Summary
Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в крови. Нейтрофилы обладают транскрипционно регулируется функций, таких как производство провоспалительных цитокинов и торможению апоптоза. Эти функции могут быть изучены с методом, представленные здесь, которые позволяют обнаружения и количественного ядерного фактора методом проточной цитометрии в изолированных ядрах
Abstract
Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в периферической крови. Эти клетки являются первыми появляются на участках воспаления и инфекции, став таким образом первой линией обороны против вторжения микроорганизмов. Нейтрофилы обладают важными антимикробной функции, такие как фагоцитоз, высвобождение литических ферментов, продукцию активных форм кислорода. В дополнение к этим важным функциям защиты, нейтрофилы выполнять другие задачи, в ответ на инфекцию, таких как производство провоспалительных цитокинов и торможению апоптоза. Цитокины привлечь другие лейкоциты, которые помогают очистить инфекции, и ингибирование апоптоза нейтрофилов позволяет жить дольше на месте инфекции. Эти функции регулируются на уровне транскрипции. Однако, так как нейтрофилы являются короткоживущими клетки, исследование транскрипционно регулируется ответы в этих клетках не может быть выполнено с традиционными методами генной репортер так как нет эффективностиcient методы нейтрофилов трансфекции. Здесь мы представляем простой и эффективный метод, который позволяет обнаружения и количественного ядерного фактора в изолированных и immunolabeled ядер методом проточной цитометрии. Мы описываем методы, чтобы изолировать чистую нейтрофилов периферической крови человека, стимулируют эти клетки с анти-антител к рецептору, изолировать и immunolabel ядер, ядер и анализа методом проточной цитометрии. Этот метод был успешно использован для обнаружения NF-kB и Elk-1 ядерных факторов в ядрах из нейтрофилов и других типов клеток. Таким образом, этот метод представляет собой вариант для анализа активации транскрипционных факторов в изолированных ядрах из различных типов клеток.
Introduction
Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в периферической крови 1. Во время воспаления и инфекции нейтрофилы являются первыми клетками появляются на пораженные места, где они выступают в качестве первой линии обороны 2. Нейтрофилы обладают антимикробным несколько механизмов 3, включая фагоцитоз, продукцию активных форм кислорода, выделение литических ферментов дегрануляцию и производство провоспалительных цитокинов 4,5. Нейтрофилы являются недолговечными клеток, которые получают быстро активировать с помощью сигналов от различных рецепторов клеточной поверхности. Несмотря на то, нейтрофилы были рассмотрены терминала клеток из-за их короткой жизни, а потому, что они подвергаются апоптозу, если активированы во время воспалительного процесса 6, уже сейчас ясно, что они также могут изменить свой фенотип, изменяя уровень транскрипции определенных генов. Продукции цитокинов 5 и ингибирование апоптоза 7,8 две яmportant-зависимой активации функции клеток регулируется на уровне транскрипции в нейтрофилах. Ядерный фактор кВ (NF-kB) участвует в транскрипционным контролем цитокинов 4 производственных и в регулировании выживания клеток и апоптоз 9-11 в различных типах клеток.
Сигнальных путей, которые ведут к ядерному активация фактора, как правило, изучаются анализы гена-репортера или сдвига электрофоретической подвижности анализы (EMSA). Однако, так как нейтрофилы являются короткоживущими клетки, исследование транскрипционно регулируется ответы в этих клетках не может быть выполнена с анализа гена-репортера, поскольку нет эффективных методов для нейтрофилов трансфекции. EMSA анализы были использованы в нейтрофилах, чтобы исследовать ядерный фактор активации 12,13, однако эта методология является сложной и дорогой, потому что она включает в себя использование радиоактивных материалов. Nucleofection является еще одним методом, который был использован successfuLLY для трансфекции моноциты 14. Таким образом, по крайней мере в теории, ядерной активация фактора могут быть обнаружены в нейтрофилах путем трансфекции (несмотря на низкую эффективность). Однако, этот метод был бы более дорогим, отнимающим много времени и, вероятно, менее количественные. Микроскопический анализ иммуноокрашиванию клетки могут быть также использованы для обнаружения ядерных факторов в ядре. Действительно, мы обнаружили NF-kB транслокации в ядро таким образом 15. К сожалению, этот метод также времени, меньше количественных и с учетом смещения наблюдателя.
