Summary
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم. العدلات التي تمتلك وظائف ينظم transcriptionally مثل إنتاج السيتوكينات proinflammatory و تثبيط الخلايا. يمكن دراسة هذه الوظائف مع أسلوب المعروضة هنا، والذي يسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى التدفق الخلوي معزولة
Abstract
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم المحيطي. هذه الخلايا هي الأولى في الظهور في مواضع الالتهابات والعدوى، وبذلك أصبحت خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة. العدلات المضادة للجراثيم التي تمتلك وظائف هامة مثل البلعمة، وإطلاق سراح من الإنزيمات التحللي، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية. وبالإضافة إلى هذه المهام مهمة الدفاع، العدلات أداء مهام أخرى في الاستجابة للإصابة مثل إنتاج السيتوكينات proinflammatory و تثبيط الخلايا. السيتوكينات تجنيد الكريات البيض الأخرى التي تساعد مسح العدوى، وتثبيط الخلايا العدلة يسمح للعيش لفترة أطول في موقع العدوى. وينظم هذه الوظائف على مستوى النسخ. ومع ذلك، لأن العدلات هي خلايا قصيرة العمر، لا يمكن دراسة الاستجابات ينظم transcriptionally في هذه الخلايا أن يؤديها مع الطرق التقليدية الجينات مراسل حيث لا توجد ايفيآاف لتقنيات ترنسفكأيشن العدلات. هنا، نقدم طريقة بسيطة وفعالة تسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى معزولة وimmunolabeled بواسطة التدفق الخلوي. وصفنا تقنيات لعزل العدلات نقية من الدم المحيطي الإنسان، وتحفيز هذه الخلايا المضادة للمستقبلات الأجسام المضادة، وعزل نواة immunolabel، وتحليل التدفق الخلوي من قبل النوى. وقد استخدمت بنجاح الأسلوب للكشف عن NF-كيلوبايت وإلك-1 العوامل النووية في نوى من العدلات وأنواع الخلايا الأخرى. وبالتالي، هذا الأسلوب يمثل خيارا لتحليل تفعيل عوامل النسخ في النواة معزولة من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا.
Introduction
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم المحيطي 1. العدلات خلال الالتهاب والعدوى هي الخلايا الأولى لتظهر في موقع المتضررة حيث يكون بمثابة خط الدفاع الأول 2. العدلات تمتلك آليات عدة مضادات الميكروبات 3 بما البلعمة، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية، وإطلاق سراح من الإنزيمات التحللي بواسطة تحبب، وإنتاج السيتوكينات proinflammatory 4،5. العدلات هي خلايا قصيرة الأجل التي تحصل بسرعة من خلال تفعيل الإشارات من مختلف مستقبلات سطح الخلية. وعلى الرغم من اعتبار العدلات الخلايا الطرفية بسبب حياتهم القصيرة والخضوع لأنهم موت الخلايا المبرمج إلا إذا تفعيلها خلال عملية الالتهاب 6، فمن الواضح الآن أن يتمكنوا من تعديل النمط الظاهري أيضا عن طريق تغيير مستوى النسخ جينات معينة. إنتاج السيتوكينات (5) وتثبيط الخلايا نوعان من 7،8 طmportant وظائف الخلية التي تعتمد على تفعيل تنظيم على مستوى النسخ في العدلات. النووية كيلوبايت عامل (NF-كيلوبايت) تشارك في السيطرة النسخي من 4 وإنتاج السيتوكينات في تنظيم بقاء الخلية وموت الخلايا المبرمج في 9-11 أنواع الخلايا المختلفة.
