Summary
Neutrofiler er de mest udbredte leukocytter i blodet. Neutrofiler besidder transkriptionelt regulerede funktioner, såsom produktion af proinflammatoriske cytokiner og inhibering af apoptose. Disse funktioner kan undersøges med fremgangsmåden præsenteret her, som muliggør påvisning og kvantificering af nukleare faktorer ved flowcytometri i isolerede kerner
Abstract
Neutrofiler er de mest udbredte leukocytter i perifert blod. Disse celler er de første til at blive vist på steder med inflammation og infektion, og blev dermed den første linje i forsvaret mod invaderende mikroorganismer. Neutrofiler har vigtige antimikrobielle funktioner såsom fagocytose, frigivelse af lytiske enzymer, og produktionen af reaktive oxygenspecies. Ud over disse vigtige forsvar funktioner, udfører neutrofiler andre opgaver som reaktion på infektion, såsom produktion af proinflammatoriske cytokiner og inhibering af apoptose. Cytokiner rekruttere andre leukocytter, der hjælper klare infektionen, og inhibering af apoptose tillader neutrofil at leve længere på stedet for infektion. Disse funktioner er reguleret på niveauet for transkription. Men da neutrofiler er kortlivede celler, kan studiet af transkriptionelt regulerede responser i disse celler ikke udføres med konventionelle reportergen metoder, da der ikke er nogen effektifaktor teknikker til neutrofil transfektion. Her præsenteres en simpel og effektiv fremgangsmåde, der tillader detektering og kvantificering af nukleare faktorer i isoleret og immunolabeled kerner ved flowcytometri. Vi beskriver teknikker til at isolere rene neutrofiler fra humant perifert blod, stimulere disse celler med anti-receptor-antistoffer, isolere og immunolabel kerner, og analysere kerner ved flowcytometri. Fremgangsmåden er med succes blevet anvendt til påvisning af NF-KB og Elk-1 nukleare faktorer i kerner fra neutrofiler og andre celletyper. Således er denne fremgangsmåde repræsenterer en indstilling til analyse af aktivering af transkriptionsfaktorer i isolerede kerner fra en række celletyper.
Introduction
Neutrofiler er de mest udbredte leukocytter i perifert blod 1. Under inflammation og infektion neutrofiler er de første celler til at vises på det angrebne sted, hvor de fungerer som den første linje i forsvaret 2. Neutrofiler har flere antimikrobielle mekanismer 3 herunder fagocytose, produktion af reaktive ilt arter, frigivelse af lytiske enzymer ved degranulering, og produktion af proinflammatoriske cytokiner 4,5. Neutrofiler er kortlivede celler, der bliver hurtigt aktiveres ved hjælp af signalering fra forskellige celleoverfladereceptorer. Selv neutrofiler er blevet overvejet terminale celler på grund af deres korte levetid og fordi de undergår apoptose, medmindre aktiveret under den inflammatoriske proces 6, er det nu klart, at de også kan ændre deres fænotype ved at ændre niveauet for transkription af bestemte gener. Produktion af cytokiner 5 og inhibering af apoptose 7,8 er to important aktivering-afhængige cellefunktioner reguleret på niveauet for transkription i neutrofiler. Nukleare faktor KB (NF-KB) deltager i transkriptionel kontrol af cytokinproduktion 4 og ved regulering af celleoverlevelse og apoptose 9-11 i forskellige celletyper.
De signalveje, der fører til kernefaktor aktivering sædvanligvis undersøgt ved reportergenassays eller ved elektroforetisk mobilitet shift assays (EMSA). Men da neutrofiler er kortlivede celler, kan studiet af transkriptionelt regulerede responser i disse celler ikke udføres med reportergenassays, da der ikke findes effektive teknikker til neutrofil transfektion. EMSA assays er blevet anvendt i neutrofiler til at udforske kernefaktor aktivering 12,13, men denne metode er kompliceret og dyr, fordi den involverer anvendelsen af radioaktive materialer. Nucleofection er en anden teknik, der har været anvendt successfully at transficere monocytter 14. I det mindste i teorien, kunne kernefaktor aktivering påvises i neutrofiler efter transfektion (trods lav effektivitet). Imidlertid vil denne teknik være dyrere, tidskrævende og sandsynligvis mindre kvantitativ. Mikroskopisk analyse af immunofarvede celler kunne også anvendes til påvisning af nukleare faktorer i kernen. Vi har faktisk opdaget NF-KB translokation til kernen på denne måde 15. Desværre er denne teknik er også tidskrævende, mindre kvantitativ, og med forbehold observatørens bias.
