Summary
Detta protokoll beskriver en hög genom sätta kolorimetrisk metod som bygger på bildandet av ett komplex mellan jod och kedjor av glukosmolekyler i stärkelse. Jod bildar komplex med både amylos och långa kedjor inom amylopektin. Efter tillsats av jod till en stärkelseprovet, maximal absorption av amylos och amylopektin inträffar vid 620 och 550 nm, respektive. Den amylos / amylopektin-förhållandet kan beräknas från förhållandet mellan 620 och 550 nm absorptionsvärden och jämföra dem med en standardkurva som specifika kända koncentrationer plottas mot absorptionsvärden. Denna höga kapacitet, är billig metod tillförlitlig och reproducerbar, vilket gör att utvärderingen av stora populationer av potatiskloner.
Abstract
Detta protokoll beskriver en hög genom sätta kolorimetrisk metod som bygger på bildandet av ett komplex mellan jod och kedjor av glukosmolekyler i stärkelse. Jod bildar komplex med både amylos och långa kedjor inom amylopektin. Efter tillsats av jod till en stärkelseprovet, maximal absorption av amylos och amylopektin inträffar vid 620 och 550 nm, respektive. Den amylos / amylopektin-förhållandet kan beräknas från förhållandet mellan 620 och 550 nm absorptionsvärden och jämföra dem med en standardkurva som specifika kända koncentrationer plottas mot absorptionsvärden. Denna höga kapacitet, är billig metod tillförlitlig och reproducerbar, vilket gör att utvärderingen av stora populationer av potatiskloner.
Introduction
Ungefär 80% av den färska vikten för en potatisknöl är vatten; nästan alla av de återstående torrsubstans är stärkelse 1. Merparten av stärkelse (70%) består av amylopektin, medan återstoden är amylos. Förhållandet mellan amylos och amylopektin är den viktigaste egenskapen att påverka de fysikaliska egenskaperna hos stärkelse. Amylos är en linjär alfa 1-4 glukoskedja, medan amylopektin är en linjär alfa 1-4 kedja med alfa 1-6 grenar 2. Metoder som jod bindning, differentiell (DSC), högpresterande storleksuteslutningskromatografi (HPSEC) och concanavalin A interaktioner har utvecklats för stärkelsebestämning i olika grödor 3,4. Varje protokoll kräver speciella färdigheter och utrustning, vilket gör det svårt att skala upp för att kvantifiera många prover på en gång. Den metod som vi presenterar här är ett modifierat protokoll från Hovenkamp-Hermelink et al. 5 som är en dubbel våglängd jodbindandemetod baserad på färgade stärkelsekornen. Fördelarna med denna metod jämfört med andra inkluderar amylos bestämning av obehandlad stärkelse utan att rena den och användning av den dubbla våglängdssystemet för att öka precisionen av metoden 4,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Amylos Fastställande från potatisknölen Stärkelse
- Skala och skär färska knölar i små tärningar.
- Placera potatistärningar i små bruna påsar och förvaras över natten vid -80 ° C.
- Överför potatistärningar till nylonpåsar och för frystorkning.
- Efter frystorkades, slipa potatisprov till pulver med användning av mortel och mortelstöt eller en Wiley-kvarn.
- I ett 50 ml rör, tillsätt 20 till 30 mg frystorkat, prov botten knöl.
- Bered en lösning av 45% (vikt / volym) perklorsyra (blanda 24,4 ml 60%-ig perklorsyra och 25,6 ml av ultrarent vatten.
- Addera 500 pl av 45% (vikt / volym) perklorsyra och skaka eller snurra den för dispergering stärkelsegranuler.
- Efter en fyra-minuters inkubation vid rumstemperatur, tillsätt 16 ml ultrarent vatten till lösningen och blanda genom att vortexa.
- Efter icke-lösliga materialet har sjunkit till botten av röret (7 till 10 min senare), överför 40 | il av lösningen till en mikrotiter-platta (undvika pipettering av några partiklar).
- Tillsätt 50 | il jodlösning (2 g Kl + 1 g I2 i 900 ml ultrarent vatten) och blanda provet genom pipettering.
- Läs av absorbansen vid 550 nm och 620 nm omedelbart.
- Bestäm amylos procentsats efter jämföra amylos / amylopektin-förhållandet av varje prov (620 nm/550 nm absorbans) med en standardkurva som genereras från amylos och amylopektin-lösningar vid ett intervall av koncentrationer. Detta förfarande kommer att beskrivas härnäst. Läs blind (jodlösning och perklorsyra) tillsammans med testproverna. Använd blankas uppgifter för analyserna.
