Summary
يصف هذا البروتوكول عالية من خلال وضع أسلوب اللونية التي تعتمد على تشكيل المعقدة بين اليود وسلاسل من جزيئات الجلوكوز في النشا. اليود تشكل المجمعات مع كل أميلوز وسلاسل طويلة داخل أميلوبكتين. بعد إضافة اليود إلى عينة النشا، واستيعاب الحد الأقصى من أميلوز والأميلوبكتين يحدث في 620 و 550 نانومتر، على التوالي. يمكن تقدير نسبة أميلوز / أميلوبكتين من نسبة القيم الامتصاصية نانومتر 620 و 550 ومقارنتها إلى منحنى القياسية التي يتم رسم تركيزات محددة معروفة ضد القيم الاستيعاب. هذا إنتاجية عالية، وطريقة غير مكلفة هو موثوق بها وقابلة للتكرار، والسماح للتقييم أعداد كبيرة من الحيوانات المستنسخة البطاطس.
Abstract
يصف هذا البروتوكول عالية من خلال وضع أسلوب اللونية التي تعتمد على تشكيل المعقدة بين اليود وسلاسل من جزيئات الجلوكوز في النشا. اليود تشكل المجمعات مع كل أميلوز وسلاسل طويلة داخل أميلوبكتين. بعد إضافة اليود إلى عينة النشا، واستيعاب الحد الأقصى من أميلوز والأميلوبكتين يحدث في 620 و 550 نانومتر، على التوالي. يمكن تقدير نسبة أميلوز / أميلوبكتين من نسبة القيم الامتصاصية نانومتر 620 و 550 ومقارنتها إلى منحنى القياسية التي يتم رسم تركيزات محددة معروفة ضد القيم الاستيعاب. هذا إنتاجية عالية، وطريقة غير مكلفة هو موثوق بها وقابلة للتكرار، والسماح للتقييم أعداد كبيرة من الحيوانات المستنسخة البطاطس.
Introduction
ما يقرب من 80٪ من الوزن الطازج من درنة البطاطس هو الماء؛ كلها تقريبا من المادة الجافة المتبقية هي النشا 1. ويتكون معظم النشا (70٪) من أميلوبكتين، في حين أن الباقي هو أميلوز. النسبة بين أميلوز والأميلوبكتين هي الخاصية الأكثر أهمية التي تؤثر على الخواص الفيزيائية للنشا. أميلوز هو خطية ألفا 1-4 سلسلة الجلوكوز، في حين أميلوبكتين هو الخطية سلسلة ألفا 1-4 مع ألفا 1-6 الفروع 2. أساليب مثل اليود ملزمة، المسح التفاضلي قياس الكالوري (DSC)، وقد وضعت حجم عالية الأداء اللوني الاستبعاد (HPSEC) وكونكانافالين A لتحديد التفاعلات النشا في أنواع المحاصيل المختلفة 3،4. كل بروتوكول يتطلب مهارات ومعدات خاصة، مما يجعل من الصعب تحديد مقياس يصل إلى عينات عديدة في وقت واحد. طريقة نقدم هنا هو بروتوكول تعديل من Hovenkamp-Hermelink وآخرون. 5 وهو الطول الموجي المزدوج اليود ملزمةطريقة تعتمد على حبيبات النشا الملون. وتشمل مزايا هذا الأسلوب في مقابل الآخرين تحديد أميلوز من النشا الخام دون تنقية وبين استخدام نظام الطول الموجي المزدوج لزيادة دقة الأسلوب 4،6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحديد أميلوز من درنة البطاطس نشا
- قشر وقطع الدرنات الطازجة إلى مكعبات صغيرة.
- وضع مكعبات البطاطا في أكياس صغيرة البني وتخزينها بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية.
- نقل مكعبات البطاطا إلى أكياس النايلون وتجميد التجفيف.
- بعد تجميد المجفف، طحن العينة إلى مسحوق البطاطا باستخدام قذائف هاون ومدقة أو مطحنة وايلي.
- في أنبوب 50 مل، إضافة 20-30 ملغ من عينة درنة الأرض تجميد المجفف.
- يعد حل 45٪ (ث / ت) وحامض البيركلوريك (مزيج 24.4 مل من حمض البيركلوريك 60٪ و 25.6 مل من الماء نقي للغاية.