Her præsenteres en simpel og effektiv fremgangsmåde, der tillader detektering og kvantificering af nukleare faktorer i isoleret og immunolabeled kerner ved flowcytometri. Vi beskriver teknikker til isolering af neutrofiler fra humant perifert blod, stimulere disse celler via integriner eller Fc-receptorer med anti-receptor-antistoffer, isolere og immunolabel kerner, og analysere kerner ved hjælp af flowcytometri (Figur 1). Fremgangsmåden er med succes blevet anvendt til påvisning af NF-KB 15 og Elk-1 16 nukleare faktorer i neutrofil kerner. Følsomheden af denne fremgangsmåde tillader detektion af små ændringer i nukleare faktor niveauer i kernen. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til at analysere niveauet af transkriptionsfaktorer i kerner fra andre celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering af Neutrofiler (PMN) fra humant blod
- Brug 20 ml humant blod med heparin (10 U / ml) som antikoagulant. Blod blev indsamlet fra raske, voksne frivillige ved venopuncture. Alle forsøg blev udført under godkendelse af bioetiske komité ved Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
- Put 2 ml 6% dextran T500 i PBS i en 15 ml konisk centrifugeglas, og der tilsættes 10 ml blod. Bland ved at vende røret to eller tre gange og lad det sidde i 45 minutter for at tillade erytrocytsænkningshastighed.
- I en frisk 15 ml konisk centrifugerør sat 5 ml Ficoll-Paque.
- Tag leukocyt-rige plasma, der er dannet ovenfor sedimenterede erythrocyter, og omhyggeligt pipettere det oven på Ficoll-Paque dannelse af et andet lag. Sørg for, at der er to faser.
- Centrifuger ved 516 x g i 20 min ved 4 ° C. Efter centrifugering der ved interfasen af plasma-og Ficoll-Paque er et lag af mononukleære celler. Neutrophils er i bunden af røret.
- Eliminere supernatanten, bryde cellepelleten ved at banke på glasset mod en tandstang, og resuspender cellerne ved tilsætning af 10 ml af kold (4 ° C) PBS Note:. Resuspendering af cellerne ved at pipettere op og ned kan ikke anbefales, da det er for skadelig for cellerne.
- Overfør cellesuspension til en 50 ml konisk centrifugerør og centrifugeres ved 290 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
- Bryde cellepelleten som før, og der tilsættes 10 ml kold (4 ° C) hypotonisk opløsning (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) til lysering af erythrocytter. Bland ved at slynge røret forsigtigt i hånden i nøjagtigt ét minut.
- Der tilsættes 10 ml kold (4 ° C) hypertonisk opløsning (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), blandes og tæl cellerne med et hæmocytometer (sædvanligvis> 95% er PMN).
Bemærk: Hold røret med cellesuspensionen på is, mens tælling af cellerne. - Der centrifugeres som før og resuspender PMN ved 107 celler / ml i kold (4 ° C) PBS. Hold på is.
Bemærk: Neutrofiler forbliver levedygtige og funktionelle ved 4 ° C i ca 6-8 timer.
2. Aktivering PMN
- Sat 100 ul PMN-suspension (1 x 10 7 celler / ml) i et 1,5 ml Eppendorf-rør.
Bemærk: Prøverør skal gennemføres mindst som dubletter. Sædvanlige negative kontrol bør omfatte første antistof alene, og sekundært antistof alene. - Tilsæt tilsvarende anti-integrin eller anti-Fc-receptor-monoklonalt antistof (mAb) ved 10 ug / ml og inkuberes på is i 15 minutter.
- Vask PMN ved tilsætning af 1 ml kold (4 ° C) PBS, centrifugering ved 1743 x g (4500 rpm) i en mikrocentrifuge, og opsugning af supernatanten.
