Rapid High Throughput Amylose Bepaling in gevriesdroogde aardappelknol Samples

Summary

Dit protocol beschrijft een hoge doorverbonden colorimetrische methode die is gebaseerd op de vorming van een complex tussen jodium en ketens van glucose moleculen in zetmeel. Jodium vormt complexen met zowel amylose en lange ketens binnen amylopectine. Na de toevoeging van jodium aan een zetmeelmonster, de maximale absorptie van amylose en amylopectine optreedt bij 620 en 550 nm respectievelijk. De amylose / amylopectine verhouding kan worden geschat uit de verhouding tussen de 620 en 550 nm absorptiewaarden en ze te vergelijken met een standaard curve waarbij bepaalde bekende concentraties zijn uitgezet tegen absorptiewaarden. Deze hoge throughput, goedkope methode betrouwbaar en reproduceerbaar, waardoor de evaluatie van grote populaties van aardappel klonen.

Abstract

Dit protocol beschrijft een hoge doorverbonden colorimetrische methode die is gebaseerd op de vorming van een complex tussen jodium en ketens van glucose moleculen in zetmeel. Jodium vormt complexen met zowel amylose en lange ketens binnen amylopectine. Na de toevoeging van jodium aan een zetmeelmonster, de maximale absorptie van amylose en amylopectine optreedt bij 620 en 550 nm respectievelijk. De amylose / amylopectine verhouding kan worden geschat uit de verhouding tussen de 620 en 550 nm absorptiewaarden en ze te vergelijken met een standaard curve waarbij bepaalde bekende concentraties zijn uitgezet tegen absorptiewaarden. Deze hoge throughput, goedkope methode betrouwbaar en reproduceerbaar, waardoor de evaluatie van grote populaties van aardappel klonen.

Introduction

Ongeveer 80% van het versgewicht van een aardappel water, vrijwel alle resterende droge stof zetmeel ^1. Het merendeel van het zetmeel (70%) bestaat uit amylopectine, terwijl de rest amylose. De verhouding tussen amylose en amylopectine is de belangrijkste eigenschap die de fysische eigenschappen van zetmeel. Amylose is een lineair alfa 1-4 glucose-keten, terwijl amylopectine een lineair alfa 1-4 ketting met alpha 1-6 vertakkingen ^2. Werkwijzen zoals jodium binden, differentiële scanning calorimetrie (DSC), hoge prestatie grootte-uitsluitingschromatografie (HPSEC) en concanavaline A interacties ontwikkeld voor bepaling zetmeel in verschillende gewassoorten ^3,4. Elk protocol vereist speciale vaardigheden en apparatuur, waardoor het moeilijk te schalen talrijke monsters te kwantificeren tegelijk. De methode die we hier presenteren is een aangepaste protocol van Hovenkamp-Hermelink et al.. ⁵ dat is een dubbele golflengte jodium bindenmethode van gekleurd zetmeelkorrels. De voordelen van deze methode versus andere amylose omvatten de bepaling van onverwerkt zetmeel zonder zuiveren en het gebruik van de dubbele golflengte systeem de nauwkeurigheid van de werkwijze ^4,6 te verhogen.

Protocol

1. Amylose Bepaling van Potato knolzetmeel

1. Schil en snijd verse knollen in kleine blokjes.
2. Plaats aardappelblokjes in kleine bruine zakken en bewaar overnacht bij -80 ° C.
3. Transfer aardappelblokjes aan nylon zakken en voor vriesdrogen.
4. Na gevriesdroogde, slijp de aardappel monster tot poeder met behulp van vijzel en stamper of een Wiley Mill.
5. In een 50 ml buis, voeg 20-30 mg van de gevriesdroogde, gemalen knol monster.
6. Bereid een oplossing van 45% (w / v) perchloorzuur (meng 24,4 ml 60% perchloorzuur en 25,6 ml ultrazuiver water.
7. Voeg 500 ui 45% (w / v) perchloorzuur en schudden of swirl aan zetmeelkorrels dispergeren.
8. Na vier minuten incubatieperiode bij kamertemperatuur, voeg 16 ml ultrazuiver water aan de oplossing en door vortexen gemengd.
9. Na onoplosbare materiaal afgerekend naar de bodem van de buis (7-10 min later), overdracht 40 ul van de oplossing van een microtiterplaat (het vermijden van het pipetteren van deeltjes).
10. Voeg 50 ul van jodium-oplossing (2 g KI + 1 g I ₂ in 900 ml ultrapuur water) en meng het monster door pipetteren.
11. Lees de absorptie bij 550 nm en 620 nm onmiddellijk.
12. Bepaal het percentage amylose een vergelijking van de amylose / amylopectine verhouding van elk monster (620 nm/550 nm absorptie) met een standaardcurve gegenereerd uit amylose en amylopectine oplossingen bij verschillende concentraties. Deze procedure zal vervolgens worden beschreven. Lees de blanco (joodoplossing en perchloorzuur) samen met de proefmonsters. Gebruik gewist gegevens voor de analyses.