Здесь мы представляем простой и эффективный метод, который позволяет обнаружения и количественного ядерного фактора в изолированных и immunolabeled ядер методом проточной цитометрии. Мы описываем методы, чтобы изолировать нейтрофилов периферической крови человека, стимулируют эти клетки через интегрины или Fc рецепторов с анти-антител к рецептору, изолировать и immunolabel ядер, ядер и анализ с помощью проточной цитометрии (Figure 1). Этот метод был успешно использован для обнаружения NF-kB 15 и Elk-1 16 ядерных факторов нейтрофилов ядер. Чувствительность этого метода позволяет обнаруживать небольшие изменения в ядерных уровней фактора в ядре. Этот метод также может быть использован для анализа уровня факторов транскрипции в ядрах от других типов клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение нейтрофилов (ПМН) из крови человека
- Используйте около 20 мл крови человека с гепарином (10 ЕД / мл) в качестве антикоагулянта. Кровь была собрана из взрослых здоровых добровольцев venopuncture. Все эксперименты проводились при утверждении комитета по биоэтике при институте де-следственной Biomédicas - UNAM.
- Поместите 2 мл 6% декстрана T500 в PBS в 15 мл коническую трубку центрифуги и добавить 10 мл крови. Смешать путем обращения трубки два или три раза и оставьте на 45 мин, чтобы обеспечить оседание эритроцитов.
- В свежем 15 мл коническую трубку центрифуги поставить 5 мл Ficoll-Paque.
- Возьмите лейкоцитов плазмы, обогащенной что образуется над осаждаются эритроциты, и осторожно пипеткой его на верхней части Ficoll-Paque формирования второго слоя. Убедитесь в два этапа.
- Центрифуга при 516 х г в течение 20 мин при 4 ° C. После центрифугирования на межфазной плазмы и Ficoll-Paque есть слой мононуклеаров. Небраскаutrophils находятся в нижней части трубки.
- Ликвидация супернатанта, разбить осадок клеток, нажав на трубке против стойку, и ресуспендирования клеток путем добавления 10 мл холодного (4 ° С) PBS. Примечание: ресуспендирования клеток с помощью пипетки вверх и вниз не рекомендуется, поскольку это слишком повреждения в клетках.
- Передача клеточной суспензии в 50 мл коническую трубку центрифуги и центрифугируют при 290 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
- Перерыв осадок клеток как раньше, и добавляют 10 мл холодного (4 ° C) гипотонический раствор (0,2% NaCl, 1% БСА, 20 мМ Hepes, рН = 7,4) для лизиса эритроцитов. Смешать по закрученной трубки аккуратно от руки ровно на одну минуту.
- Добавить 10 мл холодного (4 ° C), гипертонический раствор (1,6% NaCl, 1% БСА, 20 мМ HEPES, рН = 7,4), перемешать и подсчета клеток с использованием гемоцитометр (обычно> 95% ПМН).
Примечание: Держите трубку с клеточной суспензии на льду при подсчете клеток. - Центрифуга, как и прежде ресуспендируют PMN в 107 клеток / мл в холодном (4 ° С) PBS. Держите на льду.
Примечание: нейтрофилы остаются жизнеспособными и функциональной при 4 ° С в течение приблизительно от 6 до 8 часов.
2. Активация PMN
- Положите 100 мкл суспензии PMN (1 х 10 7 клеток / мл) в 1,5 мл трубки Эппендорф.
Примечание: Образец трубы должно быть сделано по крайней мере, в двух экземплярах. Обычные отрицательного контроля должна включать в себя первое антитело только, и только вторичным антителом. - Добавить соответствующие анти-интегрин или анти-Fc рецептор моноклональных антител (МКА) в концентрации 10 мкг / мл и инкубировали на льду в течение 15 мин.
