Summary
I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue. Neutrofili possiedono funzioni trascrizionalmente regolate, quali la produzione di citochine pro-infiammatorie e l'inibizione di apoptosi. Queste funzioni possono essere studiati con il metodo presentato qui, che consente il rilevamento e la quantificazione dei fattori nucleari mediante citometria a flusso in nuclei isolati
Abstract
I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue periferico. Queste cellule sono i primi a comparire nei siti di infiammazione e infezione, diventando così la prima linea di difesa contro l'invasione dei microrganismi. Neutrofili possiedono importanti funzioni antimicrobici come fagocitosi, il rilascio di enzimi litici, e la produzione di specie reattive dell'ossigeno. Oltre a queste funzioni di difesa importanti, neutrofili svolgere altri compiti in risposta alle infezioni come la produzione di citochine proinfiammatorie e inibizione di apoptosi. Le citochine reclutare altri leucociti che aiutano a eliminare l'infezione, e l'inibizione di apoptosi dei neutrofili permette di vivere più a lungo nel sito di infezione. Queste funzioni sono regolate a livello di trascrizione. Tuttavia, poiché i neutrofili sono cellule di breve durata, lo studio delle risposte trascrizionalmente regolati in queste cellule non può essere eseguita con metodi convenzionali geni reporter in quanto non sono effitecniche cienti per la trasfezione dei neutrofili. Qui, presentiamo un metodo semplice ed efficace che permette la rilevazione e la quantificazione dei fattori nucleari in nuclei isolati e immunolabeled mediante citometria a flusso. Si descrivono tecniche per isolare neutrofili pure da sangue periferico umano, stimolare queste cellule con anticorpi anti-recettore, isolare e nuclei immunolabel, e analizzare nuclei mediante citometria a flusso. Il metodo è stato utilizzato con successo per rilevare NF-KB e Elk-1 fattori nucleari in nuclei di neutrofili e altri tipi di cellule. Pertanto, questo metodo rappresenta un'opzione per analizzare l'attivazione di fattori di trascrizione in nuclei isolati da una varietà di tipi cellulari.
Introduction
I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue periferico 1. Durante neutrofili infiammazione e l'infezione sono le prime cellule a comparire presso il sito interessato dove agiscono come prima linea di difesa 2. Neutrofili possiedono diversi meccanismi antimicrobici 3 tra cui la fagocitosi, la produzione di specie reattive dell'ossigeno, rilascio di enzimi litici di degranulazione, e la produzione di citochine proinfiammatorie 4,5. I neutrofili sono di breve durata cellule che vengono rapidamente attivati tramite segnalazione da vari recettori della superficie cellulare. Sebbene neutrofili sono state considerate cellule terminali a causa della loro breve vita e perché subiscono apoptosi meno attiva durante il processo infiammatorio 6, è chiaro che possono anche modificare il loro fenotipo cambiando il livello di trascrizione di geni specifici. La produzione di citochine 5 e l'inibizione dell'apoptosi 7,8 sono due importante attivazione-dipendente funzioni cellulari regolati a livello di trascrizione dei neutrofili. Fattore nucleare kB (NF-kB) partecipa al controllo trascrizionale del 4 citochine produzione e nella regolazione della sopravvivenza cellulare e apoptosi 9-11 in vari tipi di cellule.
Le vie di segnalazione che portano alla attivazione del fattore nucleare sono di solito studiati da saggi reporter gene o da saggi elettroforetici spostamento di mobilità (EMSA). Tuttavia, poiché i neutrofili sono cellule di breve durata, lo studio delle risposte trascrizionalmente regolati in queste cellule non possono essere eseguite con saggi reporter gene, poiché non ci sono tecniche efficienti per la transfezione neutrofili. Saggi EMSA sono stati utilizzati in neutrofili per esplorare l'attivazione del fattore nucleare 12,13, tuttavia, questa metodologia è complicato e costoso in quanto prevede l'utilizzo di materiale radioattivo. Nucleofection è un'altra tecnica che è stata utilizzata successfully per trasfettare monociti 14. Così, almeno in teoria, attivazione del fattore nucleare potrebbe essere rilevato in neutrofili di trasfezione (nonostante bassa efficienza). Tuttavia, questa tecnica sarebbe più costoso, richiede tempo e probabilmente meno quantitativa. Analisi microscopica delle cellule immunocolorate potrebbe anche essere utilizzato per rilevare fattori nucleari nel nucleo. Abbiamo infatti rilevato NF-kB traslocazione nel nucleo in questo modo 15. Sfortunatamente, questa tecnica è anche tempo, meno quantitativi, e soggetti a bias dell'osservatore.
