Ergebnisse unzuverlässig oder nicht nachweisbar durch unsere Plattenlesegerät. Auch wenn Hovenkamp-Hermelink et al. 5 vorschlagen, indem ein Wasservolumen, wenn die Probe zu konzentriert ist, empfehlen wir erneutes Auswiegen der Probe und Wiederholen Sie den Vorgang.
Diese Studie Presents Daten basieren auf weißem konkretisiert Kartoffeln. Darüber hinaus haben wir diese Methode mit farbigen Fleisch Kartoffeln (gelb, rot und lila) bewertet. Keine Interferenz mit der Iod / Amylose-Komplex wurde festgestellt. Wie bei jedem Jod-Bindungstest ist jedoch der Anteil an Amylose wahrscheinlich etwas aufgrund der Bindung von Jod zu geraden Ketten in den Amylopektinmolekülen überschätzt werden. Dieser Assay wird zum Screening großer Probenzahlen bestimmt. Sobald hohem Amylose Personen identifiziert werden, empfehlen wir eine erneute Prüfung mit einem Amylose-spezifischen Assay, wie Concanavalin A 9,10. Dieser Assay ist teurer und arbeitsintensiver als die Iod-Bindungstest, aber es genauer bestimmt Amylose Ebenen.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Finanzierung dieser Forschung wurde zum Teil von der USDA-ARS Research Associate-Programm und der USDA Crop Germplasm Ausschuss zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Amylose | Sigma | 859656 | |
| Amylopectin | Sigma | A8515 | |
| Perchloric Acid 60% | Sigma | 311413 | Very hazardous to skin and eyes |
| Iodine | Sigma | 23214TD | |
| Potassium iodide | Sigma | 08625JE | |
| Equipment | |||
| Plate Reader | Bio Tek | ELx800 | |
References
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