- Вымойте PMN путем добавления 1 мл холодного (4 ° С) PBS, центрифугирования при 1743 х г (4.500 оборотов в минуту) в микроцентрифуге и аспирационных супернатант.
- Перерыв осадок клеток, нажав в нижней части трубки от стойки, добавить 1 мл холодного PBS, и мыть два раза, как и в предыдущем шаге.
Примечание: Эти моет удаления несвязанного антитела. - Ресуспендируют PMN в том же (вitial) объем теплой (37 ° C) PBS, содержащей 60 мкг / мл F (аb ') 2 антимышиного IgG.
Примечание: вторичные анти-мышиных IgG антитела будут связываться с первым анти-рецептор антител и приведет к сшиванию рецепторов. - Инкубировать при 37 ° С в течение от 1 до 20 мин, в зависимости от ядерного фактора интереса. Для NF-kB обычно 15 минут, а для Elk-1 обычно 5 мин.
Примечание: инкубации клеток при 37 ° C индуцирует рецепторов сшивания, которая не может иметь место при 4 ° C. - Добавить 1 мл холодного PBS и центрифугируют 3 мин при 1743 мкг в микроцентрифуге.
- Удалить супернатант
- Замораживание ПМН сразу в dry-ice/ethanol ванну и держать их там в течение 10 мин.
3. Выделение и фиксация ядер
- Ресуспендируют замороженных PMN осадок в 100 мкл холодного (4 ° C) гипотонического буфера (10 мМ HEPES, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2, и 1 мМ недавно на добавленную DL-дитиотреитол [DTT], РН = 7,9). Рекомендуется принять труб из dry-ice/ethanol ванну один за другим, и протирайте дно пробирки перед добавлением гипотонического буфера.
- Место на льду, и проверьте целостность ядра путем окрашивания аликвоты ядер подвеска с трипановым синим. Ядрами оглянуться и синий. Неповрежденном PMN не получить загрязнена, и остатки клеток выглядит как синяя частиц неправильной формы.
Примечание: Если ядрами суспензии содержит много неповрежденных клетках или мусор, то лучше отказаться от подготовки и повторить процедуру с другим образцом. - Центрифуга ядер при 775 мкг (3.000 оборотов в минуту) в микроцентрифуге в течение 10 мин в холодной комнате. В этот момент ядра очень хрупкие и дополнительный уход должны быть приняты в соответствии образцы холодного и не центрифугирования при чрезмерной силы.
- Удалить супернатант очень осторожно пипеткой.
- Добавить 100 мкл холодного 4% параформальдегидом в PBS, чтобы исправить ядер.
Примечание: осадок очень рыхлыйD добавления буфера достаточно, чтобы ресуспендируйте ядер. Пипетки вверх и вниз следует избегать. - Инкубировать на льду в течение 20 мин.
- Immunolabel ядер для проточной цитометрии или держать их в течение 24 ч при 4 ° C.
4. Ядрами для иммунного анализа потока цитометрии
- Центрифуга ядер на 1743 XG (4.500 оборотов в минуту) в микроцентрифуге в течение 1 мин, и удалите супернатант очень осторожным пипетированием.
- Добавить 100 мкл холодного (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% параформальдегидом в PBS в permeabilize ядер. Инкубировать на льду в течение 10 мин.
- Центрифуга пермеабилизованной ядер при 1743 мкг в микроцентрифуге и осторожно удалите супернатант. В этот момент ядра гранулы не придаем также в нижней части трубы. Рекомендуется к центрифуге снова, если осадок получает свободный.
- Ресуспендируют ядер в 500 мкл холодного 4% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в PBS, чтобы блокировать неспецифические сайты связывания, и инкубировать на льду в течение 20 мин. Центрифугироватьядер при 1743 х г в течение 3 мин в микроцентрифуге и осторожно удалите супернатант.
- Ресуспендируют ядер в 100 мкл холодного PBS, содержащем 4% FBS и 2,5 мкг / мл мАт против ядерного фактора интереса. Инкубировать на льду в течение 20 мин.