- إضافة 500 ميكرولتر من 45٪ (ث / ت) وحامض البيركلوريك ويهز أو دوامة لتفريق حبيبات النشا.
- بعد فترة الحضانة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة، إضافة 16 مل من الماء نقي للغاية في حل ومزيج من قبل vortexing.
- بعد أن استقر المواد غير القابلة للذوبان إلى أسفل الأنبوب (في وقت لاحق 7-10 دقيقة)، ونقل 40 ميكرولتر من حل لوحة microtiter (pipetting لتجنب أي جسيمات).
- إضافة 50 ميكرولتر من محلول اليود (2 غ + 1 غ KI I 2 في 900 مل من الماء نقي للغاية) وتخلط العينة قبل pipetting.
- قراءة الامتصاصية في 550 نانومتر و 620 نانومتر على الفور.
- تحديد نسبة أميلوز بعد مقارنة نسبة أميلوز / أميلوبكتين من كل عينة (620 نانومتر الامتصاصية nm/550) مع منحنى القياسية الناتجة عن أميلوز والأميلوبكتين الحلول في مجموعة من التركيزات. وسيتم وصف هذا الإجراء المقبل. قراءة فارغة (محلول اليود وحمض البيركلوريك) جنبا إلى جنب مع عينات الاختبار. استخدام مموها البيانات للتحليلات.
2. أميلوز / أميلوبكتين المنحنى
- في أنابيب منفصلة تزن 12.5 ملغ من أميلوز و 12.5 ملغ من أميلوبكتين.
- إضافة إلى كل أنبوب 5 مل من 45٪ (ث / ت) وحامض البيركلوريك وتذوب تماما.
- لكل من حلول (أميلوز والأميلوبكتين)، وجلب إلى الحجم النهائي من 50 مل مع الماء نقي للغاية.
- مزيج 6.25مل من الأسهم أميلوز من الخطوة السابقة مع 18.75 مياه نقي للغاية مل. وهذا سيجعل حل أميلوز 6.25 ملغ / مل.
- كرر الإجراء من أجل حل أميلوبكتين.
- باستخدام أميلوز والحلول القياسية أميلوبكتين من الخطوات 2.4 و 2.5، وإعداد معايير أميلوز في المئة والتي هي 0-100٪ أميلوز (100-0٪ أميلوبكتين) إلى الحجم النهائي من 5 مل لإنشاء منحنى القياسية في فترات 10٪.
على سبيل المثال، للتحضير:
و0٪ أميلوز / 100٪ أميلوبكتين القياسية، ماصة 5 مل من محلول أميلوبكتين.
10٪ أميلوز / 90٪ معيار أميلوبكتين، والجمع بين 0.5 و 4.5 مل أميلوز مل حلول أميلوبكتين.
20٪ أميلوز / 80٪ معيار أميلوبكتين، والجمع بين 1.0 و 4.0 مل أميلوز مل حلول أميلوبكتين.
30٪ أميلوز / 70٪ معيار أميلوبكتين، والجمع بين 1.5 و 3.5 مل أميلوز مل حلول أميلوبكتين.
40٪ أميلوز / 60٪ معيار أميلوبكتين، والجمع بين 2.0 و 2.0 مل أميلوز مل حلول أميلوبكتين.
وأميلوز 50٪/ 50٪ معيار أميلوبكتين، والجمع بين 2.5 و 2.5 مل أميلوز مل حلول أميلوبكتين.
60٪ أميلوز / 40٪ معيار أميلوبكتين، والجمع بين 3.0 و 2.0 مل أميلوز مل أميلوبكتين، وهلم جرا). - نقل 40 ميكرولتر من كل الخليط القياسية لوحة microtiter. تشمل جيدا مع 40 ميكرولتر 45٪ (ث / ت) وحامض البيركلوريك كما فارغة.
- إضافة 50 ميكرولتر من محلول اليود (2 غ + 1 غ KI I 2 في 900 مل من الماء نقي للغاية) وتخلط كل عينة (بما في ذلك فارغة) من قبل pipetting.