يتم دراسة مسارات الإشارات عادة التي تؤدي إلى تنشيط العامل النووي من الجينات مراسل المقايسات أو عن طريق فحوصات الكهربي التحول التنقل (EMSA). ومع ذلك، لأن العدلات هي خلايا قصيرة العمر، لا يمكن دراسة الاستجابات ينظم transcriptionally في هذه الخلايا يتم تنفيذ المقايسات مع الجينات مراسل، حيث لا توجد تقنيات فعالة لترنسفكأيشن العدلات. وقد استخدمت المقايسات EMSA في العدلات لاستكشاف النووية تفعيل عامل 12،13، ولكن هذه المنهجية هي معقدة ومكلفة لأنه ينطوي على استخدام المواد المشعة. Nucleofection هو أسلوب آخر التي استخدمت ناجحهLLY لبالنقل حيدات 14. وهكذا، على الأقل من الناحية النظرية، يمكن أن الكشف عن تفعيل النووية عامل في العدلات من ترنسفكأيشن (على الرغم من انخفاض الكفاءة). ومع ذلك، فإن هذه التقنية أن تكون أكثر تكلفة، تستغرق وقتا طويلا وربما أقل كمية. ويمكن أيضا تحليل مجهري للخلايا immunostained أن تستخدم لكشف العوامل النووية في النواة. في الواقع، لقد اكتشفنا NF-كيلوبايت إزفاء إلى النواة بهذه الطريقة 15. للأسف، هذا الأسلوب هو أيضا تستغرق وقتا طويلا، كمية أقل، وتخضع للانحياز المراقب.
هنا، نقدم طريقة بسيطة وفعالة تسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى معزولة وimmunolabeled بواسطة التدفق الخلوي. وصفنا تقنيات لعزل العدلات من الدم المحيطي الإنسان، وتحفيز هذه الخلايا عن طريق integrins أو مستقبلات التيسير مع مستقبلات الأجسام المضادة المضادة لل، وعزل نواة immunolabel، وتحليل التدفق الخلوي من قبل النوى (Figure 1). وقد استخدمت بنجاح الأسلوب للكشف عن NF-15 و إلك كيلوبايت-1 16 العوامل النووية في نوى العدلات. حساسية هذا الأسلوب يسمح الكشف عن التغيرات الصغيرة في مستويات عامل النووي في النواة. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتحليل مستوى عوامل النسخ في النواة من أنواع الخلايا الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عزل العدلات (السوداء) من دم الإنسان
- استخدام حوالي 20 مل دم الإنسان مع الهيبارين (10 U / مل)، وتخثر. وقد تم جمع الدم من المتطوعين الأصحاء البالغين من venopuncture. وقد أجريت جميع التجارب في إطار موافقة لجنة الأخلاقيات البيولوجية في معهد لأبحاث Biomédicas دي - UNAM.
- وضع 2 مل من T500 ديكستران 6٪ في برنامج تلفزيوني في أنبوب 15 مل المخروطية الطرد المركزي وإضافة 10 مل من الدم. مزيج من أنبوب للقلب مرتين أو ثلاث مرات، والسماح لها الجلوس لمدة 45 دقيقة للسماح للترسيب كريات الدم الحمراء.
- في 15 مل أنبوب الطرد المركزي الطازجة المخروطية وضع 5 مل Ficoll-Paque.
- تأخذ البلازما الغنية الكريات البيض التي شكلت كرات الدم الحمراء أعلاه sedimented، وماصة بعناية على أعلى من Paque-Ficoll تشكيل طبقة ثانية. تأكد من عدم ومرحلتين.
- أجهزة الطرد المركزي في 516 x ج لمدة 20 دقيقة في C. ° 4 بعد الطرد المركزي، في الطور البيني من البلازما وFicoll Paque-هناك طبقة من الخلايا وحيدات النوى. شمال شرقutrophils هي في الجزء السفلي من الأنبوب.
- القضاء طاف، كسر بيليه الخلية من خلال الاستفادة من أنبوب ضد الرف، و resuspend الخلايا بإضافة 10 مل من البرد (4 ° C) PBS ملاحظة: Resuspending الخلايا عن طريق pipetting صعودا ونزولا غير مستحسن لأن هذا هو أيضا تضر الخلايا.
- نقل الخلايا إلى التعليق أنبوب 50 مل المخروطية الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي الى 290 XG لمدة 5 دقائق في C. ° 4
- كسر بيليه الخلية كما في السابق وإضافة 10 مل من البرد (4 ° C) حل ناقص التوتر (0.2٪ كلوريد الصوديوم، 1٪ BSA، و 20 ملي Hepes، ودرجة الحموضة = 7.4) لكرات الدم الحمراء ليز. مزيج من دوامات الأنبوب بلطف باليد لدقيقة واحدة بالضبط.
- إضافة 10 مل من البرد (4 ° C) حل مفرط التوتر (1.6٪ كلوريد الصوديوم، 1٪ BSA، و 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة = 7.4)، ومزيج عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات (عادة> 95٪ هي PMN).