Примечание: Обычно отрицательного контроля должна включать в себя анти-ядерный фактор антитела только, и FITC-меченого вторичного антитела только. - Мыть два раза с 500 мкл холодного PBS с 4% FBS и центрифугирования при 1743 х г в течение 3 мин.
- Удалить супернатант очень осторожно, ресуспендируют ядер в 100 мкл холодного PBS, содержащем 4% FBS и 10 мкг / мл соответствующего FITC-меченого вторичного антитела и инкубировали на льду в течение 20 мин.
- Вымойте ядер в два раза с 500 мкл холодного PBS с 4% FBS, как и в предыдущем шаге.
- Ресуспендируют ядер в 400 мкл холодного 4% параформальдегидом в PBS.
Примечание: ядра помещают в параформальдегид, чтобы образца будут храниться в течение нескольких дней без загрязненияпроблемы, которые могут возникнуть в присутствии сыворотки. - Анализ немедленно проточной цитометрии или хранить в темноте при 4 ° C в течение трех дней.
5. Анализ проточной цитометрии
- Анализ immunolabeled ядер в проточной цитометрии такой FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) или аналогичное устройство.
- Настройте параметры приобретения: FSC в логарифмической шкале на 10-1, SSC в логарифмической шкале в 196, и ворота ядер в дот-сюжет.
- Приобретать десять тысяч ядер в образце.
- Анализ флуоресценции FITC-окрашенных ядер через FL-1 канал (506 нм) установлены на логарифмической шкале на 400.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Способ очистки описаны здесь обычно обеспечивает нестимулированных нейтрофилов (ПМН) с чистотой более 95% (рис. 1А). Изолированные PMN может быть стимулировано путем сшивания частности рецепторов специфические моноклональные антитела. Мы стимулировали ПМН через рецепторы Fc и интегрины (рис. 1б). Как только стимулировали, ПМН лизируются и ядра изолированы с высокими выходами. Ядра затем immunolabeled для конкретного ядерного фактора, таких как ядерный фактор кВ (NF-kB), со специфическими антителами (рис. 1б).
Ядер может быть легко признана в качестве различных население от интактных нейтрофилов в проточной цитометрии с точкой-участка (рис. 2А). В отдыхает PMN базального уровня NF-kB находится в ядре клетки (рис. 2В). При стимуляции путем сшивания β1 интегринов, NF-kB транслоцируется в ядро и это ИНКРЕМ.ДАТЧИК ных в области ядерного NF-kB определяется как увеличение флуоресценции (рис. 2В). Кроме того, стимуляция PMN путем сшивания β2 интегринов также индуцируется NF-kB активации, как показано увеличение флуоресценции (рис. 2С). Чувствительность этого метода позволяет обнаруживать небольшие изменения в ядерных уровней фактора, о чем свидетельствует тот факт, что β1 интегрины, которые связывают белки внеклеточного матрикса, такие как фибронектин, индуцированных сильным NF-kB активации, чем β2 интегринов, которые связываются с молекулами адгезии на другие клетки (ср. рис 2Б и 2В).
Этот метод также успешно использоваться для обнаружения NF-15 и Elk-1 16 ядерных факторов в изолированных ядрах после Fc рецепторов стимуляции ПМН. Этот метод является простым и экономичным, поэтому он может быть легко модифицирована для анализа ядерных факторов в другие типы клеток.