2. Amylose / amylopectine Curve

1. In afzonderlijke buizen weegt 12,5 mg van amylose en 12,5 mg van amylopectine.
2. Aan elke buis 5 ml 45% (w / v) perchloorzuur en volledig zijn opgelost.
3. Voor elk van de oplossingen (amylose en amylopectine), breng op een eindvolume van 50 ml met ultrazuiver water.
4. Meng 6.25ml amylose voorraad van de vorige stap met 18,75 ml ultrapuur water. Dit zal een 6,25 mg / ml amylose oplossing.
5. Herhaal de procedure voor de amylopectine-oplossing.
6. De amylose en amylopectine standaardoplossingen van stap 2.4 en 2.5, bereid het percentage amylose normen 0-100% amylose (100-0% amylopectine) tot een eindvolume van 5 ml van de standaard curve 10% intervallen te creëren.
   Bijvoorbeeld, voor te bereiden:
   De 0% amylose / amylopectine 100% standaard Pipetteer 5 ml amylopectine-oplossing.
   De 10% amylose / 90% amylopectine standaard combineren 0,5 ml 4,5 ml amylose en amylopectine oplossingen.
   De 20% amylose / 80% amylopectine standaard combineren 1,0 ml 4,0 ml amylose en amylopectine oplossingen.
   De 30% amylose / 70% amylopectine standaard combineren 1,5 ml 3,5 ml amylose en amylopectine oplossingen.
   De 40% amylose / 60% amylopectine standaard combineren 2,0 ml 2,0 ml amylose en amylopectine oplossingen.
   De 50% amylose/ 50% amylopectine standaard combineren 2,5 ml 2,5 ml amylose en amylopectine oplossingen.
   De 60% amylose / 40% amylopectine standaard combineren 3,0 ml 2,0 ml amylose en amylopectine, enzovoort).
7. Transfer 40 pi van elke standaard mengsel in een microtiterplaat. Voeg een put met 40 pl 45% (w / v) perchloorzuur als blanco.
8. Voeg 50 ul joodoplossing (2 g KI + 1 g I ₂ in 900 ml ultrazuiver water) en meng elk monster (inclusief de blanco) door pipetteren.
9. Lees absorptie bij 550 nm en 620 nm onmiddellijk en bereken de amylose / amylopectine verhouding voor elke concentratie.

Representative Results

De standaardkromme geconstrueerd uit gestanst gegevens van verschillende amylose / amylopectine concentratie oplossingen toont bij benadering absorptie verhoudingen variërend 0,7-1,6 (tabel 1). Een lineaire regressie trendlijn van deze data wordt later gebruikt voor het afleiden van amylose-gehalte in gevriesdroogde aardappel monsters (Figuur 1).

De plantaardige productie-omgeving heeft een aantal gevolgen voor de amylose-gehalte in de aardappelknol ^7. Gerepliceerd zetmeelgehalte bepalingen in twee apart veld locaties toonden lage variatie tussen aardappelknollen (tabel 2). Pigmenten in gekleurde vlees aardappelen lijken niet de amylose vastberadenheid test beïnvloeden.

% Amylose oplossing 1	550 nm extinctie	620 nm extinctie	Verhouding 2 620 nm/550 nm
0	0.223	0.156	0.700
10	0.225	0.181	0.804
20	0.221	0.203	0.919
30	0.220	0.219	0.995
40	0.223	0.246	1.103
60	0.216	0.280	1.296
70	0.231	0.319	1.381
90	0.225	0.347	1.542
100	0.219	0.357	1.630

Tabel 1. Relatie tussen amylose concentratie en absorptieverhouding (620 nm/550 nm). Extinctieverhouding versus procent amylose is uitgezet in figuur 1 </ Strong> voor amylose bepaling ^1. Percentage amylose oplossing bereid van amylose en amylopectine voorraadoplossingen in verschillende concentraties ^2. Berekend verhouding van gewiste gegevens absorptie bij 620 nm en 550 nm.