Qui, presentiamo un metodo semplice ed efficace che permette la rilevazione e la quantificazione dei fattori nucleari in nuclei isolati e immunolabeled mediante citometria a flusso. Si descrivono tecniche per isolare neutrofili dal sangue periferico umano, stimolare queste cellule via integrine o recettori Fc con anticorpi anti-recettore, isolare e nuclei immunolabel, e analizzare nuclei mediante citometria a flusso (Figura 1). Il metodo è stato utilizzato con successo per rilevare NF-KB 15 e Elk-1 16 fattori nucleari nei nuclei dei neutrofili. La sensibilità di questo metodo consente la rilevazione di piccole variazioni di livelli di fattori nucleari nel nucleo. Questo metodo può anche essere usato per analizzare il livello di fattori di trascrizione in nuclei da altri tipi di cellule.
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Protocol
1. Isolamento dei neutrofili (PMN) dal sangue umano
- Usare circa 20 ml di sangue umano con eparina (10 U / ml) come anticoagulante. Il sangue è stato raccolto da volontari adulti sani venopuncture. Tutti gli esperimenti sono stati fatti in fase di approvazione del comitato di bioetica presso l'Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
- Mettere 2 ml di destrano al 6% T500 in PBS in una provetta da 15 ml conica per centrifuga e aggiungere 10 ml di sangue. Mescolare capovolgendo la provetta due o tre volte e lasciare riposare per 45 minuti per consentire la sedimentazione degli eritrociti.
- In una nuova provetta 15 ml conica per centrifuga mettere 5 ml di Ficoll-Paque.
- Prendere il plasma ricco di leucociti che formano sopra eritrociti sedimentati, e accuratamente pipettare sopra il Ficoll-Paque formare un secondo strato. Assicurarsi che non ci sono due fasi.
- Centrifugare a 516 xg per 20 min a 4 ° C. Dopo centrifugazione, all'interfase di plasma e Ficoll-Paque vi è uno strato di cellule mononucleate. Neutrophils sono al fondo della provetta.
- Eliminare il supernatante, il pellet di cellule rompere toccando il tubo contro un rack, e risospendere le cellule aggiungendo 10 ml di freddo (4 ° C) PBS Nota:. Risospensione delle cellule pipettando su e giù non è consigliabile poiché questo è troppo danni alle cellule.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 50 ml conica e centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Rompere il pellet cellulare come prima e aggiungere 10 ml di freddo (4 ° C) soluzione ipotonica (0,2% NaCl, 1% BSA, Hepes 20 mM, pH = 7,4) per lisare gli eritrociti. Mescolare agitando delicatamente il tubo a mano per un minuto esatto.
- Aggiungere 10 ml di freddo (4 ° C) soluzione ipertonica (1,6% NaCl, 1% BSA, HEPES 20 mM, pH = 7,4), mix e contare le cellule utilizzando un emocitometro (generalmente> 95% sono PMN).
Nota: Tenere il tubo con la sospensione cellulare sul ghiaccio mentre il conteggio delle cellule. - Centrifugare come prima e risospendere PMN alle 107 cellule / ml a freddo (4 ° C) PBS. Tenere su ghiaccio.
Nota: neutrofili rimangono vitali e funzionali a 4 ° C per circa 6-8 ore.
2. Attivazione di PMN
- Messo 100 pl di sospensione di PMN (1 x 10 7 cellule / ml) in una provetta Eppendorf da 1,5 ml.
Nota: Vial per campione deve essere fatto almeno in doppio. Usuali controlli negativi dovrebbe includere primo anticorpo solo, e solo anticorpo secondario. - Aggiungere il corrispondente anticorpo anti-recettore di integrina o anti-Fc monoclonale (mAb) a 10 pg / ml ed incubare su ghiaccio per 15 min.