ملاحظة: حافظ على أنبوب مع التعليق الخلية على الجليد بينما عد الخلايا. - أجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل و resuspend في 10 PMN7 خلية / مل في البرد (4 ° C) PBS. تبقي على الجليد.
ملاحظة: العدلات تبقى قابلة للحياة وظيفية في 4 درجات مئوية لمدة حوالي 6 إلى 8 ساعات.
2. تفعيل PMN
- وضع 100 ميكرولتر من التعليق PMN (1 × 10 7 خلية / مل) في أنبوب إيبندورف 1،5 مل.
ملاحظة: يجب أن يتم أنابيب العينات على الأقل في التكرارات. يجب أن تشمل الضوابط السلبية المعتادة الضد الأول فقط، والأجسام المضادة الثانوية فقط. - إضافة الأجسام المضادة مستقبلات المقابلة المضادة للإنتغرين أو المضادة وحيدة النسيلة FC-(ماب) في 10 ميكروغرام / مل واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- غسل PMN بإضافة 1 مل من البرد (4 ° C) PBS، الطرد المركزي في 1743 x ج (4،500 دورة في الدقيقة) في ميكروسنتريفوج، وطاف الشفط.
- كسر بيليه الخلية من خلال استغلال الجزء السفلي من أنبوب ضد الرف، إضافة 1 مل PBS الباردة، ويغسل مرتين أخريين كما في الخطوة السابقة.
ملاحظة: هذه الأجسام المضادة يغسل إزالة غير منضم. - إعادة تعليق PMN في نفسه (فيitial) حجم الدافئة (37 ° C) PBS تحتوي على 60 ميكروغرام / مل من F ('AB) 2 الماعز المضادة للمفتش الماوس.
ملاحظة: إن الأجسام المضادة الثانوية مفتش مكافحة الماوس سوف ربط الأجسام المضادة المضادة للمستقبلات الأولى وسوف يسبب يشابك من مستقبلات. - احتضان في C ° 37 لمدة 1 20 دقيقة، اعتمادا على عامل النووية المثيرة للاهتمام. لNF-كيلوبايت 15 دقيقة عادة، وعادة ما إلك-1 5 دقائق.
ملاحظة: احتضان الخلايا في 37 درجة C يحفز مستقبلات يشابك، والتي لا يمكن أن يتم في 4 درجات مئوية. - إضافة 1 مل PBS الباردة وأجهزة الطرد المركزي 3 دقائق في 1743 XG في ميكروسنتريفوج.
- إزالة طاف
- تجميد PMN فورا في حمام dry-ice/ethanol والاحتفاظ بها هناك لمدة 10 دقيقة.
3. العزلة وتثبيت نوى
- إعادة تعليق بيليه PMN المجمدة في 100 ميكرولتر الباردة (4 ° C) ناقص التوتر العازلة (HEPES 10 مم، 10 ملي بوكل، 1.5 ملم MgCl 2، و 1 ملم المضافة حديثا DL-dithiothreitol [DTT]؛ درجة الحموضة = 7.9). فمن المستحسن أن تتخذ أنابيب من حمام dry-ice/ethanol واحدا تلو الآخر، وامسحي الجزء السفلي من الأنبوب قبل إضافة العازلة ناقص التوتر.
- مكان على الجليد، والتحقق من سلامتها من تلطيخ نواة لقسامة من التعليق نوى مع الأزرق التريبان. نوى تبدو مستديرة والأزرق. لا PMN سليمة الحصول على الملون، والحطام الخلية يظهر الجسيمات الزرقاء شكل غير منتظم.
ملاحظة: إذا نوى التعليق يحتوي على خلايا سليمة أو العديد من الحطام، فمن الأفضل لتجاهل إعداد وكرر الإجراء مع عينة أخرى. - أجهزة الطرد المركزي في نوى XG 775 (3،000 دورة في الدقيقة) في ميكروسنتريفوج لمدة 10 دقيقة داخل غرفة باردة. في هذه المرحلة هي نواة ينبغي الحرص هشة للغاية وغير في الحفاظ على عينات الباردة وليس الطرد المركزي في قوات المفرطة.
- إزالة طاف بواسطة pipetting حذرين للغاية.
- إضافة 100 ميكرولتر من البرد بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لإصلاح النوى.