2. Amylos / amylopektin Curve
- I separata rör väger 12,5 mg av amylos och 12,5 mg av amylopektin.
- Lägg till varje rör 5 ml av 45% (vikt / volym) perklorsyra och lös upp den helt.
- För var och en av lösningarna (amylos och amylopektin), bringa till en slutvolym av 50 ml med ultrarent vatten.
- Blanda 6,25ml av amylos lager från föregående steg med 18,75 ml ultrarent vatten. Detta kommer att göra en 6,25 mg / ml amylos lösning.
- Upprepa proceduren för amylopektin lösningen.
- Med användning av amylos och amylopektin standardlösningar från steg 2,4 och 2,5, förbereda de procentuella amylos-standard, som är 0-100% amylos (100-0% amylopektin) till en slutlig volym av 5 ml för att skapa standardkurvan i 10% intervaller.
Till exempel, för att förbereda:
Den 0% amylos / 100% amylopektin standard, pipett 5 ml amylopektin lösning.
Den 10% amylos / 90% amylopektin standard, kombinera 0,5 ml amylos och 4,5 ml amylopektin lösningar.
Den 20% amylos / 80% amylopektin standard, kombinera 1,0 ml amylos och 4,0 ml amylopektin lösningar.
Den 30% amylos / 70% amylopektin standard, kombinera 1,5 ml amylos och 3,5 ml amylopektin lösningar.
Den 40% amylos / 60% amylopektin standard, kombinera 2,0 ml amylos och 2,0 ml amylopektin lösningar.
Den 50% amylos/ 50% amylopektin standard, kombinera 2,5 ml amylos och 2,5 ml amylopektin lösningar.
Den 60% amylos / 40% amylopektin standard, kombinera 3,0 ml amylos och 2,0 ml amylopektin, och så vidare). - Överför 40 ul av varje standardblandning till en mikrotiterplatta. Inkludera en brunn med 40 ^ il 45% (vikt / volym) perklorsyra som ämnet.
- Tillsätt 50 | il jodlösning (2 g Kl + 1 g I2 i 900 ml ultrarent vatten) och blanda varje prov (inklusive blank) genom pipettering.
- Läs absorbanser vid 550 nm och 620 nm omedelbart och beräkna amylos / amylopektin-förhållandet för varje koncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den standardkurva konstrueras från släckta data av olika amylos / amylopektin koncentrations lösningar visar ungefärliga absorbansenheter förhållanden som sträcker sig från 0,7 till 1,6 (se tabell 1). En linjär regressionstrendlinje från dessa data senare används för att dra slutsatsen amylosinnehåll i frystorkade potatisprover (Figur 1).
Produktionsanläggningen miljö har viss effekt på halten amylos i potatisknölen 7. Replike amylos innehållsbestämningar två olika fältplatser uppvisade låg variation bland potatisknölar (tabell 2). Pigment i färgat kött potatis verkar inte påverka amylos beslutsamhet analysen.
| % Amylos lösning 1 | 550 nm absorbansen | 620 nm absorbans | Ratio 2 620 nm/550 nm |
| 0 | 0,223 | 0,156 | 0,700 |
| 10 | 0,225 | 0,181 | 0,804 |
| 20 | 0,221 | 0,203 | 0,919 |
| 30 | 0,220 | 0,219 | 0,995 |
| 40 | 0,223 | 0,246 | 1,103 |
| 60 | 0,216 | 0,280 | 1,296 |
| 70 | 0,231 | 0,319 | 1,381 |
| 90 | 0,225 | 0,347 | 1,542 |
| 100 | 0,219 | 0.357 | 1,630 |
Tabell 1. Förhållandet mellan amylos koncentration och absorbans-förhållande (620 nm/550 nm). Absorbansförhållande vs procent amylos plottas i figur 1 </ Strong> för amylos bestämning 1. Procentuell amylos lösning gjordes från amylos och amylopektin stamlösningar vid olika koncentrationer 2. Beräknat förhållande från släckta uppgifter absorbanser vid 620 nm och 550 nm.