- Lavare PMN aggiungendo 1 ml di freddo (4 ° C) PBS, centrifugazione a 1.743 xg (4.500 rpm) in una microcentrifuga, e l'aspirazione del supernatante.
- Rompere il pellet di cellule colpendo la parte inferiore del tubo contro un rack, aggiungere 1 ml di PBS freddo, e lavare due volte come nel passaggio precedente.
Nota: Questi lava rimozione dell'anticorpo non legato. - Risospendere in PMN stessa (initial) volume di caldo (37 ° C) PBS contenente 60 ug / ml di F (ab ') 2 di capra anti-IgG di topo.
Nota: Il secondario anti-topo IgG si legano al primo anticorpo anti-recettore e causerà reticolazione del recettore. - Incubare a 37 ° C per 1 a 20 minuti, a seconda del fattore nucleare di interesse. Per NF-kB in genere 15 min, e di solito Elk-1 5 min.
Nota: incubando le cellule a 37 ° C reticolazione recettore induce, che non può avvenire a 4 ° C. - Aggiungere 1 ml di PBS freddo e centrifugare 3 minuti a 1743 xg in microcentrifuga.
- Rimuovere il surnatante
- Congelare PMN immediatamente in bagno dry-ice/ethanol e tenerli lì per 10 min.
3. L'isolamento e la fissazione dei Nuclei
- Risospendere congelati PMN pellet in 100 ul a freddo (4 ° C) tampone ipotonico (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, e 1 mM appena aggiunto DL-ditiotreitolo [DTT], PH = 7,9). Si consiglia di adottare le provette dal bagno dry-ice/ethanol uno per uno, e per pulire il fondo della provetta prima di aggiungere il tampone ipotonico.
- Posto su ghiaccio, e verificare l'integrità dei nuclei dalla colorazione un'aliquota della sospensione nuclei con tripan blu. Nuclei guardarsi attorno e blu. PMN intatto non si macchiano, e detriti cellulari appare come particelle blu di forma irregolare.
Nota: Se la sospensione nuclei contiene molte cellule intatte o detriti, è meglio scartare la preparazione e ripetere la procedura con un altro campione. - Centrifugare a 775 xg nuclei (3.000 rpm) in microcentrifuga per 10 minuti all'interno di una cella frigorifera. A questo punto i nuclei sono molto fragili e la cura supplementare dovrebbe essere presa nel mantenere i campioni a freddo e non centrifugazione a una forza eccessiva.
- Rimuovere il surnatante pipettando molto attenti.
- Aggiungere 100 ml di freddo paraformaldeide 4% in PBS per fissare nuclei.
Nota: Il pellet è molto perdere unad aggiungendo il buffer è sufficiente per risospendere il nuclei. Pipettando su e giù dovrebbe essere evitato. - Incubare su ghiaccio per 20 min.
- Nuclei Immunolabel per citometria a flusso o tenerli per un massimo di 24 ore a 4 ° C.
4. Immunomarcatura Nuclei di Analisi Citometria a Flusso
- Centrifugare a 1743 xg nuclei (4.500 rpm) in microcentrifuga per 1 min, e rimuovere il surnatante pipettando molto delicato.
- Aggiungere 100 pl di freddo (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% paraformaldeide in PBS a permeabilize nuclei. Incubare in ghiaccio per 10 minuti.
- Centrifugare permeabilizzate nuclei a 1743 xg in microcentrifuga e rimuovere con attenzione il surnatante. A questo punto pellets nuclei non collegare bene al fondo della provetta. Si consiglia di centrifugare di nuovo se il pellet viene sciolto.
- Nuclei risospendere in 500 pl di freddo 4% di siero bovino fetale (FBS) in PBS per bloccare i siti di legame non specifici, e incubare in ghiaccio per 20 min. Centrifuganuclei a 1743 xg per 3 minuti in microcentrifuga e rimuovere con attenzione il surnatante.
- Risospendere nuclei in 100 pl di PBS contenente 4% FBS e 2,5 ug / ml di anticorpo monoclonale contro il fattore nucleare di interesse. Incubare su ghiaccio per 20 min.