Содержание «FO: Keep-together.within-страницы =" Всегда ">
Рисунок 1. Схематическое изображение нейтрофилов (ПМН), очистки от крови, стимуляции клеток, выделение ядер и иммунного ядерного фактора в изолированных ядрах.) Гепарин обработанной крови смешивают с декстран, чтобы склеивать эритроциты. После осадка эритроцитов, лейкоцитов, плазмы, обогащенной находится на вершине эритроцитов. Это лейкоцитов плазмы, обогащенной передается и на верхнем уровне Ficoll-Paque в другую трубу. После центрифугирования слой мононуклеарных клеток (МНК) находится на межфазной плазмы и Ficoll-Paque. PMN находятся в нижней части трубы. B) Изолированные PMN стимулируется путем сшивания клеточной мембраны рецепторов специфических моноклональных антител (МКА) (оранжевый) и вторичные антитела (темно-зеленый). Ядерного фактора каппа В (NF-kB) отделяет от своего IκB ингибитора и транслоцируется в ядро. Ядра выделяли, проницаемость и immunolabeled против NF-kB или другого ядерного фактора с конкретным МАБ (желтый) и FITC-меченого вторичного антитела (светло-зеленый). Исправлена ядер анализировали с помощью проточной цитометрии (FACS). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Анализ NF-kB активация нейтрофилов (ПМН).) Неповрежденном ПМН (левая панель) или изолированных ядер (справа) выступают в качестве двух различных популяций в проточной цитометрии точка-сюжет графики. Клеток и ядер могут быть проанализированы независимо друг от другасоздание различных ворот, R1 (красный) для интактных клеток, и R2 (синий) для изолированных ядер. B и C) ядра изолированы от PMN были immunolabeled для NF-kB (p50 субъединицы), до (зеленый пунктир), или после клетки были активированы путем сшивания β1 интегрина (B) с конкретными моноклональных антител TS2/16 (синяя линия), или β2 интегринов (C) с конкретными моноклональных антител IB4 (красная линия). Серая зона является базисной флуоресценции FITC-меченого вторичного антитела в одиночку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Очистка метод, описанный здесь позволяет изоляции нестимулированных нейтрофилов (ПМН) с чистотой более 95% (оценка микроскопических наблюдений), в течение короткого времени. Иногда нейтрофилы могут быть загрязнены эритроцитов, если последний не лизируются полностью. Это обычно не влияет на технику, так как эритроциты и ПМН можно легко отличить в отличие популяции клеток с помощью проточной цитометрии. Изолированные PMN может быть стимулировано путем сшивания частности рецепторов специфические моноклональные антитела. В самом деле, ПМН можно стимулировать с помощью фармакологических средств или адгезия к различным субстратам или других клеток. Метод, представленный здесь, могут быть использованы для анализа сигнальных путей, которые приводят к изменению ядерного фактора в PMN ядер после клетки активируются практически любые соответствующие биологические стимулы.
После PMN стимулируются, метод, описанный в этой статье позволяет быстро и efficiЛОР очистки ядер и для обнаружения, в этих ядрах NF-kB с помощью иммунофлуоресценции и анализа проточной цитометрии. После PMN стимуляции определенных рецепторов, NF-kB в цитоплазме освобождается от его ингибитора IκB, а затем traslocated в ядро (рис. 1б). Таким образом, уровень NF-kB активации определяется количеством NF-kB в ядре. Поскольку этот метод может обнаружить и измерить количество NF-kB в ядре, он может легко определить, активация этого ядерного фактора. Этот метод может аналогичным образом обнаружить активацию других ядерных факторов, когда их активация связана с изменениями в ядерном уровне. Активация изменения ядерного фактора может быть связано с изменениями в размере фактор присутствует в ядре, как это имеет место для NF-kB, или изменения, такие как фосфорилирование, в молекулярной структуре фактор, как это имеет место для Elk-1. Этот метод может быть использован для обнаружения сHanges ядерных уровней любой молекулы, для которых специфические антитела доступно.
Этот метод дает чистую популяцию ядер в простой и быстрый способ. Клетки замораживают и лизировали в гипотонического буфера, который лопнул открытые клетки и оставляет нетронутыми ядер. Неповрежденном PMN или изолированных ядер обычно появляются как две различные популяции в проточной цитометрии точка-сюжет графики. Клеток и ядер могут быть проанализированы независимо друг от друга, создавая различные ворота нетронутыми клетки, и для изолированных ядер. В нетронутыми кюветы ворот создается в районе, где большинство клеток появляются. Кроме того, с ядрами образца ворот создается в районе, где большинство ядер появляются. Обычно эти ворота находятся в разных местах штрих-участка графика. Частицы, которые иногда обнаружить из этих ворот, как правило, клетки или ядра мусора, и они исключены из анализа. Если клетки и ядра ворота перекрывают друг друга, это обычно означает, что ядра препарат не CLE. Анализ этих ядер препарат не является надежным, а лучше повторить процедуру с недавно сделанными буферов.