| Cultivar | Loc | 550 nm | 620 nm | Ratio | Amylos% |
| Adirondack Blå | 1 | 1,86 | 1,78 | 0,955 | 25,5 |
| 2 | 2,28 | 2,15 | 0,946 | 24,4 | |
| Early Rose | 1 | 2,17 | 2,12 | 0,977 | 27,8 |
| 2 | 2,22 | 2,14 | 0,967 | 26,7 | |
| FreEdom Russet | 1 | 1,99 | 1,92 | 0,965 | 26,5 |
| 2 | 1,98 | 1,93 | 0,973 | 27,4 | |
| Inca Gold | 1 | 1,95 | 2,00 | 1,021 | 32,6 |
| 2 | 2,27 | 2,28 | 1,004 | 30,7 | |
| Ranger Russet | 1 | 1,88 | 1,84 | 0,975 | 27,6 |
| 2 | 2,15 | 2,08 | 0,967 | 26,7 | |
| Russet Norkotah | 1 | 1,84 | 1,79 | 0,972 | 27,3 |
| 2 | 1,90 | 1,86 | 0,975 | 27,6 | |
| Snowden | 1 | 2,23 | 2,13 | 0,956 | 25,5 |
| 2 | 1,64 | 1,61 | 0,979 | 28,0 | |
| White Pearl | 1 | 2,32 | 2,28 | 0,986 | 28,7 |
| 2 | 2,22 | 2,18 | 0,983 | 28,5 |
Tabell 2. Replike utvärdering av amylos innehåll i potatissorter från två olika fält produktionsplatser (LOC).
Figur 1. Amylose koncentrationsstandardkurva används för att dra slutsatser om innehåll procent amylos i potatisknölar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Amylosinnehåll i potatisknölar varierar normalt 20-35% 7,8. Om de flesta värden utanför detta område, anser att dessa möjliga fel: 1) rådata användes istället för släckta uppgifter för byggandet av amylos / amylopektin standardkurva, 2) rådata användes istället för släckta uppgifter för fastställandet av amylos / amylopektin nyckeltal från potatisprover, eller 3) det vatten som används för analysen var inte ren nog. Vi har upptäckt att genom att använda destillerat vatten och inte ultra-rent vatten i analysen, de värden som erhölls inte var reproducerbara. Ett enkelt sätt att kontrollera att jodlösningen bereds på rätt sätt eller om det fortfarande är för gammal för att användas är att kontrollera om den råa absorbansvärdet för blankprov vid 550 nm är ca 0,1.
Precision i beredningen av jod och amylopektin / amylos lösningar är avgörande för att få tillförlitliga amylos bestämningar. Eftersom vi bestämma hur stor andel av amyförlora innehåll snarare än den exakta mängden amylos i potatisstärkelse, det finns ingen reningssteg för isolering av ren stärkelse från potatis pulver som presenteras av andra bestämningsmetoder.
För bestämning av halten amylos i potatissorter, har två oberoende frysa torkade knölar från varje sort behandlas vid varje ort. Vi fann att variationen för amylosinnehåll mellan potatisknölar var liten (mindre än en procentenhet) och inte signifikant.
Det fanns ingen skillnad i amyloshalten beslutsamhet på grund av den ursprungliga mängden av potatisstärkelse, mellan 20-30 mg. Utanför detta område, blev resultaten opålitliga eller påvisas med vår plattläsare. Även om Hovenkamp-Hermelink et al. 5 föreslår att lägga till en vattenvolym om provet alltför koncentrerad, rekommenderar vi omvägning provet och upprepa proceduren.
Denna studie preseNTS data baserat på vitt fleshed potatis. Dessutom har vi utvärderat denna metod med färgade kött potatis (gul, röd och lila). Ingen interferens med jod / amylos komplex upptäcktes. Emellertid, som med alla jod-bindningsanalys, kommer sannolikt att överskattas något på grund av bindningen av jod till raka kedjor i amylopektinmolekyler andelen amylos. Detta test är avsett för screening av ett stort antal prover. När amylosrik individer identifieras, rekommenderar vi åter testa med en amylos specifik analys, till exempel concanavalin A 9,10. Denna analys är dyrare och arbetsintensiv än jod-bindningsanalysen, men det mer exakt bestämmer amylos nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Finansieringen för denna forskning gs i del av USDA-ARS Research Associate Program och USDA Beskär arvsmassa kommittén.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Amylose | Sigma | 859656 | |
| Amylopectin | Sigma | A8515 | |
| Perchloric Acid 60% | Sigma | 311413 | Very hazardous to skin and eyes |
| Iodine | Sigma | 23214TD | |
| Potassium iodide | Sigma | 08625JE | |
| Equipment | |||
| Plate Reader | Bio Tek | ELx800 | |
References
- Composition Hoover, R. molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review. Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).
- Bertoft, E., Blennow, A. Structure of Potato Starch. Advances in Potato Chemistry and Technology. , 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).
- Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds. Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).
- Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique. Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).
- Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato. Potato Res. 31, 241-246 (1988).
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. Starch. , 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).
- Haase, N. U., Plate, J. Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors. Stärke. 48 (5), 167-171 (1996).
- Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules. Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).
- Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A. J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).
- Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A. Starch. 42, 302-305 (1990).