Nota: usuali controlli negativi dovrebbe includere anticorpi anti-nucleo unico fattore, e FITC-anticorpo marcato secondaria. - Lavare due volte con 500 microlitri di PBS freddo con 4% FBS e centrifugazione a 1743 xg per 3 min.
- Rimuovere il surnatante molto attentamente, nuclei risospendere in 100 pl di PBS contenente 4% FBS e 10 ug / ml del corrispondente FITC-anticorpo secondario marcato, e incubare in ghiaccio per 20 min.
- Nuclei lavare due volte con 500 microlitri di PBS freddo con 4% FBS come nel passaggio precedente.
- Risospendere nuclei in 400 pl di freddo paraformaldeide 4% in PBS.
Nota: I nuclei sono collocati in paraformaldeide per permettere al campione di essere conservato per diversi giorni senza contaminazioneproblemi che possono verificarsi in presenza di siero. - Analizzare immediatamente mediante citometria di flusso o conservare al buio a 4 ° C per un massimo di tre giorni.
5. Citometria a Flusso di analisi
- Analizzare nuclei immunolabeled in un citofluorimetro un FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) dell'apparecchio o simili.
- Regolare le impostazioni di acquisizione per: FSC a scala logaritmica a 10-1, SSC a log-scala a 196, e nuclei porta in un dot-plot.
- Acquisire 10.000 nuclei per campione.
- Analizzare fluorescenza del FITC-tinto nuclei attraverso la FL-1 canale (506 nm) fissato a scala logaritmica a 400.
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Representative Results
Il metodo di purificazione qui descritta fornisce solito non stimolate neutrofili (PMN) con purezza superiore al 95% (Figura 1A). PMN isolato può essere stimolato da recettori reticolazione particolari con specifici anticorpi monoclonali. Abbiamo stimolato PMN attraverso recettori Fc e integrine (Figura 1B). Una volta stimolato, PMN vengono lisati e nuclei sono isolati con alte rese. Nuclei sono poi immunolabeled per un particolare fattore nucleare, come il fattore nucleare kB (NF-kB), con anticorpi specifici (Figura 1B).
I nuclei possono essere facilmente riconosciuto come una popolazione diversa da PMN intatto nel citofluorimetro con un dot-plot (Figura 2A). In PMN riposa un livello basale di NF-kB si trova nel nucleo della cellula (Figura 2B). Dopo stimolazione mediante reticolazione integrine β1, NF-kB è traslocata nel nucleo e questo Increm ent in nucleare NF-kB viene rilevato come un aumento di fluorescenza (Figura 2B). Analogamente, la stimolazione dei PMN mediante reticolazione β2 integrine indotta anche l'attivazione di NF-kB come indicato da un aumento della fluorescenza (Figura 2C). La sensibilità di questo metodo consente la rilevazione di piccole variazioni di livelli di fattori nucleari, come evidenziato dal fatto che β1 integrine, che legano proteine della matrice extracellulare come fibronectina, indotta forte attivazione di NF-KB di β2 integrine, che si legano a molecole di adesione su altre cellule (confronta figure 2B e 2C).
Questo metodo è stato utilizzato con successo per rilevare NF-KB e 15 Elk-1 16 fattori nucleari in nuclei isolati dopo stimolazione del recettore Fc di PMN. Questo metodo è semplice ed economico, quindi può essere facilmente modificato per analizzare fattori nucleari in altri tipi di cellule.