ملاحظة: بيليه هو فضفاض جدا علىد مضيفا المخزن المؤقت يكفي ل resuspend نواة. وينبغي تجنب pipetting صعودا وهبوطا. - احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
- Immunolabel نواة لالتدفق الخلوي أو الاحتفاظ بها لمدة تصل إلى 24 ساعة في 4 درجات مئوية.
4. Immunolabeling نواة لتحليل قياس التدفق الخلوي
- أجهزة الطرد المركزي في 1743 x ج النوى (4،500 دورة في الدقيقة) في ميكروسنتريفوج لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف بواسطة pipetting لطيف جدا.
- إضافة 100 ميكرولتر من البرد (4 ° C) 0.1٪ تريتون X-100، بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لpermeabilize نوى. احتضان في الثلج لمدة 10 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في 1743 نوى permeabilized XG في ميكروسنتريفوج وإزالة بعناية طاف. في هذه المرحلة نواة الكريات لا نعلق جيدا في الجزء السفلي من الأنبوب. فمن المستحسن أن أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى إذا كان بيليه يحصل فضفاضة.
- إعادة تعليق نوى في 500 ميكرولتر من الدم البارد الجنين 4٪ البقري (FBS) في برنامج تلفزيوني لحجب المواقع غير محدد ملزم، واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة. نبذنوى في 1743 x ج لمدة 3 دقائق في ميكروسنتريفوج وإزالة بعناية طاف.
- إعادة تعليق نوى في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة التي تحتوي على 4٪ FBS و 2.5 ميكروغرام / مل من ماب ضد العامل النووي في المصالح. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: يجب أن تشمل الضوابط السلبية المعتادة المناهضة للاسلحة النووية الأجسام المضادة العامل الوحيد، والتي تحمل علامات فقط FITC الضد الثانوية. - يغسل مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة مع FBS 4٪ والطرد المركزي في 1743 x ج لمدة 3 دقائق.
- إزالة طاف بعناية فائقة، نوى resuspend في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة التي تحتوي على 4٪ FBS و 10 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة التي تحمل علامات المقابلة FITC الثانوية، واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
- يغسل مرتين مع 500 نواة ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة مع FBS 4٪ كما في الخطوة السابقة.
- إعادة تعليق نوى في 400 ميكرولتر من البرد بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني.
يتم وضع النواة في بارافورمالدهيد للسماح ليتم تخزينها العينة لعدة أيام دون تلوث: مذكرةالمشاكل التي يمكن أن تحدث في وجود المصل. - تحليل التدفق الخلوي مباشرة أو تخزينها في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام.
5. تدفق الخلوي تحليل
- تحليل نوى immunolabeled في قياس التدفق الخلوي مثل هذا FACScan (بيكتون ديكنسون، فرانكلين البحيرات، NJ) أجهزة أو ما شابه ذلك.
- ضبط إعدادات اقتناء إلى: FSC في النطاق سجل في 10-1، SSC في النطاق سجل في 196، ونوى بوابة في مؤامرة دوت.
- الحصول على 10000 نواة لكل عينة.
- تحليل مضان FITC من الملطخة نوى من خلال قناة FL-1 (506 نانومتر) وضعت في النطاق سجل في 400.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
طريقة تنقية صفها هنا عادة ما يوفر العدلات unstimulated (السوداء) مع نقاء أكبر من 95٪ (الشكل 1A). ويمكن بعد ذلك أن PMN معزولة يحفزه مستقبلات خاصة يشابك مع الاجسام المضادة المحددة. حفزت مستقبلات نحن PMN من خلال التيسير وintegrins (1B الشكل). حفز مرة واحدة، وهي lysed PMN ويتم عزل نواة ذات العوائد المرتفعة. وimmunolabeled ثم نوى للعامل نووي خاص، مثل عامل كيلوبايت النووية (NF-كيلوبايت)، مع الاجسام المضادة المحددة (1B الشكل).