Cultivar	Loc	550 nm	620 nm	Verhouding	Amylose%
Adirondack Blue	1	1.86	1.78	0.955	25.5
	2	2.28	2.15	0.946	24.4
Vroeg Rose	1	2.17	2.12	0.977	27.8
	2	2.22	2.14	0.967	26.7
FreEdom Roodbruine	1	1.99	1,92	0.965	26.5
	2	1,98	1.93	0.973	27.4
Inca Gold	1	1.95	2,00	1.021	32.6
	2	2.27	2.28	1.004	30.7
Ranger Roodbruine	1	1,88	1.84	0.975	27.6
	2	2.15	2.08	0.967	26.7
Roodbruine Norkotah	1	1.84	1.79	0.972	27.3
	2	1.90	1.86	0.975	27.6
Snowden	1	2.23	2.13	0.956	25.5
	2	1,64	1,61	0.979	28.0
White Pearl	1	2,32	2.28	0.986	28.7
	2	2.22	2.18	0.983	28.5

Tabel 2. Gerepliceerd evaluatie van amylose-gehalte in aardappelrassen uit twee verschillende veld productielocaties (Loc).

Figuur 1. Amylose concentratie standaard curve gebruikt om amylose gehalte in procent in aardappelknollen afleiden.

Discussion

Zetmeelgehalte in aardappelknollen varieert doorgaans 20-35% ^7,8. Als de meeste waarden buiten dit bereik, deze mogelijke fouten: 1) ruwe gegevens werden gebruikt in plaats van blanked gegevens voor de bouw van de amylose / amylopectine standaard curve 2) ruwe gegevens werden gebruikt in plaats van blanked gegevens voor de bepaling van de amylose / amylopectine-verhoudingen van de aardappel monsters, of 3) het water dat wordt gebruikt voor de analyse was niet zuiver genoeg. We hebben gemerkt dat met gedestilleerd water en niet ultrazuiver water in de analyse, de verkregen waarden waren niet reproduceerbaar. Een gemakkelijke manier om te controleren of de jodium oplossing goed is voorbereid of als het nog te oud om te worden gebruikt is om te controleren of de onbewerkte extinctie van de blanco monster bij 550 nm is ongeveer 0,1.

Precisie bij de voorbereiding van de jodium en de amylopectine / amylose oplossingen is cruciaal voor het verkrijgen van betrouwbare amylose bepalingen. Aangezien we het bepalen van het aandeel van amyinhoud in plaats van het exacte bedrag van amylose in de aardappelzetmeel verliest, is er geen zuiveringsstap voor de isolatie van zuivere zetmeel uit de aardappel poeder zoals gepresenteerd door andere bepalingsmethoden.

Voor de bepaling van het amylosegehalte van aardappel cultivars werden twee onafhankelijke gevriesdroogd knollen van elke cultivar verwerkt welk gebied. We vonden dat de variatie voor amylose inhoud tussen de aardappelknollen was klein (minder dan een procentpunt) en niet significant.

Er was geen verschil in het amylosegehalte vaststelling door de oorspronkelijke hoeveelheid aardappelzetmeel, tussen 20-30 mg. Buiten dit bereik, de resultaten werden onbetrouwbaar of niet op te sporen door onze plaat lezer. Ook al Hovenkamp-Hermelink et al.. ⁵ suggereren het toevoegen van een volume water als het monster te geconcentreerd is, adviseren wij een nieuwe weging van de steekproef en de procedure te herhalen.

Deze studie presegen gegevens op basis van wit vruchtvlees aardappelen. Daarnaast hebben we deze methode geëvalueerd met gekleurde vruchtvlees aardappelen (geel, rood en paars). Geen interferentie met de jodium / amylose complex werd ontdekt. Zoals met jodium bindingstest, het percentage amylose waarschijnlijk enigszins overschat door de binding van jodium rechte ketens in de amylopectine moleculen. Deze test is bedoeld voor het screenen van grote aantallen monsters. Zodra amyloserijke personen bekend worden, raden wij hertesten met een amylose-specifieke test, zoals concanavaline A ^9,10. Deze test is duurder en arbeidsintensiever dan de jodium bindingstest, maar nauwkeuriger bepaalt amylose niveaus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Amylose	Sigma	859656
Amylopectin	Sigma	A8515
Perchloric Acid 60%	Sigma	311413	Very hazardous to skin and eyes
Iodine	Sigma	23214TD
Potassium iodide	Sigma	08625JE
Equipment
Plate Reader	Bio Tek	ELx800