- Bryde cellepelleten ved at trykke på bunden af glasset mod en tandstang, der tilsættes 1 ml kold PBS, og vask to gange i forrige trin.
Bemærk: Disse vasker fjerne ubundet antistof. - Resuspender PMN i samme (iitial) volumen af varm (37 ° C) PBS indeholdende 60 ug / ml F (ab ') 2 ged anti-mus IgG.
Bemærk: Den sekundære anti-muse-IgG-antistof vil binde til det første anti-receptor-antistof og vil forårsage tværbinding af receptoren. - Inkuber ved 37 ° C i 1 til 20 minutter, afhængigt af den nukleære faktor af interesse. For NF-KB sædvanligvis 15 minutter til og Elk-1 sædvanligvis 5 min.
Bemærk: inkubering af cellerne ved 37 ° C inducerer receptor-tværbinding, som ikke kan finde sted ved 4 ° C. - Tilsæt 1 ml kold PBS og centrifuger 3 min ved 1.743 xg i mikrocentrifuge.
- Fjern supernatanten
- Frys PMN straks i dry-ice/ethanol bad og holde dem der i 10 min.
3. Isolering og Fiksering af Kerner
- Resuspender frosset PMN pellet i 100 pi kold (4 ° C) hypotonisk puffer (10 mM HEPES, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, og 1 mM frisk tilsat DL-dithiothreitol [DTT], PH = 7,9). Det anbefales at tage rørene ud af dry-ice/ethanol badet et efter et, og at tørre rengøre bunden af glasset før tilsætning af hypotonisk puffer.
- Anbring på is, og kontroller for kerner integritet ved at farve en portion af kerner suspension med trypanblåt. Kerner ser runde og blå. Intakt PMN ikke blive plettet, og celledebris vises som blå partikler med uregelmæssig form.
Bemærk: Hvis kerner suspension indeholder mange intakte celler eller rester, er det bedre at skille sig af forberedelsen og gentag proceduren med en anden prøve. - Centrifuger kerner ved 775 x g (3000 rpm) i mikrocentrifuge i 10 minutter i et koldt rum. På dette tidspunkt kerner er meget skrøbelig og ekstra pleje bør tages i at holde prøverne kolde og ikke centrifugering ved store kræfter.
- Fjern supernatanten ved meget forsigtig pipettering.
- Tilsæt 100 pi kold 4% paraformaldehyd i PBS at fastsætte kerner.
Bemærk: pellet er meget løs end tilsætning af buffer er tilstrækkelig til at resuspendere kernerne. Pipettering op og ned bør undgås. - Der inkuberes på is i 20 minutter.
- Immunolabel kerner til flowcytometri eller holde dem i op til 24 timer ved 4 ° C.
4. Nuclei Immunolabeling for flowcytometri-analyse
- Centrifuger kerner ved 1743 x g (4500 rpm) i mikrocentrifuge i 1 minut og fjern supernatanten ved meget forsigtig pipettering.
- Tilsæt 100 pi kold (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% paraformaldehyd i PBS for at permeabilisere kerner. Inkuber i is i 10 minutter.
- Centrifuge permeabiliseret kerner på 1.743 xg i mikrocentrifuge og fjern forsigtigt supernatanten. På dette tidspunkt kerner pellets ikke vedhæfte godt i bunden af røret. Det anbefales at centrifugere igen, hvis pelleten bliver løs.
- Resuspender kerner i 500 pi kold 4% kalvefosterserum (FBS) i PBS for at blokere nonspecifikke bindingssteder, og inkuberes på is i 20 minutter. Centrifugerkerner ved 1.743 xg i 3 min i mikrocentrifuge og fjern forsigtigt supernatanten.
- Resuspendere kerner i 100 pi kold PBS indeholdende 4% FBS og 2,5 ug / ml af mAb mod nukleære faktor af interesse. Der inkuberes på is i 20 minutter.
Bemærk: Sædvanlige negative kontrol bør omfatte anti-nukleare faktor-antistof alene, og FITC-mærket sekundært antistof alene. - Vaskes to gange med 500 pi kold PBS med 4% FBS og centrifugering ved 1743 x g i 3 minutter.