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Figura 1. Rappresentazione schematica di neutrofili (PMN) purificazione del sangue, la stimolazione di cellule, isolamento di nuclei, e immunomarcatura di fattori nucleari in nuclei isolati. A) eparina sangue trattato viene miscelato con destrano di agglutinare eritrociti. Dopo sedimento eritrociti, leucociti del plasma ricco è sopra i globuli rossi. Questo leucociti plasma ricco viene trasferito e sovrapposto su Ficoll-Paque in un altro tubo. Dopo centrifugazione, uno strato di cellule mononucleate (MNC) si trova all'interfase di plasma e Ficoll-Paque. PMN si trovano sul fondo della provetta. B) Isolato PMN vengono stimolati mediante reticolazione membrana cellulare con recettori specifici anticorpi monoclonali (mAb) (arancione) e un anticorpo secondario (verde scuro). Fattore nucleare kappa B (NF-kB) separa dal suo IkB inibitore e trasloca nel nucleo. Nuclei sono poi isolate, permeabilizzate e immunolabeled contro NF-kB o un altro fattore nucleare con una specifica mAb (giallo), ed un anticorpo secondario marcato con FITC (luce verde). Nuclei fisso vengono analizzati mediante citometria a flusso (FACS). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Analisi di attivazione di NF-kB in neutrofili (PMN). A) PMN intatto (pannello di sinistra) o nuclei isolati (pannello di destra) appaiono come due popolazioni distinte in citometria a flusso dot-plot grafici. Cellule e nuclei possono essere analizzati indipendentemente dalcreando varie porte, R1 (rosso) per cellule intatte, e R2 (blu) per nuclei isolati. B e C) Nuclei isolati da PMN stati immunolabeled per NF-kB (p50 subunità), prima (linea tratteggiata verde), o dopo che le cellule sono stati attivati mediante reticolazione β1 integrine (B) con l'anticorpo monoclonale specifico TS2/16 (linea blu), o β2 integrine (C) con l'anticorpo monoclonale specifico IB4 (linea rossa). L'area grigia è la fluorescenza basale dal anticorpo secondario marcato con FITC-alone.
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Discussion
Il metodo di purificazione descritto permette l'isolamento dei neutrofili non stimolati (PMN) con purezza superiore al 95% (valutata mediante osservazione al microscopio), in breve tempo. Talvolta neutrofili possono essere contaminati da eritrociti se questi non sono completamente lisati. Questo di solito non pregiudica la tecnica, gli eritrociti e PMN può essere facilmente distinto come distinte popolazioni cellulari mediante citometria a flusso. PMN isolato può essere stimolato da recettori reticolazione particolari con specifici anticorpi monoclonali. Infatti, PMN può anche essere stimolata con mezzi farmacologici o per adesione a vari substrati o altre cellule. Il metodo qui presentato può essere utilizzato per analizzare vie di segnalazione che portano a cambiamenti di fattori nucleari in nuclei PMN dopo le cellule sono attivati da praticamente qualsiasi stimolo rilevante biologica.
Una volta PMN vengono stimolati, il metodo descritto in questo articolo consente la rapida ed efficipurificazione ento dei nuclei e per l'individuazione, in questi nuclei di NF-kB con immunofluorescenza e citometria a flusso di analisi. Dopo stimolazione PMN di certi recettori, NF-KB nel citoplasma viene rilasciato dal suo IkB inibitore, e quindi traslocated nel nucleo (Figura 1B). Pertanto, il livello di attivazione di NF-kB è determinata dalla quantità di NF-kB presente nel nucleo. Poiché questo metodo può rilevare e misurare la quantità di NF-kB nel nucleo, si può facilmente determinare l'attivazione di questo fattore nucleare. Il metodo può analogamente rilevare l'attivazione di altri fattori nucleari, quando la loro attivazione è legata ai cambiamenti dei livelli nucleari. Attivando cambiamenti di fattori nucleari può essere dovuto a cambiamenti nella quantità di fattore presente nel nucleo, come è il caso per NF-kB, o cambiamenti come fosforilazione, nella struttura molecolare del fattore, come è il caso per Elk-1. Questo metodo può essere usato per rilevare cHanges di livelli nucleari di qualsiasi molecola per cui un anticorpo specifico è disponibile.
Questo metodo produce una popolazione pura nuclei in modo semplice e veloce. Le cellule vengono congelate e lisate in un buffer ipotonico che ha fatto esplodere le cellule aperte e lascia intatti i nuclei. PMN intatto o nuclei isolati di solito appaiono come due distinte popolazioni di citometria a flusso dot-plot grafici. Cellule e nuclei possono essere analizzati indipendentemente creando varie porte per cellule intatte, e per nuclei isolati. In un campione di cellule intatte un cancello viene creato attorno all'area in cui la maggior parte delle cellule appaiono. Analogamente, con un campione di nuclei un cancello viene creato attorno alla zona dove appaiono più nuclei. Normalmente questi due porte si trovano in diversi luoghi del dot-plot grafico. Particelle che sono talvolta rilevate su tali porte, sono solitamente cellule o detriti nuclei, e vengono lasciati fuori dell'analisi. Se le porte delle celle e si sovrappongono nuclei, in genere significa che la preparazione nuclei non è cleun. L'analisi di questa preparazione nuclei non è affidabile, ed è meglio ripetere la procedura con il buffer appena fatte.