ويمكن التعرف عليه بسهولة كما نوى عدد سكانها مختلفة من PMN سليمة في قياس التدفق الخلوي مع مؤامرة دوت (الشكل 2A). في PMN يستريح تم العثور على المستوى القاعدي من NF-كيلوبايت في نواة الخلية (الشكل 2B). على التحفيز من قبل يشابك β1 integrins، وtranslocated NF-كيلوبايت إلى النواة وهذا increm تم الكشف عن والأنف والحنجرة في النووي NF-كيلوبايت كزيادة في مضان (الشكل 2B). وبالمثل، وتحفيز PMN بواسطة يشابك β2 integrins يسببها أيضا NF-كيلوبايت التنشيط كما أشارت إلى ذلك زيادة في مضان (الشكل 2C). حساسية هذا الأسلوب يسمح الكشف عن التغيرات الصغيرة في مستويات عامل النووية كما يتضح من حقيقة أن β1 integrins، التي تربط البروتينات المصفوفة خارج الخلية مثل تفعيل فبرونيكتين المستحث، NF-كيلوبايت أقوى من β2 integrins، التي ربط جزيئات الالتصاق على الخلايا الأخرى (قارن أرقام 2B 2C و).
كما تم استخدام هذا الأسلوب بنجاح للكشف عن NF-15 و إلك كيلوبايت-1 16 العوامل النووية في نوى معزولة بعد التحفيز مستقبلات Fc من PMN. هذه الطريقة بسيطة واقتصادية، وبالتالي يمكن بسهولة أن يتم تعديلها لتحليل العوامل النووية في أنواع الخلايا الأخرى.
محتوى "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
الشكل 1. يتم خلط التمثيل التخطيطي لتنقية (PMN) العدلات من الدم، وتحفيز الخلايا، عزل نواة، وimmunolabeling من العوامل النووية في نوى معزولة. A) الهيبارين المعالجة الدم مع ديكستران ليتراص الكريات الحمراء. بعد الرواسب الكريات الحمراء، الكريات البيض البلازما الغنية على رأس الخلايا الحمراء. يتم نقل هذه الكريات البيض البلازما الغنية والطبقات على رأس Ficoll-Paque في أنبوب آخر. بعد الطرد المركزي، تم العثور على طبقة من الخلايا وحيدات النوى (MNC) في الطور البيني من البلازما وFicoll Paque. تم العثور على PMN في الجزء السفلي من الأنبوب. B) يتم تحفيز متفرقة PMN بواسطة مستقبلات الخلايا غشاء يشابك مع الاجسام المضادة المحددة (ماب) (برتقالي) والأجسام المضادة الثانوية (الخضراء الداكنة). عامل النووية كابا B (NF-كيلوبايت) يفصل من IκB المانع وtranslocates في النواة. ثم يتم عزل النواة، وpermeabilized immunolabeled ضد NF-كيلوبايت أو عامل آخر النووية مع ماب محددة (الصفراء)، والأجسام المضادة التي تحمل علامات الثانوية FITC (ضوء أخضر). ويتم تحليل نواة ثابتة من التدفق الخلوي (FACS). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 2. تحليل NF-كيلوبايت في تفعيل العدلات (السوداء). A) PMN سليمة (اللوحة اليمنى) أو نوى معزولة (اللوحة اليمنى) تظهر اثنين من السكان واضحة في الرسوم البيانية تدفق الدوت مؤامرة الخلوي. ويمكن تحليل الخلايا ونواة بشكل مستقل من قبلإنشاء بوابات مختلفة، R1 (أحمر) لخلايا سليمة، وR2 (الأزرق) لنواة معزولة. B و C) أنوية معزولة عن PMN وimmunolabeled لNF-كيلوبايت (P50 الوحيدات)، قبل (خط متقطع الأخضر)، أو بعد الخلايا تم تفعيلها من خلال ربط عبر β1 integrins (B) مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ومحددة TS2/16 (الخط الأزرق)، أو β2 integrins (C) مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ومحددة IB4 (خط أحمر). المنطقة الرمادية هو مضان القاعدية من الأجسام المضادة الثانوية FITC التي تحمل علامات وحدها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة تنقية صفها هنا يسمح للعزل العدلات unstimulated (السوداء) مع نقاء أكبر من 95٪ (عن طريق الملاحظة المجهرية المقررة)، في وقت قصير. يمكن في بعض الأحيان أن تكون ملوثة من قبل العدلات الكريات الحمراء إذا لم يتم هذا الأخير هي lysed تماما. هذا لا يؤثر عادة هذه التقنية، يمكن بسهولة منذ الكريات الحمراء وPMN يمكن تمييزها عن السكان الخلية متميز من قبل التدفق الخلوي. ويمكن بعد ذلك أن PMN معزولة يحفزه مستقبلات خاصة يشابك مع الاجسام المضادة المحددة. في الواقع، يمكن أيضا أن تحفز PMN عن طريق الدوائية أو عن طريق الانضمام إلى مختلف ركائز أو خلايا أخرى. ويمكن استخدام أسلوب المقدمة هنا لتحليل مسارات الإشارات التي تؤدي إلى تغييرات من العوامل النووية في نوى بعد PMN يتم تنشيط الخلايا عن طريق أي حافز عمليا البيولوجية ذات الصلة.