- Supernatanten fjernes omhyggeligt, resuspender kerner i 100 pi kold PBS indeholdende 4% FBS og 10 ug / ml af det tilsvarende FITC-mærket sekundært antistof, og inkuberes på is i 20 minutter.
- Vask kerner to gange med 500 pi kold PBS med 4% FBS som i forrige trin.
- Resuspendere kerner i 400 pi kold 4% paraformaldehyd i PBS.
Bemærk: Kernerne placeres i paraformaldehyd, så prøven, der skal opbevares i adskillige dage uden kontamineringproblemer, der kan forekomme i nærvær af serum. - Analyser straks ved flowcytometri eller butik i mørke ved 4 ° C i op til tre dage.
5. Flowcytometrianalyse
- Analysere immunolabeled kerner i et flowcytometer sådan FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) eller lignende apparat.
- Juster køb indstillinger til: FSC på log-skala på 10-1, SSC ved log-skala på 196, og gate kerner i en dot-plot.
- Erhverve 10 tusind kerner per prøve.
- Analyser fluorescens af FITC-farvede kerner gennem FL-1 kanal (506 nm) indstillet til log-skala ved 400.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oprensningen beskrevet her giver normalt ikke-stimulerede neutrofiler (PMN) med renhed på over 95% (figur 1A). Isolerede PMN kan derefter stimuleres ved tværbinding af bestemte receptorer med specifikke monoklonale antistoffer. Vi har stimuleret PMN via Fc-receptorer og integriner (figur 1B). Når stimuleres, er PMN lyseres og kerner er isoleret med høje udbytter. Kerner derefter immunolabeled for en bestemt nukleær faktor, såsom nukleare faktor KB (NF-KB), med specifikke antistoffer (figur 1B).
Kerner kan let genkendes som en anden population af intakte PMN i flowcytometer med et dot-plot (figur 2A). I hvilende PMN et basalt niveau af NF-KB findes i cellekernen (fig. 2B). Efter stimulering ved tværbinding β1-integriner, er NF-KB translokeres til kernen, og denne INKREM. ent i nuklear NF-KB detekteres som en stigning i fluorescens (figur 2B). Tilsvarende stimulering af PMN ved tværbinding β2-integriner ligeledes induceret NF-KB-aktivering som vist ved en stigning i fluorescens (figur 2C). Følsomheden af denne fremgangsmåde tillader detektion af små ændringer i nukleare faktor-niveauer som påvist ved det faktum, at β1-integriner, som binder ekstracellulære matrixproteiner, såsom fibronectin, inducerede stærkere NF-KB-aktivering end β2-integriner, som binder til adhæsionsmolekyler på andre celler (sammenlign figur 2B og 2C).
Denne fremgangsmåde er også med succes blevet anvendt til at påvise NF-KB 15 og Elk-1 16 nukleare faktorer i isolerede kerner efter Fc receptor stimulation af PMN. Denne metode er enkel og økonomisk, hvorved det kan let modificeres til at analysere nukleare faktorer i andre celletyper.
indhold "fo: keep-together.within-page =" altid ">
Figur 1. Skematisk fremstilling af neutrofil (PMN) oprensning fra blod, stimulering af celler, isolering af cellekerner, og immunolabeling af nukleare faktorer i isolerede kerner. A) heparinbehandlet blod blandes med dextran at agglutinere erytrocytter. Efter erythrocytter sediment, er det leukocyt-rige plasma ovenpå de røde blodlegemer. Dette leukocyt-rige plasma overføres og lagt ovenpå Ficoll-Paque i et andet rør. Efter centrifugering er et lag af mononukleære celler (MNC) findes på interfasen af plasma-og Ficoll-Paque. PMN findes i bunden af røret. B) isoleret PMN stimuleres ved tværbinding af celle-membranreceptorer med specifikke monoklonale antistoffer (mAb) (orange) og et sekundært antistof (mørkegrøn). Nukleær faktor kappa B (NF-KB) adskilles fra dets inhibitor IKB og translokerer ind i kernen. Kerner isoleres derefter, permeabiliseret og immunolabeled mod NF-KB, eller en anden nukleær faktor med en specifik mAb (gul), og et FITC-mærket sekundært antistof (lysegrøn). Fast kerner analyseres ved flowcytometri (FACS). Klik her for at se større figur .