Il metodo è stato sviluppato per funzionare con PMN umano, ma è anche stata applicata con successo a varie linee cellulari di origine leucocitaria 15. Il metodo può essere facilmente adattato per isolare nuclei da vari tipi di cellule. È importante iniziare la procedura con un minimo di 1 x 10 6 cellule, per ottenere nuclei sufficiente per un'analisi efficace citometria a flusso. Se un piccolo numero di nuclei sono ottenuti alla fine, è meglio iniziare il metodo di routine con 3 x 10 6 cellule.
Durante la fase di lisi, le cellule congelate non dovrebbe essere permesso di scongelare. Ciò si traduce in basso rendimento a causa della degradazione cellulare. Pertanto, si consiglia di prendere un tubo alla volta dal bagno dry-ice/ethanol per lisare le cellule. Inoltre, è importante per pulire l'esterno del tubo prima di aggiungere la lisi ipotonicabuffer. Quando ciò non viene fatto, il buffer a volte si blocca nel tubo, dando un inefficiente lisi cellulare e conseguente preparazioni nuclei che sono contaminati da cellule intatte. Ancora, questo non è un problema serio dato che nella maggior parte dei casi cellule intatte e nuclei possono essere separati mediante citometria a flusso.
Poiché i nuclei sono molto fragili prima di ottenere fisso, è importante avere tutte le soluzioni tampone fredda a 4 ° C, mantenendoli in ghiaccio. Dopo centrifugazione, il pellet nuclei sono talvolta sciolto al fondo del tubo, cura in modo ulteriore attenzione durante la rimozione del supernatante. Questo è meglio fare con una micropipetta che con aspirazione a vuoto. Occasionalmente, il tubo può essere centrifugato di nuovo, ma le forze centrifugazione raccomandate non deve essere eccessiva perché questo danneggia la nuclei.
Il metodo rileva l'attivazione di NF-kB con anticorpi specifici per la subunità p50 (Figura 2), e ALSo la subunità p65 15 di questo fattore nucleare. Inoltre, la quantificazione del recettore nucleare avviata l'attivazione di ERK e Elk-1 è stato inoltre realizzato con successo attraverso questo metodo 16, utilizzando i corrispondenti anticorpi specifici contro queste molecole. Inoltre, la sensibilità di questo metodo di rilevamento permesso di piccole variazioni di NF-KB livelli nucleari, grazie alla stimolazione differenziale di PMN da diversi tipi di integrine (Figura 2), e anche a causa dell'inibizione farmacologica del recettore Fc-avviato percorsi di segnalazione 16 . La combinazione di un anticorpo specifico bene e un efficiente anticorpo secondario marcato in fluorescenza fornisce grande sensibilità e permette la rilevazione di piccole variazioni nella quantità del fattore nucleare di interesse all'interno dei nuclei. Questo consente un confronto quantitativo dei livelli del fattore nucleare prima e dopo stimolazione condizioni diverse. Inoltre, questo metodo può rilevare in isolato nuCLEI, qualsiasi molecola contro cui un anticorpo specifico bene è disponibile. Inoltre, la parte immunomarcatura può essere semplificato utilizzando un anticorpo marcato direttamente con il fluorochome, che oltre a migliorare la sensibilità. Infine, il metodo presenta una grande flessibilità perché molti fluorochomes possono essere usati diversi. Così, questo metodo può essere applicato a molti diversi studi segnale di trasduzione che coinvolgono variazioni dei livelli di proteine nel nucleo.
In conclusione, l'ampia applicabilità e la sensibilità del metodo descritto in questo documento, posizionarlo come opzione semplice ed economica per studi di trasduzione del segnale che coinvolgono variazioni dei livelli di proteine nel nucleo di una varietà di tipi cellulari.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Nancy Mora per la sua assistenza tecnica.
Questo lavoro è stato finanziato da borse di ricerca 48573-M e 168.098 dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Messico, e da sovvenzioni IN212308 e IN205311-2 da Dirección General de Asuntos del Personale Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Messico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
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