Этот метод был разработан для работы с человеческими PMN, но она также успешно применяется в различных клеточных линиях лейкоцитов происхождения 15. Этот метод может быть легко адаптирована для изоляции ядер от различных типов клеток. Очень важно начать процедуру с минимальными 1 х 10 6 клеток, чтобы получить достаточное ядер для эффективного анализа проточной цитометрии. Если небольшое количество ядер, полученных в конце, то лучше начать регулярно метод с 3 х 10 6 клеток.
Во время лизиса шаг, замороженных клеток не должна таять. Это приводит к низкой урожайности из-за ячейки деградации. Таким образом, рекомендуется принимать по одной трубки на время из dry-ice/ethanol ванны для лизиса клеток. Кроме того, важно, чтобы протирайте снаружи трубки перед добавлением гипотонического лизисабуфера. Если этого не сделать, то буферов иногда замерзает в трубе, давая неэффективной лизис клеток и в результате ядер препараты, которые загрязнены неповрежденных клетках. Тем не менее, это не является серьезной проблемой, учитывая, что в большинстве случаев неповрежденные клетки и ядра могут быть разделены с помощью проточной цитометрии.
Поскольку ядра очень хрупкие, прежде чем они зафиксированы, важно, чтобы все буферных растворов холодным при 4 ° С, сохраняя их в лед. После центрифугирования ядра гранулы, иногда свободно в нижней части трубки, так что особой осторожностью следует принимать при снятии супернатант. Это лучше сделать с помощью микропипетки, чем с вакуум-аспирации. В отдельных случаях, труба может быть снова центрифугируют, но рекомендуется силы центрифугирования не должна быть чрезмерной, поскольку это может привести к повреждению ядер.
Метод обнаружены NF-kB активации с помощью антител, специфичных к p50 субъединицы (рис. 2), и ALSO p65 субъединицы 15 настоящего ядерного фактора. Кроме того, количественное рецепторов инициировал ядерную активацию ERK и Elk-1 был успешно достигнуты с помощью этого метода 16, используя соответствующие специфические антитела против этих молекул. Кроме того, чувствительность этого метода позволило выявить небольшие изменения в NF-kB ядерных уровней, в связи с дифференциальной стимуляции PMN различных типов интегринов (рис. 2), а также за счет фармакологического ингибирования Fc рецепторов по инициативе сигнальных путей 16 . Сочетание хорошей специфических антител и эффективное флуоресцентно-меченых вторичных антител обеспечивает большую чувствительность и позволяет для обнаружения небольших изменений в количестве ядерного фактора интереса внутри ядра. Это позволяет количественное сравнение уровней ядерного фактора до и после различных условиях стимуляции. Кроме того, этот метод может обнаружить в изолированных нюядер, практически любая молекула, против которого хорошо специфических антител доступно. Кроме того, часть иммунного может быть упрощено с помощью антител непосредственно помечены fluorochome, который в дополнение улучшить чувствительность. Наконец, метод представляет большую гибкость, потому что много различных fluorochomes могут быть использованы. Таким образом, этот метод может быть применен к различным сигнала исследования, которые связаны с изменением уровня белка в ядре.
В заключение отметим, что широкое применение и чувствительность метода, описанного в этой статье, поместите его в качестве простой и экономичный вариант для передачи сигнала исследований, которые включают изменения уровней белков в ядре различные типы клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Нэнси Мора за техническую помощь.
Эта работа финансировалась исследовательским грантам 48573-M и 168098 от Национального совета де Ciencia у Tecnologia, Мексика и грантов IN212308 и IN205311-2 от Direccion генерала де Asuntos дель Личные Academico, Национального автономного университета Мехико, Мексика.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
References
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