Figur 2. Analyse af NF-KB-aktivering i neutrofiler (PMN). A) Intakt PMN (venstre panel) eller isolerede kerner (højre panel) fremtræder som to særskilte populationer i flowcytometri dot-plot grafer. Celler og kerner kan analyseres uafhængigt afskabe forskellige porte, R1 (rød) til intakte celler, og R2 (blå) for isolerede kerner. B og C) Kerner isoleret fra PMN blev immunolabeled for NF-KB (p50-underenhed), før (grøn stiplet linie), eller efter at cellerne blev aktiveret ved tværbinding β1 integriner (B) med det specifikke monoklonale antistof TS2/16 (blå linie), eller β2 integriner (C) med det specifikke monoklonale antistof IB4 (rød linje). Det grå område er den basale fluorescens fra FITC-mærket sekundært antistof alene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oprensningen her beskrevne fremgangsmåde tillader isolering af ikke-stimulerede neutrofiler (PMN) med renhed på over 95% (vurderet ved mikroskopisk observation), på kort tid. Sommetider neutrofiler kan være forurenet med erythrocyter hvis sidstnævnte ikke lyseres fuldstændigt. Dette påvirker normalt ikke teknikken, idet erythrocytter og PMN let kan skelnes som distinkte cellepopulationer ved flowcytometri. Isolerede PMN kan derefter stimuleres ved tværbinding af bestemte receptorer med specifikke monoklonale antistoffer. Faktisk kan PMN også stimuleres med farmakologiske midler eller ved adhæsion til forskellige substrater eller andre celler. Fremgangsmåden præsenteres her kan anvendes til at analysere signalveje, der fører til ændringer af nukleare faktorer i PMN-kerner efter cellerne aktiveres ved praktisk taget enhver relevant biologisk stimulus.
Når PMN stimuleres, fremgangsmåden beskrevet i dette dokument, giver mulighed for hurtig og efficient oprensning af kerner og til påvisning i disse kerner af NF-KB ved immunfluorescens og flowcytometri-analyse. Efter PMN stimulering af bestemte receptorer, der er NF-KB i cytoplasmaet frigjort fra sit inhibitor IKB og derefter traslocated ind i kernen (figur 1 B). Således er niveauet af NF-KB-aktivering bestemmes af mængden af NF-KB forekommer i kernen. Fordi denne fremgangsmåde kan detektere og måle mængden af NF-KB i kernen, kan det let bestemme aktiveringen af denne nukleare faktor. Fremgangsmåden kan på lignende måde detektere aktivering af andre nukleare faktorer, når deres aktivering er forbundet med ændringer i nukleare niveauer. Aktivering ændringer af nukleare faktorer kan skyldes ændringer i mængden af faktor til stede i kernen, som det er tilfældet med NF-kB eller ændringer, såsom phosphorylering, i molekylestrukturen af faktoren, som det er tilfældet for elk-1. Denne metode kan anvendes til påvisning cHerunder ændringer af nukleare niveauer af ethvert molekyle, for hvilket et specifikt antistof er tilgængelig.
Denne metode giver en ren kerner population på en enkel og hurtig måde. Celler fryses og lyseres i en hypotonisk puffer, der sprænge cellerne åbne og opretholder kerner. Intakt PMN eller isolerede kerner normalt vises som to forskellige populationer i flowcytometri dot-plot grafer. Celler og kerner kan analyseres uafhængigt ved at skabe forskellige porte for intakte celler, og isolerede kerner. I en intakt celle prøve en port er skabt omkring det område, hvor de fleste celler vises. Tilsvarende med et kerner prøve en port er skabt omkring det område, hvor de fleste kerner vises. Normalt disse to porte er placeret forskellige steder af dot-plot graf. Partikler, der undertiden påvises ud af disse porte, er normalt celle eller kerner debris, og de er medtaget i analysen. Hvis cellen og kerner porte overlapper hinanden, det betyder normalt, at kernerne præparatet ikke er cleet. Analyse af denne kerner præparat er ikke pålidelige, og det er bedre at gentage proceduren med frisk gjort buffere.