مرة واحدة يتم تحفيز PMN، الطريقة الموضحة في هذه الورقة يسمح للسريعة وefficiتنقية الأنف والحنجرة من نوى وللكشف، في هذه نوى NF-كيلوبايت بواسطة المناعي وتحليل تدفق الخلوي. بعد التحفيز PMN من مستقبلات معينة، يتم تحريرها NF-كيلوبايت في السيتوبلازم من IκB المانع لها، ومن ثم إلى نواة traslocated (1B الشكل). وهكذا، يتم تحديد مستوى NF-كيلوبايت تفعيل بمقدار NF-كيلوبايت موجودة في النواة. لأن هذا الأسلوب يمكن الكشف عن وقياس كمية NF-كيلوبايت في النواة، فإنه يمكن بسهولة تحديد هذا العامل تفعيل النووية. يمكن الأسلوب بطريقة مشابهة كشف التنشيط من العوامل النووية الأخرى، عندما يرتبط تفعيلها للتغيرات في مستويات النووية. يمكن تفعيل التغييرات من العوامل النووية قد يعزى إلى تغيرات في كمية الوقت الحاضر عامل في النواة، كما هو الحال بالنسبة لNF كيلوبايت، أو تغييرات مثل الفسفرة، في التركيب الجزيئي لعامل، كما هو الحال بالنسبة لل إلك-1. ويمكن استخدام هذه الطريقة للكشف عن جhanges مستويات النووية من أي جزيء التي جسما مضادا محددا هو متاح.
هذه الطريقة تعطي السكان نواة نقية بطريقة بسيطة وسريعة. يتم تجميد الخلايا و lysed في العازلة ناقص التوتر التي تنفجر الخلايا مفتوحة ويترك نواة سليمة. PMN سليمة أو نوى معزولة عادة ما تظهر عن اثنين من السكان واضحة في الرسوم البيانية تدفق الدوت مؤامرة الخلوي. ويمكن تحليل الخلايا ونواة بشكل مستقل عن طريق إنشاء بوابات مختلفة لخلايا سليمة، ونوى معزولة. في عينة الخلية سليمة يتم إنشاء البوابة في جميع أنحاء المنطقة، حيث ان معظم الخلايا تظهر. وبالمثل، مع عينة نوى يتم إنشاء البوابة في جميع أنحاء المنطقة، حيث ان معظم النوى تظهر. عادة هذه البوابات هما في أماكن مختلفة من الرسم البياني الدوت المؤامرة. الجسيمات التي يتم الكشف عنها في بعض الأحيان للخروج من هذه البوابات، وعادة ما تكون الخلايا أو الحطام النوى، ويتركون من التحليل. إذا نوى الخلايا وبوابات تتداخل، وهذا يعني عادة أن إعداد نواة ليست كليو. تحليل هذا المستحضر النوى ليست مضمونة، وأنه من الأفضل لتكرار الإجراء مع مخازن الطازجة.
تم تطوير طريقة للعمل مع PMN الإنسان، ولكن كما تم تطبيقها بنجاح على خطوط الخلايا المختلفة المنشأ الكريات البيض 15. يمكن بسهولة أن تتكيف مع أسلوب عزل نواة من أنواع الخلايا المختلفة. من المهم أن تبدأ في الإجراء مع حد أدنى من 1 × 6 10 خلايا، للحصول على ما يكفي من نوى لتحليل تدفق الخلوي كفاءة. إذا تم الحصول على أعداد صغيرة من نوى في النهاية، فمن الأفضل أن تبدأ بشكل روتيني الأسلوب مع 3 X 6 10 خلايا.