- قراءة absorbances في 550 نانومتر و 620 نانومتر فورا وحساب نسبة أميلوز / أميلوبكتين لكل تركيز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
منحنى القياسية شيدت من البيانات مموها من مختلف الحلول تركيز أميلوز / أميلوبكتين يبين نسب تقريبية تتراوح الامتصاصية 0،7-1،6 (الجدول 1). ويستخدم خط الاتجاه الخطي الانحدار من هذه البيانات في وقت لاحق لاستنتاج المحتوى أميلوز في تجميد المجفف عينات البطاطا (الشكل 1).
البيئة الإنتاج النباتي له بعض التأثير على محتوى أميلوز في درنة البطاطس 7. أظهرت تكرارها قرارات المحتويات أميلوز في موقعين حقل منفصل تباين منخفض بين درنات البطاطا (الجدول 2). لا يبدو أصباغ في البطاطس اللحم الملونة تؤثر على فحص تقرير أميلوز.
| ٪ أميلوز الحل 1 | 550 نانومتر الامتصاصية | 620 نانومتر الامتصاصية | 2 نسبة 620 نانومتر nm/550 |
| 0 | 0.223 | 0.156 | 0.700 |
| 10 | 0.225 | 0.181 | 0.804 |
| 20 | 0.221 | 0.203 | 0.919 |
| 30 | 0.220 | 0.219 | 0.995 |
| 40 | 0.223 | 0.246 | 1.103 |
| 60 | 0.216 | 0.280 | 1.296 |
| 70 | 0.231 | 0.319 | 1.381 |
| 90 | 0.225 | 0.347 | 1.542 |
| 100 | 0.219 | 0.357 | 1.630 |
يتم رسم الجدول 1. العلاقة بين تركيز أميلوز ونسبة الامتصاصية (620 nm/550 نانومتر). نسبة الامتصاصية مقابل المئة أميلوز في الشكل 1 </ قوي> لتحديد أميلوز 1. تم حل نسبة أميلوز من أميلوز والأميلوبكتين حلول السهم عند تركيزات مختلفة 2. نسبة تحسب من البيانات مموها absorbances في 620 نانومتر و 550 نانومتر.
| صنف | الموضع | 550 نانومتر | 620 نانومتر | نسبة | أميلوز٪ |
| آديرونداك الأزرق | 1 | 1.86 | 1.78 | 0.955 | 25.5 |
| 2 | 2.28 | 2.15 | 0.946 | 24.4 | |
| روز المبكر | 1 | 2.17 | 2.12 | 0.977 | 27.8 |
| 2 | 2.22 | 2.14 | 0.967 | 26.7 | |
| الصحائفادوم راسيت | 1 | 1.99 | 1.92 | 0.965 | 26.5 |
| 2 | 1.98 | 1.93 | 0.973 | 27.4 | |
| الإنكا الذهب | 1 | 1.95 | 2.00 | 1.021 | 32.6 |
| 2 | 2.27 | 2.28 | 1.004 | 30.7 | |
| حارس راسيت | 1 | 1.88 | 1.84 | 0.975 | 27.6 |
| 2 | 2.15 | 2.08 | 0.967 | 26.7 | |
| اللون الخمري Norkotah | 1 | 1.84 | 1.79 | 0.972 | 27.3 |
| 2 | 1.90 | 1.86 | 0.975 | 27.6 | |
| سنودن | 1 | 2.23 | 2.13 | 0.956 | 25.5 |
| 2 | 1.64 | 1.61 | 0.979 | 28.0 | |
| لؤلؤة بيضاء | 1 | 2.32 | 2.28 | 0.986 | 28.7 |
| 2 | 2.22 | 2.18 | 0.983 | 28.5 |
الجدول 2. تقييم منسوخة من المحتويات أميلوز في أصناف البطاطا من اثنين من مختلف المواقع إنتاج حقل (لوك).