Metoden er udviklet til at arbejde med human PMN, men det er også blevet anvendt med succes til forskellige cellelinier af leukocyt oprindelse 15. Fremgangsmåden kan let tilpasses til isolering af kerner fra forskellige celletyper. Det er vigtigt at begynde proceduren med mindst 1 x 10 6 celler, for at opnå tilstrækkelig kerner for en effektiv flowcytometrianalyse. Hvis små antal af kerner er opnået ved slutningen, er det bedre at rutinemæssigt starter fremgangsmåden med 3 x 10 6 celler.
Under lysis skridt bør frosne celler ikke optøs. Dette resulterer i lavt udbytte på grund af celle-nedbrydning. Således anbefales det at tage et rør ad gangen ud af dry-ice/ethanol badet for at lysere cellerne. Ligeledes er det vigtigt at tørre rense ydersiden af røret før tilsætning af hypotonisk lyseringpuffer. Når dette ikke sker, pufferen undertiden fryser i røret, hvilket giver en ineffektiv cellelyse og resulterer i kerner præparater, der er forurenet af intakte celler. Still, er dette ikke et alvorligt problem, da det i de fleste tilfælde intakte celler og kerner kan separeres ved flowcytometri.
Fordi kerner er meget skrøbelige, før de får fast, er det vigtigt at have alle bufferopløsninger kold ved 4 ° C ved at holde dem i is. Efter centrifugering er kerner pellets undertiden løs i bunden af røret, så bør man passe på, ved fjernelse af supernatanten. Dette gøres bedre med en mikropipette end med vakuum aspiration. Den lejlighed, kan røret centrifugeres igen, men de anbefalede centrifugalkraft, bør ikke være for stor, da dette skader kernerne.
Fremgangsmåden detekteret NF-KB-aktivering under anvendelse af antistoffer der er specifikke for p50-underenheden (figur 2), og also p65 subunit 15 i denne nukleare faktor. Desuden blev kvantificering af receptor-initieret nuklear aktivering af ERK og Elk-1 også med succes opnås ved denne fremgangsmåde 16, anvendelse af de tilsvarende specifikke antistoffer mod disse molekyler. Derudover er følsomheden af denne metode kunne detektering af små ændringer i NF-KB nukleare niveauer på grund af forskellen stimulering af PMN med forskellige integriner (figur 2), og også på grund af farmakologisk inhibering af Fc-receptor-initieret signaleringsveje 16 . Kombinationen af et godt specifikt antistof og en effektiv fluorescens-mærket sekundært antistof giver stor følsomhed og tillader detektion af små ændringer i mængden af den nukleære faktor af interesse inde i nuclei. Dette tillader en kvantitativ sammenligning af niveauer af nukleær faktor før og efter forskellige stimulation betingelser. Desuden kan denne fremgangsmåde detektere i isoleret nowclei, praktisk taget ethvert molekyle, mod hvilken en god specifikt antistof er tilgængeligt. Endvidere kan immunolabeling del forenkles ved anvendelse af et antistof direkte mærket med fluorochome, som desuden forbedrer følsomhed. Endelig fremgangsmåden frembyder stor fleksibilitet, fordi mange forskellige fluorochomes kan anvendes. Således kan denne fremgangsmåde anvendes til mange forskellige signaltransduktion undersøgelser, der involverer ændringer i proteinniveauer i kernen.
Som konklusion den brede anvendelighed og følsomhed af fremgangsmåden beskrevet i dette dokument placeres som en enkel og økonomisk mulighed for signaltransduktions undersøgelser, der involverer ændringer i proteinniveauer i kernen af en række forskellige celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Nancy Mora for hendes teknisk bistand.
Dette arbejde blev finansieret af forskningsmidler 48.573-M og 168.098 fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Mexico, og af tilskud IN212308 og IN205311-2 fra Dirección General de asuntos del Personal Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Mexico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
References
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