خلال خطوة تحلل، لا ينبغي أن يسمح الخلايا المجمدة لذوبان الجليد. وهذا يؤدي إلى انخفاض المحصول بسبب تدهور الخلية. وبالتالي، فمن المستحسن أن تأخذ أنبوب واحد في وقت واحد للخروج من الحمام dry-ice/ethanol لليز الخلايا. أيضا، من المهم للقضاء تنظيف السطح الخارجي للأنبوب قبل إضافة تحلل ناقص التوترالعازلة. عندما لم يتم ذلك، المخزن المؤقت يتجمد أحيانا في الأنبوب، وهو ما يعطي تحلل الخلايا غير فعالة مما يؤدي إلى الاستعدادات ونوى أن تكون ملوثة من قبل خلايا سليمة. ومع ذلك، هذه ليست مشكلة خطيرة نظرا إلى أن في معظم الحالات يمكن فصل الخلايا سليمة ونوى من قبل التدفق الخلوي.
لأن نواة هشة جدا قبل الحصول على أنها ثابتة، فمن المهم أن يكون كل الحلول العازلة الباردة في C ° 4 من الاحتفاظ بها في الجليد. بعد الطرد المركزي، والكريات النوى هي فضفاضة في بعض الأحيان في الجزء السفلي من الأنبوب، ينبغي اتخاذ مزيد من الحذر حتى عند إزالة طاف. ويتم ذلك مع أفضل micropipette من الشفط مع. في بعض الأحيان، يمكن طرد الأنبوب مرة أخرى، ولكن قوات الطرد المركزي أوصى لا ينبغي أن يكون مفرط لأن هذا يضر نوى.
طريقة الكشف عن NF-كيلوبايت التنشيط باستخدام الاجسام المضادة المحددة لالوحيدات P50 (الشكل 2)، والمرضيا الوحيدات P65 15 من هذا العامل النووي. أيضا، تم أيضا التحديد الكمي للمستقبلات النووية بدأت التنشيط من ERK وإلك 1-تحقيقها بنجاح من خلال هذا الأسلوب 16، باستخدام الأجسام المضادة المقابلة محددة ضد هذه الجزيئات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن حساسية هذا الأسلوب يسمح للكشف تغييرات طفيفة في مستويات NF-كيلوبايت النووية، وذلك بسبب تحفيز الفرق من PMN من أنواع مختلفة من integrins (الشكل 2)، وأيضا بسبب تثبيط مستقبلات الدوائية لنادي بمبادرة من مسارات الإشارات 16 . مزيج من الأجسام المضادة محددة جيدة وفعالة الأجسام المضادة الثانوية fluorescently-صفت يوفر حساسية شديدة ويسمح للكشف عن تغييرات طفيفة في كمية العامل النووي داخل نواة الاهتمام. هذا يسمح مقارنة كمية من مستويات عامل النووية قبل وبعد التحفيز ظروف مختلفة. أيضا، يمكن الكشف عن هذا الأسلوب في نو معزولةclei، تقريبا أي جزيء ضد الأجسام المضادة التي سلعة معينة هو متاح. وعلاوة على ذلك، يمكن تبسيط جزء immunolabeling باستخدام الأجسام المضادة المسماة مباشرة مع fluorochome، والتي من شأنها تحسين وبالإضافة إلى ذلك حساسية. وأخيرا، يقدم أسلوب مرونة كبيرة لأنه يمكن استخدامها fluorochomes عديدة ومختلفة. وبالتالي، يمكن تطبيق هذه الطريقة لكثير من الدراسات المختلفة التي تنطوي على نقل الإشارة من التغييرات مستويات البروتين في النواة.
في الختام، تطبيق واسعة وحساسية الطريقة الموضحة في هذه الورقة، وضعه كخيار بسيطة واقتصادية لنقل الإشارة الدراسات التي تنطوي على تغييرات في مستويات البروتين في نواة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر نانسي مورا للحصول على المساعدة الفنية لها.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المنح البحثية 48573-M و168098 من المجلس الوطني دي بحوث والتكنولوجيا ذ Ciencia، والمكسيك، والمنح وIN212308 IN205311-2 من المديرية العامة للAsuntos ديل Academico الشخصية، الجامعة الوطنية المستقلة دي مكسيكو، المكسيك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
References
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