الشكل 1. أميلوز منحنى القياسية المستخدمة لاستنتاج تركيز المحتوى أميلوز في المئة في درنات البطاطس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المحتويات أميلوز في درنات البطاطا يتراوح عادة 20-35٪ 7،8. إذا كان معظم القيم خارج هذا النطاق، والنظر في هذه الأخطاء المحتملة: 1) استخدمت البيانات الخام بدلا من البيانات مموها لبناء منحنى أميلوز / أميلوبكتين القياسية؛ 2) استخدمت البيانات الخام بدلا من البيانات مموها لتحديد أميلوز / نسب أميلوبكتين من عينات البطاطا، أو 3) كانت المياه المستخدمة لتحليل يست نقية بما فيه الكفاية. لاحظنا أنه باستخدام الماء المقطر والماء لا نقي للغاية في التحليل، وكانت القيم التي تم الحصول عليها لا يمكن استنساخه. طريقة سهلة للتحقق من أن يتم تحضير محلول اليود بشكل صحيح أو إذا كان لا يزال قديمة جدا لاستخدامها للتحقق ما إذا كانت قيمة الامتصاصية الخام من عينة فارغة في 550 نانومتر حوالي 0.1.
الدقة في إعداد اليود والحلول أميلوبكتين / أميلوز أمر بالغ الأهمية إلى الحصول على قرارات أميلوز موثوق بها. بما أننا تحديد نسبة ايميتفقد المحتوى بدلا من المبلغ المحدد للأميلوز في نشا البطاطس، لا توجد خطوة تنقية لعزل النشا نقية من مسحوق البطاطا كما عرضتها وسائل تحديد غيرها.
لتحديد محتوى أميلوز في أصناف البطاطا، تمت معالجة اثنين تجميد الدرنات المجففة مستقلة من كل صنف في كل محلة. وجدنا أن التباين لمحتوى أميلوز بين درنات البطاطا كانت صغيرة (أقل من نقطة مئوية واحدة) وليس كبيرا.
لم يكن هناك اختلاف في تحديد المحتوى أميلوز نظرا لكمية أولية من نشا البطاطس، وبين 20-30 ملغ. خارج هذا النطاق، وأصبحت نتائج لا يمكن الاعتماد عليها أو لا يمكن الكشف عنها بواسطة قارئ لوحة لدينا. على الرغم من Hovenkamp-Hermelink وآخرون. 5 أقترح إضافة حجم الماء إذا يتركز العينة جدا، ونحن نوصي إعادة وزن العينة وتكرار الإجراء.
هذه الدراسة بريسيالبيانات اليلة على أساس البطاطا اللحم الأبيض. بالإضافة إلى ذلك، لدينا تقييم هذا الأسلوب مع البطاطا اللحم الملونة (الأصفر والأحمر والأرجواني). تم الكشف عن أي تدخل مع مجمع اليود / أميلوز. ومع ذلك، كما هو الحال مع أي مقايسة ملزمة اليود، ومن المرجح أن تكون المبالغة إلى حد ما بسبب الربط من اليود إلى سلاسل متتالية في جزيئات أميلوبكتين نسبة أميلوز. ويهدف هذا الاختبار لفحص عدد كبير من العينات. مرة واحدة يتم تحديد الأفراد أميلوز عالية، ونحن نوصي إعادة الاختبار مع مقايسة أميلوز محددة، مثل كونكانافالين A 9،10. هذا الاختبار هو أكثر تكلفة من والفحص ملزمة اليود كثيفة العمالة، ولكنه يحدد بشكل أدق مستويات أميلوز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وقدمت التمويل لهذا البحث في جزء من برنامج باحث مشارك USDA-ARS ولجنة الأصول الوراثية للمحاصيل وزارة الزراعة الأميركية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Amylose | Sigma | 859656 | |
| Amylopectin | Sigma | A8515 | |
| Perchloric Acid 60% | Sigma | 311413 | Very hazardous to skin and eyes |
| Iodine | Sigma | 23214TD | |
| Potassium iodide | Sigma | 08625JE | |
| Equipment | |||
| Plate Reader | Bio Tek | ELx800 | |
References
- Composition Hoover, R. molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review. Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).
- Bertoft, E., Blennow, A. Structure of Potato Starch. Advances in Potato Chemistry and Technology. , 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).
- Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds. Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).
- Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique. Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).
- Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato. Potato Res. 31, 241-246 (1988).
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. Starch. , 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).
- Haase, N. U., Plate, J. Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors. Stärke. 48 (5), 167-171 (1996).
- Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules. Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).
- Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A. J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).
- Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A. Starch. 42, 302-305 (1990).
